海南榴蓮疫霉果腐病病原分離與鑒定

摘要

筆者2024年6月在海南保亭三道鎮(zhèn)的榴蓮種植園發(fā)現(xiàn)一種造成榴蓮果實腐爛的病害，為明確該病害的病原，采用組織分離法對病原菌進行分離培養(yǎng)，利用形態(tài)學和分子生物學相結合的方法對分離菌株進行鑒定，并對分離菌株的致病性進行了測定。結果表明，引起海南榴蓮疫霉果腐病的病原菌是棕櫚疫霉Phytophthora palmivora，該菌接種健康榴蓮果實后，果實表現(xiàn)出與田間發(fā)病果實相同的癥狀。研究結果為該病害的防控提供了基礎。

關鍵詞

榴蓮; 果腐病; 棕櫚疫霉; 病原鑒定

中圖分類號：

S 436.67

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2024418

Isolation and identification of Phytophthora palmivora causing fruit rot on Durio zibethinus in Hainan province

XU Huan1，2， ZHANG Zheyu1，2， ZHOU Zhaoxi3， WANG Jiabao1*， CAO Xueren1*

（1. Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences; Key Laboratory

of Integrated Pest Management on Tropical Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Haikou 571101， China;

2. National Key Laboratory of Green Pesticide， Guizhou University， Guiyang 550025， China; 3. Tropical Crops

Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou 571101， China）

Abstract

In June 2024， a fruit rot disease affecting durian （Durio zibethinus Rumph. ex Murray） was observed in a plantation in Sandao town， Baoting county， Hainan province. To identify the causal agent， the pathogen was isolated using the tissue isolation method and identified based on morphological characteristics combined with molecular analyses. Pathogenicity tests were also conducted. The results indicated that Phytophthora palmivora was responsible for the fruit rot on durian. Inoculation of healthy fruits with the isolated pathogen reproduced symptoms consistent with those observed in the field. These results provide a basis for the development of management strategies for this disease.

Key words

Durio zibethinus; fruit rot; Phytophthora palmivora; pathogen identification

榴蓮Durio zibethinus Rumph. ex Murray 原產(chǎn)于馬來西亞，因其果實香氣濃烈、風味獨特，被譽為“萬果之王”。2019 年以來，隨著海南省引種榴蓮成功掛果，榴蓮種植產(chǎn)業(yè)開始快速發(fā)展，目前海南榴蓮種植面積超過2 000 hm2［1］，少數(shù)果園在2023年和2024年開始掛果。然而，病害是限制榴蓮生產(chǎn)的重要因素之一，榴蓮上已報道的病害主要有根腐病、莖潰瘍病、莖腐病、果腐病、葉枯病、葉斑病、炭疽病等［27］。

2024 年6月，筆者在海南省保亭縣三道鎮(zhèn)的一個果園（18.44°N，109.68°E）內發(fā)現(xiàn)一種造成榴蓮果實腐爛的病害，該果園今年首次掛果，園內病果率超過3%。國外已報道的，可引起榴蓮果實腐爛的病原菌包括棕櫚疫霉Phytophthora palmivora、齊整小核菌Sclerotium rolfsii、可可毛色二孢Lasiodiplodia theobromae、木賊鐮刀菌Fusarium equiseti、擬莖點屬Phomopsis sp.和炭疽菌屬Colletotrichum sp.等［2， 67］，而國內尚未見引起榴蓮果實腐爛的病原的報道。本研究對其病原菌進行了分離和鑒定，以期為病害的田間防控提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

發(fā)病的榴蓮果實采自海南保亭三道鎮(zhèn)的榴蓮園，分別從距離超過20 m的3株樹上各采集1個發(fā)病果實，致病性測定的果實為市場上購買的健康榴蓮果實，品種為‘金枕’。

1.2 病原菌分離

采用常規(guī)組織分離法進行病原菌分離，將病健交界處的榴蓮內果皮切割成小塊（約4 mm×4 mm），用75%乙醇消毒30 s，再用無菌水清洗2～3次，放于無菌濾紙上晾干表面水分后接種至PDA培養(yǎng)基上，于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待長出菌落后通過挑取菌絲尖端方法獲得純化菌株。

1.3 菌株的致病性測定

采用刺傷［7］和非刺傷方式對榴蓮果實進行致病性測定。將健康的榴蓮果實用0.5%的次氯酸鈉表面消毒3 min后，再用無菌水沖洗3次，晾干。刺傷接種：用直徑5 mm的滅菌打孔器在榴蓮果實上制造一個深度為5 mm的傷口，在傷口處加入100 μL在V8培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d的孢子囊懸浮液（在顯微鏡下用血球計數(shù)板調整濃度為105個/mL），非刺傷接種：將孢子囊懸浮液直接接種到未刺傷的榴蓮果實表面，以接種無菌水的榴蓮果實為對照。將接種后的榴蓮放入鋪有濕潤雙層衛(wèi)生紙的塑料盒（長寬高分別為45、39 cm和28 cm）中，蓋好蓋子后置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光周期L∥D=12 h∥12 h，每天觀察并記錄榴蓮果實發(fā)病情況。每個菌株接種果實3個，整個接種試驗重復2次。出現(xiàn)癥狀后，從病斑處重新取樣分離并純化，進行柯赫氏法則驗證。

1.4 病原菌的形態(tài)學鑒定

將純化的菌株分別接種到PDA和10%的V8培養(yǎng)基上，置于25℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，5 d后測量菌落直徑，拍照并記錄菌落形態(tài)特征。在顯微鏡下觀察V8培養(yǎng)基上的孢子囊及厚垣孢子形態(tài)并測量大小，孢子囊及厚垣孢子各測30個。

1.5 病原菌的分子鑒定

利用真菌基因組DNA抽提試劑盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］提取病原菌DNA，采用引物（表1）PCR擴增其ITS、TUB、EF1α和COXⅠ序列。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并純化后，送生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定。將獲得的序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，下載相關序列后用MEGA軟件進行單基因序列的剪切與對齊，將序列依據(jù)ITSTUBEF1αCOXⅠ的順序拼接。使用MrModeltest v. 2.3軟件確定每個基因的核苷酸替代的最佳模型（ITS和COXⅠ的最佳模型為GTR+G，TUB和EF1α的最佳模型為GTR+I+G），然后用MrBayes v. 3.2.6軟件進行貝葉斯法分析［8］，以馬爾可夫鏈蒙特卡洛算法（Markov Chain Monte Carlo， MCMC）進行100萬代運算，每1 000 代取樣1次，直至分裂頻率平均標準差（average standard deviation of split frequencies）低于0.01 停止運行。舍棄前25%生成的樹，剩余的樹用來計算貝葉斯后驗概率（posterior probabilities， PP），最后得到最佳樹。建樹結果使用Fig tree查看。

2 結果與分析

2.1 病害癥狀及致病性測定

發(fā)病榴蓮果實果皮表面有棕色斑點，之后棕色病斑迅速擴展，連成一片，表面長出白色霉層（圖1a）。從3個發(fā)病果實上分離到了3株（HNLL286、HNLL287和HNLL288）白色、呈絨毛狀、表型一致的分離物。分離物刺傷接種榴蓮果實4 d后開始表現(xiàn)癥狀，而非刺傷接種7 d后才開始表現(xiàn)癥狀。接種部位初期水漬狀，而后擴展成濕腐狀，接種點附近長出白色霉層并連成一片，與田間榴蓮疫霉果腐病相似（圖1b， d）。而接種無菌水的對照沒有發(fā)?。▓D1c， e）。通過對接種發(fā)病的病果進行病菌再分離培養(yǎng)，得到了與原接種病菌菌落形態(tài)一致的分離物，完成柯赫氏法則驗證，由此確定該分離菌株與原接種菌株一致。

2.2 病原菌形態(tài)特征

菌株HNLL286、HNLL287和HNLL288在PDA上生長緩慢，5 d后菌落直徑為30.1～30.5 mm，菌落近圓形，白色，氣生菌絲較發(fā)達（圖2a）。菌株在

10% V8培養(yǎng)基上生長速度快，5 d后直徑達84.2～85.4 mm，菌落呈花瓣狀，邊緣較整齊，氣生菌絲不發(fā)達（圖2b）。菌絲無色透明、無隔膜（圖2c）。孢子囊梨形或卵形，少數(shù)橢圓形，大小為（46.3～79.4） μm×（23.8～48.2） μm，孢子囊乳突明顯，易脫落（圖2d， e）。厚垣孢子頂生，球形，直徑26.9～41.7 μm，可大量產(chǎn)生（圖2f， g）。據(jù)此，初步判定菌株HNLL286、HNLL287和HNLL288屬于疫霉屬Phytophthora sp.。

2.3 病原菌分子鑒定

將菌株HNLL286、HNLL287和HNLL288的ITS、TUB、EF1α和COX Ⅰ基因片段序列提交至 GenBank，獲得的登錄號分別為HNLL286（PQ163867、PQ166214、PQ166215 和PQ164589）、HNLL287（PQ282500、PQ287292、PQ287294、PQ287296）、HNLL288（PQ282501、PQ287293、PQ287295、PQ287297）。將其與NCBI上其他Phytophthora屬菌株的單基因片段分別進行比對、剪切與對齊后，以Pythium vexans STEU6724菌株為外群，將4個片段拼接后構建系統(tǒng)發(fā)育樹。包括比對產(chǎn)生的空缺在內有3 481個位點（ITS： 865; TUB： 961; EF1α： 940; COX Ⅰ： 715）。從系統(tǒng)發(fā)育樹來看，HNLL286、HNLL287和HNLL288等3個菌株與Phytophthora palmivora聚在同一支上，后驗概率值為1（圖3）。

3 結論與討論

棕櫚疫霉P.palmivora是國外榴蓮上的一種重要病原菌，可以為害榴蓮的根、莖、葉和果實［2］，我國多次在進口榴蓮果實上也分離到了該菌［1213］，最近在海南發(fā)現(xiàn)了由該菌引起的榴蓮根腐?。?］。而本研究通過形態(tài)學、分子生物學和致病力測定，首次報道了該菌可以引起海南榴蓮果腐病。

棕櫚疫霉是一種寄主廣泛的致病性真菌，在熱帶作物上，除了榴蓮外，橡膠樹、菠蘿、番木瓜、木薯、油梨、澳洲石斛等作物上均有該菌危害的報道［1419］。榴蓮近幾年才在海南開始種植，其前茬作物基本上都是橡膠樹，而棕櫚疫霉在海南橡膠樹上也有報道。

另外我國榴蓮種苗最開始都是由國外引進，棕櫚疫霉在國外榴蓮上發(fā)生普遍且嚴重，因此引起海南保亭榴蓮果腐的棕櫚疫霉是來自于橡膠樹還是國外引進的種苗需要進一步研究。

鑒于P.palmivora是國外榴蓮生產(chǎn)上危害最嚴重的病原菌，加上海南高溫高濕的環(huán)境條件非常有利于P.palmivora的發(fā)生和擴散，需要加強對此病害的監(jiān)測和防控技術的研發(fā)，另外由于種植效益好，海南榴蓮的種植面積還會進一步擴大，因此還需要加強對榴蓮種苗調運的管理，從而確保海南榴蓮產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

參考文獻

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聯(lián)合形態(tài)特征和分子鑒定結果，將引起海南榴蓮疫霉果腐病的病原菌確定為棕櫚疫霉P.palmivora。