甘肅省多序巖黃芪孢囊線蟲病病原鑒定

摘要

為明確甘肅省隴南市特色中藥材多序巖黃芪Hedysarum polybotrys孢囊線蟲病的病原種類，通過形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對其進行鑒定，采用室內(nèi)人工接種的方法觀察其生活史并測定對多序巖黃芪的致病性。結(jié)果表明，該線蟲的孢囊闊檸檬形，雙半膜孔，下橋發(fā)達，群體形態(tài)測量值與大豆孢囊線蟲Heterodera glycines基本一致;該種群rDNAITS序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的大豆孢囊線蟲相似性為99.8%，與序列號為HM560787的大豆孢囊線蟲聚在一起，置信度為99%。28SrDNA D2/D3序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的大豆孢囊線蟲相似性為100.00%，與序列號為GU595446的大豆孢囊線蟲聚在一起，置信度為100%。因此，形態(tài)學(xué)特征結(jié)合rDNAITS和28SrDNA D2/D3序列，將多序巖黃芪孢囊線蟲病病原鑒定為大豆孢囊線蟲。接種該線蟲后的多序巖黃芪植株發(fā)育不良，瘦弱矮小;25℃下，接種24 d根部開始出現(xiàn)白雌蟲，并在30 d產(chǎn)生大量白雌蟲，該世代基本完成，33 d后形成孢囊。綜上所述，甘肅省隴南市寄生多序巖黃芪的孢囊線蟲種類為大豆孢囊線蟲，該線蟲可侵染多序巖黃芪并完成生活史，對隴南市優(yōu)勢特色中藥材多序巖黃芪的生產(chǎn)構(gòu)成威脅。

關(guān)鍵詞

甘肅; 多序巖黃芪; 大豆孢囊線蟲; rDNAITS; 28S rDNA D2/D3

中圖分類號：

S 435.672

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2024491

Identification of the cyst nematode pathogen on Hedysarum polybotrys

in Gansu province

XING Xiaofang1， HU Jihui1， ZHOU Chen1， LUO Ning1， LIU Bianbian1， GUO Wei1，LIU Yonggang2， LI Huixia1*

（1. College of Plant Protection， Gansu Agricultural University， Gansu Provincial Engineering Laboratory for

Biocontrol of Crop Diseases and Pests， Lanzhou 730070， China; 2. Institute of Plant Protection，

Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou 730070， China）

Abstract

To identify the cyst nematode species infecting the medicinal plant Hedysarum polybotrys in Longnan city， Gansu province， a combined morphological and molecular approach was employed. The nematode’s life cycle and pathogenicity on H.polybotrys were evaluated through artificial inoculation under laboratory conditions. The results showed that the cysts were broad lemonshaped with ambifenestrate fenestrae and welldeveloped underbridges. The morphological measurements were basically consistent with those of Heterodera glycines. The rDNAITS sequence of the population shared 99.8% identity with H.glycines in the NCBI database and clustered with accession HM560787 （bootstrap： 99%）. The 28S rDNA D2/D3 region showed 100% identity with H.glycines （GU595446， bootstrap： 100%）. Thus， based on morphological characteristics and molecular evidence （ITS and D2/D3 sequences）， the nematode was identified as H.glycines. Infected H.polybotrys plants exhibited stunted and weakened growth. At 25℃， white females first appeared on the roots 24 days postinoculation， with numerous white females observed at 30 days， indicating completion of one generation. Cysts formed 33 days postinoculation. These findings confirm that H.glycines is capable of infecting H.polybotrys and completing its life cycle， posing a potential threat to the production of this valuable medicinal crop in Longnan city.

Key words

Gansu; Hedysarum polybotrys; Heterodera glycines; rDNAITS; 28S rDNA D2/D3

紅芪 Hedysari Radix為豆科Leguminosae多年生草本植物多序巖黃芪Hedysarum polybotrys的干燥根，作為道地藥材，主要分布于甘肅省六盤山、隴南山地和川西北地區(qū)，形成了以武都、宕昌為中心產(chǎn)區(qū)，向四周不斷擴散引種的栽培趨勢。紅芪具有補氣升陽、利尿止汗、消腫排膿斂瘡的功效。由于紅芪還具有較好的降血糖和免疫調(diào)節(jié)的作用，使用量及市場需求量較大，具有很高的經(jīng)濟價值［1］。多序巖黃芪根系發(fā)達，喜冷涼，有較強的抗旱、耐寒能力。除開花及主根生長期外，對氣候條件要求不嚴格，適生氣候范圍較廣［2］。近年來，種植戶為追求經(jīng)濟效益而盲目引種播種，缺乏科學(xué)指導(dǎo)，忽視了多序巖黃芪的生態(tài)適宜性，在種植過程中化肥的過量施用及不規(guī)范的田間管理，導(dǎo)致其根部細瘦短小，病蟲害增多，嚴重影響紅芪的質(zhì)量及療效［3］。

孢囊線蟲是異皮科Heteroderidae，異皮亞科Heteroderinae線蟲的統(tǒng)稱，是一類寄主種類多、適應(yīng)能力強、分布范圍廣和進行固著性內(nèi)寄生的植物線蟲［4］，可危害小麥、水稻、馬鈴薯和大豆等作物。孢囊線蟲中最具有經(jīng)濟重要性的種類多隸屬于孢囊線蟲屬Heterodera和球孢囊線蟲屬Globodera。危害嚴重的種類包括大豆孢囊線蟲Heterodera glycines、禾谷孢囊線蟲H.avenae和馬鈴薯金線蟲Globodera rostochiensis［5］等。

本課題組于2023年12月對甘肅省隴南市安化鎮(zhèn)多序巖黃芪病害進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)其根系上須根明顯增多，且出現(xiàn)大量白雌蟲，初步判定為孢囊線蟲病。鑒于孢囊線蟲病對多序巖黃芪品質(zhì)和產(chǎn)量可能存在潛在威脅，故對病原種類進行鑒定，明確優(yōu)勢種，對防治多序巖黃芪孢囊線蟲病具有重要意義。本試驗采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)結(jié)合的方法，對孢囊線蟲進行種類鑒定和致病性測定，以期為進一步制定相應(yīng)防控對策提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 孢囊線蟲的采集和分離

1.1.1 樣品采集

在甘肅省隴南市武都區(qū)安化鎮(zhèn)甘樹灣村（33°30′E，105°04′N）多序巖黃芪種植田，采集發(fā)病植株及其根際土壤樣本，裝入自封袋并記錄相關(guān)采集信息，將樣品帶回實驗室分離。

1.1.2 樣品分離

根部雌蟲采用直接挑取法分離，土壤中的孢囊采用簡易漂浮法分離［67］。將土樣風(fēng)干并充分混勻后隨機稱取100 g放入水桶，加水?dāng)嚢杈鶆?，靜置2～3 min，然后將上層懸浮液依次倒入20目和80目濾網(wǎng)過篩。重復(fù)3次，沖洗20目篩上的剩余物，盡可能使孢囊全部沖至80目篩網(wǎng)中，用水輕輕沖洗80目上的剩余物，待過篩水流澄清時沖洗80目網(wǎng)篩上的分離物至尼龍紗上，在體式顯微鏡（奧林巴斯，東京，日本）下挑取并統(tǒng)計孢囊數(shù)，將挑取的孢囊置于4℃保存?zhèn)溆茫?］。

1.2 孢囊線蟲形態(tài)學(xué)觀察

2齡幼蟲玻片標本制作：2齡幼蟲熱殺死后，在TAF溶液中固定，然后用Seinhorst法進行脫水［9］，蠟圈法制成永久玻片以備形態(tài)測量和觀察。

孢囊陰門錐玻片制作參照張譯文等［10］方法：將飽滿的孢囊置于盛有無菌水的玻片上，切開尾部后端1/4處并進行修整，用小毛刷仔細清除孢囊內(nèi)的雜質(zhì)，然后將修整好的陰門錐置于40%過氧化氫中漂白3 min，再依次轉(zhuǎn)入70%、95%、100%乙醇中脫水，最后移入丁香油中透明，透明后將其移至載玻片上觀察、拍照。

形態(tài)測量和拍照：將制作好的玻片標本在光學(xué)顯微鏡（蔡司，耶拿，德國）和體視顯微鏡（奧林巴斯，東京，日本）下，觀察形態(tài)特征，測量20條并拍照。

1.3 孢囊線蟲分子生物學(xué)鑒定

1.3.1 線蟲DNA提取

參照李文豪等［11］的方法略作改進，將單條2齡幼蟲用無菌水清洗后，轉(zhuǎn)移至含線蟲裂解液（9 μL ddH2O和1 μL 10×PCR buffer）的PCR管中，置于液氮中快速冷凍1 min，85℃加熱2 min，整個操作重復(fù)3次，再加入1 μL蛋白酶K，短暫離心。于PCR儀中65℃溫育1 h，使蛋白酶K降解蛋白質(zhì)以釋放DNA，接著95℃滅活10 min，取DNA上清液于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR擴增及擴增產(chǎn)物的克隆與測序

參照羅寧等［12］的方法進行PCR擴增，擴增片段區(qū)域為rDNAITS和28SrDNA D2/D3區(qū)。rDNAITS所用引物為TW81（5′GTTTCCGTAGGTGAACCTGC3′）和AB28（5′ATATGC

TTAAGTTCAGCGGGT3′）［12］;28SrDNA D2/D3區(qū)所用引物為D2A（5′ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG3′）和D3B（5′TCGGAAGGAACCAGCTACTA3′）［13］。rDNAITS和28SrDNA D2/D3區(qū)PCR擴增程序一致：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，34個循環(huán)；72℃延伸10 min。

擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用DNA凝膠回收試劑盒（諾唯贊）回收?；厥债a(chǎn)物與pMD19T載體連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。挑取一定數(shù)量的單克隆，分別置于含60 μg/mL Amp的LB培養(yǎng)液

中，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)14 h，進行菌液PCR，將菌液PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序［14］。

1.3.3 序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析

將獲得的序列進行BLAST比對后提交至GenBank，獲得登錄號。同時下載近似種序列，利用MAFFT進行序列比對后，使用軟件Gblock 0.91b選擇序列保守區(qū)域，使用AIC在MrModeltest version 2.3運行最佳模型，將其導(dǎo)入MrBayes構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并用FigTree 1.4.3查看并修正［15］。

1.4 孢囊線蟲對多序巖黃芪的致病性測定

將多序巖黃芪苗種在盛有滅菌基質(zhì)（沃土與蛭石按1∶1混合）的花盆中，每盆2株，共播種14盆。對紅芪的孢囊線蟲純化并擴繁后，用橡膠塞將消毒的孢囊輕輕碾碎，同時用無菌水沖洗使卵充分釋放后，收集于15 cm滅菌培養(yǎng)皿中，于28℃培養(yǎng)箱中孵化。待多序巖黃芪株高15～20 cm后，選擇長勢一致的健康植株，將500條/mL新孵2齡幼蟲懸浮液接種于根際，每盆6 mL，共接種12盆，其余2盆作為空白對照，于25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每3 d觀察1次，每次隨機選取2株，對多序巖黃芪根系進行次氯酸鈉酸性品紅染色，觀察根內(nèi)線蟲的侵染和發(fā)育情況［16］。

2 結(jié)果與分析

2.1 癥狀表現(xiàn)

受孢囊線蟲侵染的多序巖黃芪表現(xiàn)為病株長勢弱，生長不良，根部主根不發(fā)達，須根增多，根上有許多白色至淡黃色小顆粒，即為孢囊線蟲的雌蟲（圖1a，b）。經(jīng)統(tǒng)計，田間多序巖黃芪根際土壤中種群密度為每100 g土壤（25±3.56）個孢囊。

2.2 多序巖黃芪根部分離的孢囊線蟲的形態(tài)學(xué)鑒定

孢囊呈闊檸檬形，淺褐色至深褐色（圖1c），長度為777.7 （631.5～989.0）μm，寬度為558.3 （428.3～775.2）μm;陰門錐明顯，較細，陰門錐內(nèi)含較多明顯的長形泡狀突，具有雙半膜孔，內(nèi)有發(fā)育良好的下橋（圖1d，e）。陰門膜孔長43.6 （35.3～53.8）μm，寬39.3 （30.5～46.9） μm。孢囊飽滿，可見大量2齡幼蟲（圖1f），卵呈長橢圓形，卵殼光滑透明（圖1g）。

2齡幼蟲蟲體細長蠕蟲狀（圖2a），體長453.2 （410.0～500.3） μm，頭部縊縮明顯，口針細長且強壯（圖2b），長21.6 （20.0～23.6） μm，口針基部球明顯，呈圓形。背食道腺開口到口針基部球的距離為3.4 （2.9～3.8） μm，尾長51.3 （47.6～58.2） μm，中食道球和排泄孔清晰可見（圖2c），尾圓錐形（圖2d），透明尾明顯（圖2e）。

將甘肅省隴南市多序巖黃芪上的孢囊線蟲種群與已報道的日本、甘肅和江西種群的大豆孢囊線蟲形態(tài)測量值進行比對分析（表1）。結(jié)果表明，該孢囊種群與已報道的大豆孢囊線蟲種群形態(tài)測量值范圍基本重疊，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，初步將該孢囊線蟲鑒定為大豆孢囊線蟲。

2.3 分子生物學(xué)鑒定

經(jīng)PCR擴增和測序，獲得該線蟲群體的rDNAITS和28S rDNA D2/D3區(qū)序列，大小分別為974 bp和784 bp，GenBank登錄號分別為PQ270559和PQ276517。經(jīng)BLAST對比分析，這2個序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中大豆孢囊線蟲的序列相似性分別為99.89%和100%（GenBank登錄號：HM560787和GU595446）。

基于GTR+G模型構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3，圖4）顯示，本研究獲得的孢囊線蟲序列與大豆孢囊線蟲序列聚為一支，置信度都在95%以上。分子生物學(xué)鑒定結(jié)果進一步表明本研究中多序巖黃芪上的孢囊線蟲為大豆孢囊線蟲。

結(jié)合以上形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，將隴南多序巖黃芪上分離的孢囊線蟲種群鑒定為大豆孢囊線蟲。

2.4 致病性測定

多序巖黃芪根部分離的線蟲接種健康植株，在25℃下孵育，接種后第9天時，明顯觀察到2齡幼蟲侵入根系，且已經(jīng)出現(xiàn)膨大的3齡幼蟲（圖5a，b）。在第15天時，發(fā)現(xiàn)大量膨大的3齡幼蟲（圖5c）。接種18 d時，首次發(fā)現(xiàn)4齡幼蟲（圖5d），接種24 d時在根系第一次發(fā)現(xiàn)白雌蟲（圖5e，f）。在接種第30天時，白雌蟲數(shù)量達到峰值（表2）。隨后在第33天后觀察到褐化的孢囊，并且孢囊內(nèi)部含有飽滿的卵粒。依據(jù)趙洪海等［19］的線蟲世代劃分標準，根據(jù)J2在根內(nèi)大量侵染發(fā)育至根表出現(xiàn)大量白雌蟲，確定為一個世代周期。結(jié)果表明，該孢囊線蟲在多序巖黃芪根系中發(fā)育良好，25℃下完成一代約30 d。經(jīng)統(tǒng)計，在第33天時，平均每株多序巖黃芪上產(chǎn)生35.7個白雌蟲。

研究發(fā)現(xiàn)，接種后30 d與對照相比，接種了孢囊線蟲的植株發(fā)育不良，秧苗矮小瘦弱（圖6a）。病株根部須根增多，根瘤減少，表明該線蟲可以引起健康多序巖黃芪發(fā)?。▓D6b）。

3 結(jié)論與討論

目前，孢囊線蟲的鑒定大都采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方式。本研究形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)多序巖黃芪孢囊線蟲群體陰門錐雙半膜孔，陰門錐下方有較多明顯不規(guī)則的泡狀突，兩膜孔間下橋明顯，與龍海波等［20］描述的大豆孢囊線蟲陰門錐特征一致。孢囊及2齡幼蟲測量值均與Ichinohe［17］所描述的大豆孢囊線蟲測量值相吻合。其次，分子生物學(xué)中的rDNAITS和28S rDNA D2/D3區(qū)獲得2條大小分別為974 bp和783 bp的序列片段，這與耿晶晶等［21］采用相同引物擴增的大豆孢囊線蟲序列大小基本一致，且序列分析表明均為大豆孢囊線蟲，從而再次證明了寄生多序巖黃芪的孢囊線蟲種類為大豆孢囊線蟲。本試驗將該線蟲回接到健康多序巖黃芪植株上，第24天在根部首次觀察到白雌蟲，并在第30天產(chǎn)生大量白雌蟲，該世代基本完成，第33天白雌蟲褐化，形成孢囊。進而證明大豆孢囊線蟲可以侵染多序巖黃芪并在室內(nèi)完成生活史，25℃下世代周期約為30 d，與羅寧等［22］在田間大豆上研究的大豆孢囊線蟲世代周期接近。再次證明了侵染紅芪的孢囊線蟲為大豆孢囊線蟲。

大豆孢囊線蟲的寄主范圍較窄，主要寄主是豆科植物，包括大豆Glycine max、 綠豆Vigna radiata、菜豆Phaseolus vulgaris、豌豆Pisum sativum和多種可食用的豆類［2324］，大豆為模式寄主，也可寄生其他科的一些植物。Manuel等［25］報道9科66種植物是大豆孢囊線蟲的適宜寄主。Schmitt等［24］報道十字花科Brassicaceae、石竹科Caryophyllaceae、莧科Amaranthaceae、唇形科Lamiaceae、玄參科Scrophulariaceae和茄科Solanaceae等非豆科植物是大豆孢囊線蟲的寄主。國外研究報道，大豆孢囊線蟲在田間寄生的植物有寶蓋草Lamium amplexicaule、鷹嘴豆Cicer arietinum和大苞野芝麻Lamium purpureum［2627］。國內(nèi)研究報道，大豆孢囊線蟲的寄生植物包括地黃Rehmannia glutinosa、白花泡桐Paulownia fortunei、煙草Nicotiana tabacum等［2830］。大豆孢囊線蟲的寄主還涉及菽麻Crotalaria juncea、紅車軸草Trifolium pratense、朱纓花Calliandra haematocephala、油菜Brassica rapa、黑麥草Lolium perenne和玉米Zea mays等［31］。在甘肅省內(nèi)，葉文興等［32］和羅寧等［22］報道大豆孢囊線蟲可以寄生大豆。本研究發(fā)現(xiàn)其可以侵染中藥材多序巖黃芪，目前還沒有相關(guān)報道。

多序巖黃芪作為甘肅省獨有的道地大宗藥材之一，其根具有很高的藥用價值，市場和社會需求量很大。而大豆孢囊線蟲作為大豆的重要病害，是一種毀滅性的土傳病害，主要危害寄主根部，發(fā)病嚴重時花和嫩莢枯萎，整株葉片由下而上枯黃似火燒狀，可使大豆減產(chǎn)或者絕產(chǎn)［33］。由于線蟲破壞了須根的表層細胞，嚴重影響了根的吸收作用，使得其地上癥狀類似于缺水缺肥導(dǎo)致的營養(yǎng)不良，常被誤診為生理性病害而不受重視，導(dǎo)致大豆孢囊線蟲病害逐年加重。此外，大豆孢囊線蟲病易與其他病害形成復(fù)合侵染，由于雌蟲成熟時撐破根皮，致使根液外滲，可進一步加重次生土傳根病害或造成根腐病。本研究首次發(fā)現(xiàn)大豆孢囊線蟲可以侵染中藥材多序巖黃芪，并順利完成生活史。然而，要全面準確地掌握該病在甘肅省多序巖黃芪上的發(fā)生情況及危害程度，還需后續(xù)進一步展開深入的調(diào)查研究。

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