電針干預(yù)改善大腦中動(dòng)脈栓塞大鼠腦部缺血機(jī)制的研究

Electroacupunctureinterventiononmechanismofcerebralischemiainratswithmiddlecerebralarteryoccusion （MCAO）

YANG Yunrongl，F(xiàn)ENG Hui’，GUAN Huazong2

'RehabilitationDeparment，uuiCentralHospital，anghai，hina;Depatmentfrevntieedicine，aa Hospital Afiliated to Shanghai UniversityofTraditional Chinese Medicine，Shanghai2ooo5o，China.

[Abstract]Objective：ToobservetheeffectofelectroacupunctureontheexpressionofHtrA1inastrocyteswithinthe hippocampaltissueofratswithacutecerebralinfarction.Methods：Twenty-fourmaleSDratswereselectedandrandomly divided intothesham-operation，model，andelectroacupuncturegroups，with8ratsineachgroup.Themodel and electroacupuncturegroupsunderwentrightmidlecerebralarteryoclusion（MCAO）modelingviatheintraluminal filament occlusionmethod.Thesham-operationgroupreceivedidenticalsurgical exposurewithout filamentinsertion.Twenty-fourhours aftersuccesful modeling，ratsintheelectroacupuncturegroupreceivedelectroacupuncture treatmentatBaihui（GV2o）and Shenting（GV24）using dense-disperse waveswithalternating frequencies of2/15 Hz andacurrent intensityof 1.5–2 mA. Cerebralblodflowchangesastrocyteexpressionandactivationstatus，HrAlmRNAlevels，HtrAlproteinexpressonlevels， and TNF- α ，IL- 1β ，and IL-6 levels of three groups were measured and compared seven days after the operation.Results： WesternblotingshowedthatHtrA1expressioninthemodelgroupwassignificantlyincreasedcomparedtothesham-operation and electroacupuncture groups（both Plt;0.05 ）.Quantitative real-time PCR （qRT-PCR）showed that HtrA1 mRNA expression level in the electroacupuncture group was significantly lower than that in the model group（ Plt;0.05 ）.ELISA showed that the model group had the elevated levels of TNF- α ，IL- 1β ，and IL-6 compared to the sham-operation group （all Plt;0.05 ），while the electroacupuncture group had the reduced levels of TNF- α，lL^-1lβ ，and IL-6 compared to the model group（all Plt;0.05 ）. Conclusions：lectroacupuncturecanleviateijuryproerologicalfuctioancerebralbloodflondpst inflammatoryresponseandthemechanismmaybeassociatedwiththeinibitionof HtrA1proteinexpressionandsuppressonof astrocyte polarization.

[Keywords] Electroacupuncture;Astrocytes;Cerebral ischemia reperfusion;Cerebral infarction

腦卒中已成為全球范圍內(nèi)造成殘疾甚至死亡的主要疾病之一[1]，其中，缺血性腦卒中（cerebral ischemicstroke，CIS）是最常見的類型，也是最具神經(jīng)破壞性的疾病之一[2]。臨床常采用溶栓法治療CIS，用于恢復(fù)大腦血液供應(yīng)，但治療過(guò)程中易造成缺血再灌注損傷[3]。大腦中動(dòng)脈栓塞（middle cerebral arteryocclusion，MCAO）模型是一種常用的大鼠腦缺血模型，用于研究CIS[4]。該模型通過(guò)在大鼠大腦中動(dòng)脈上進(jìn)行永久性結(jié)扎或部分結(jié)扎，使大腦發(fā)生缺血性損傷，模擬腦卒中的病理生理過(guò)程[5]。抑制CIS患者早期神經(jīng)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，可顯著減輕缺血性腦損傷，減輕患者家庭及社會(huì)負(fù)擔(dān)[6-8]。研究表明，電針可明顯改善腦缺血患者的神經(jīng)功能與炎癥狀況[9-10]，但對(duì)其生物分子層面的研究并不深入。

星形膠質(zhì)細(xì)胞（astrocytes，AS）是大腦中最豐富的細(xì)胞，也是主要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞之—[11-12]。AS在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后活化并改變其細(xì)胞特性，成為反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞（reactiveastrocytes，RAS）。RAS為促炎型膠質(zhì)細(xì)胞，能應(yīng)對(duì)多種神經(jīng)受損，被視為一種表征中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在結(jié)構(gòu)性疾病的病理指示。高溫需求絲氨酸蛋白酶A1（hightemperaturerequirementserineproteaseA1，HtrA1）是前腦AS的新標(biāo)志物，在神經(jīng)膠質(zhì)生成過(guò)程中 HtrAI 基因的缺失加速了AS的分化[13]。電針可改善MCAO模型大鼠神經(jīng)功能可能與誘導(dǎo)AS激活有關(guān)[1o]?；诖?，本研究擬采用電針治療右側(cè)MCAO模型大鼠，觀察其療效及電針后AS的極化情況。

1材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取成年雄性SD大鼠24只（交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體質(zhì)量 250～320g ，每籠4只，于 23^°C，12h 光/暗循環(huán)的環(huán)境飼養(yǎng)，自由獲取水和食物。鼠飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵守《中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。本研究獲得交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物與醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批（批號(hào)：2019027）。

1.2 儀器與試劑

采用一次性無(wú)菌針灸針（華佗牌一次性針灸針，規(guī)格 0.25mm×13mm ，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）、HANS-200E韓氏穴位神經(jīng)刺激儀（南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司）、ABIStepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction，PCR）儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）、Zeiss熒光共聚焦顯微鏡（德國(guó)卡爾蔡司）、高通量組織研磨器SCIENTE-48（寧波新芝公司），以及天根反轉(zhuǎn)錄試劑和熒光定量PCR試劑盒、賽默飛HtrA1抗體、賽默飛BCA蛋白定量試劑盒、注射用六氟化硫微泡（聲諾維）等。

1.3分組及干預(yù)方法

24只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和電針組各8只。假手術(shù)組僅分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈及翼腭動(dòng)脈，不進(jìn)行線栓阻塞，直接縫合。模型組及電針組均建立MCAO模型，并于血流阻塞2h 后拔除線栓，實(shí)現(xiàn)再灌注。模型組常規(guī)飼養(yǎng)，不接受電針治療。電針組術(shù)后 24h ，選取百會(huì)穴、神庭穴施以疏密波電針干預(yù)，頻率 2/15Hz ，電流強(qiáng)度 1.5～ 2mA ，強(qiáng)度逐漸加到大鼠耳朵輕微抖動(dòng)、不嘶叫，刺激時(shí)間 30min 。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1神經(jīng)功能缺損評(píng)估3組大鼠分別在術(shù)后24h （電針干預(yù)前）和術(shù)后7d行改良神經(jīng)嚴(yán)重程度評(píng)分（modified neurological severity score，mNSS）。mNSS評(píng)分主要包括運(yùn)動(dòng)（6分）感覺（2分）、反射（4分）和平衡（6分）4個(gè)方面的得分，得分越高代表?yè)p傷越嚴(yán)重。

1.4.2腦血管彩色多普勒超聲檢測(cè)術(shù)后7d麻醉大鼠、剃除雙側(cè)大腦顱頂區(qū)域被毛，于冠狀縫向顱骨后部 4mm ，距矢狀縫兩側(cè) 3mm 處使用牙科鉆打開兩側(cè)顱骨暴露腦組織，將激光多普勒探頭用生物速凝膠固定于硬腦膜，在尾部打入對(duì)比劑（注射用六氟化硫微泡， 0.01mL/100g，3.5mL/h） ，調(diào)試儀器檢測(cè)并記錄大鼠腦部血流。

1.4.3蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)超聲檢測(cè)后，取大鼠缺血半暗帶 10mg ，放射免疫沉淀分析裂解液裂解后，離心取上清液。采用二喹啉甲酸法檢測(cè)蛋白濃度。取 25μg 蛋白十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯轉(zhuǎn)印膜上。 10% 脫脂奶封閉 1.5h，HtrA1（1：1000） 和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（ （1：2000） 抗體 4^°C 冰箱搖床過(guò)夜孵育，Tris緩沖鹽溶液 + 吐溫20清洗3遍后，鼠抗和兔抗 （1：2000） 室溫孵育 ^2h 。Tris緩沖鹽溶液 + 吐溫20清洗后，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白條帶并拍照。

1.4.4免疫熒光染色取材后將切片漂洗滴加一抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）（1：200）， 4^°C 孵育過(guò)夜。次日二抗孵育1h，漂洗后貼片滴加含 4^′ ，6-二基-2-苯基咪啶（DAPI）的封片液， 4^°C 過(guò)夜晾干。在每張免疫熒光染色切片中隨機(jī)選取3個(gè)視野 （×20） ，使用ImageJ1.8.0軟件計(jì)算免疫熒光染色蛋白平均表達(dá)光密度值。

1.4.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用trizol法從大鼠腦組織或培養(yǎng)細(xì)胞中分離總RNA。使用賽默飛逆轉(zhuǎn)錄酶，用 1μg 總RNA生成cDNA，并用于定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR。PCR在Realplex2熱循環(huán)儀中進(jìn)行。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶為內(nèi)部對(duì)照，在各組之間進(jìn)行比較，對(duì)基因表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。所有實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究至少行3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.4.6ELISA檢測(cè)將腦組織勻漿后，加入裂解液，以 30 000r/min 離心速度在 4^°C 下離心 15min ，分裝，-20^°C 保存。采用ELISA試劑盒檢測(cè)上清液中炎癥因子腫瘤壞死因子 σ_α（TNF-αε） ）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）蛋白濃度。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用GraphPadPrism8.3.0軟件繪制相應(yīng)圖表。計(jì)量資料以 表示，2組數(shù)據(jù)比較行獨(dú)立樣本 Φ_t 檢驗(yàn)，3組比較行單因素方差分析，3組間兩兩比較行LSD檢驗(yàn)。以 Plt;0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1模型組與電針組 mNSS 評(píng)分的比較

缺血再灌注后 24h 和7d，采用 mNSS 評(píng)分法進(jìn)行評(píng)估： ① 術(shù)后 24h （電針組干預(yù)前），模型組與電針組mNSS評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P=0.965 ）；② 術(shù)后7d，電針組mNSS評(píng)分顯著低于模型組（ P= 0.003）（圖1）。

圖1模型組與電針組mNSS評(píng)分的比較注： mNSS 評(píng)分為改良神經(jīng)嚴(yán)重程度評(píng)分

2.2 術(shù)后7d3組大鼠腦部血流的改變

術(shù)后7d，假手術(shù)組大鼠雙側(cè)腦血流雖不對(duì)稱但較豐富；模型組與假手術(shù)組比較，雙側(cè)血流下降，患側(cè)（右側(cè)）較健側(cè)（左側(cè)）更低；電針組電針干預(yù)后雙側(cè)血流優(yōu)于模型組（圖2）。

圖2術(shù)后7d3組大鼠腦部血流影像注：圖2a為假手術(shù)組，圖2b為模型組，圖2c為電針組。紅色代表血流朝向探頭方向，藍(lán)色為遠(yuǎn)離探頭方向，粉色框中為患側(cè)與健側(cè)對(duì)比區(qū)域

2.3術(shù)后7d3組大鼠缺血半暗帶 HtrAl 表達(dá)水平 的比較

術(shù)后7d，與假手術(shù)組相比，模型組HtrA1表達(dá)水平顯著升高（ （Plt;0.01） ；與模型組相比，電針組顯著降低 （Plt;0.01） 。從轉(zhuǎn)錄層面來(lái)看，與蛋白趨勢(shì)一致（圖3）。

2.4術(shù)后7d3組大鼠ASGFAP陽(yáng)性活化的比較

各組大鼠冰凍切片采用GFAP熒光染色，采用AS標(biāo)志物GFAP標(biāo)記活化的AS。與模型組相比，電針組干預(yù)后顯著抑制了AS活化（ Plt;0.01 （圖4，5）。

2.5術(shù)后7d3組大鼠炎癥因子水平的比較

模型組炎癥因子TNF- ∝ IL-1β、IL-6均明顯高于假手術(shù)組和電針組（均 Plt;0.05 （圖6）。

3討論

電針療法是將中醫(yī)學(xué)治療手段和現(xiàn)代電刺激治療相結(jié)合的方法，電針是在針刺腧穴“得氣”后，將針連接電針治療儀，與電刺激有機(jī)結(jié)合通過(guò)毫針作用于人體一定部位[14]，臨床治療范圍較廣。其治療腦卒中療效顯著[15]。多項(xiàng)研究表明電針干預(yù)在腦卒中相關(guān)后遺癥中發(fā)揮了顯著作用[16-21]。電針治療可改善急性CIS神經(jīng)功能損傷，療效優(yōu)于單純西醫(yī)治療[16.21-22]。針灸療法和/或結(jié)合康復(fù)方案，可顯著提高CIS患者的生活質(zhì)量，較單純康復(fù)治療更有效。電針是治療CIS的一種重要的非藥物性療法，常用來(lái)治療缺血再灌注損傷，其療效的發(fā)揮與調(diào)控AS極化及激活密切相關(guān)[16，21-22]。楊靜等[23]研究表明， 2/15Hz 和 2/30Hz 的疏密波能激發(fā)腦缺血的耐受性，從而產(chǎn)生腦保護(hù)效果。這一發(fā)現(xiàn)與電針預(yù)處理對(duì)大鼠缺血再灌注后炎性因子及細(xì)胞凋亡的影響研究結(jié)果相吻合，后者也證實(shí)了采用特定頻率 （2/15Hz 的疏密波可誘導(dǎo)腦缺血耐受，減輕腦損傷。缺血再灌注后大鼠會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)行為學(xué)缺損癥狀，如患側(cè)前后肢屈曲、肌張力增高、抓握力下降，甚至行走時(shí)向一側(cè)不自主轉(zhuǎn)圈。本研究證實(shí)電針可顯著改善腦卒中后大鼠的神經(jīng)功能。

圖3術(shù)后7d3組大鼠缺血半暗帶的高溫需求絲氨酸蛋白酶 A1（HarA1 表達(dá)水平注：圖3a為蛋白質(zhì)印跡法HtrAl 的蛋白條帶；圖3b為實(shí)時(shí)熒光定量PCR的 HtrAl 蛋白條帶的柱狀圖；圖3c為實(shí)時(shí)熒光定量PCR的HtrA1mRNA相對(duì)表達(dá)量柱狀圖

圖43組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞（AS）的GFAP與DAPI免疫熒光雙標(biāo)染色注：GFAP為膠質(zhì)纖維酸性蛋白，DAPI為4'，6-二胱基-2-苯基咪啶。紅色為GFAP陽(yáng)性表達(dá)，藍(lán)色為DAPI陽(yáng)性表達(dá)，Merge為GFAP與DAPI的合并圖。箭頭所示為活化AS

圖5免疫熒光統(tǒng)計(jì)直方圖注：GFAP為膠質(zhì)纖維酸性蛋白圖63組缺血再灌注后炎癥因子比較注：圖6a示白介素-6（的蛋白濃度，圖6b示腫瘤壞死因子- Δ∝（TNF-α） 的蛋白濃度，圖6c示白介素-1β（IL-1β）的蛋白濃度

本研究ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示：缺血再灌注后7d，模型組大鼠神經(jīng)功能損傷嚴(yán)重，腦部血流較假手術(shù)組減少，同時(shí)缺血半暗帶中炎癥因子TNF- σ?α∝ 、IL-1β、IL-6表達(dá)明顯高于假手術(shù)組，可能與缺血再灌注損傷有關(guān)，還可能阻礙神經(jīng)功能的恢復(fù)。而電針干預(yù)后，電針組大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)良好，腦部血流較模型組增多，缺血半暗帶中炎癥因子TNF- ∝ 、IL-1β、IL-6明顯低于模型組，表明電針在缺血再灌注的過(guò)程中具有抑制炎癥的作用。

與神經(jīng)元相比，AS的缺血耐受性更強(qiáng)[10.13]，其通過(guò)參與調(diào)節(jié)離子穩(wěn)態(tài)、維持血-腦脊液屏障、減輕興奮性毒性及促進(jìn)缺血后神經(jīng)組織的再生與修復(fù)，為重建神經(jīng)功能完整性提供可能的途徑，可作為CIS治療的潛在靶標(biāo)[22，24]。 HtrAl 屬于絲氨酸蛋白酶家族，是一種熱休克誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)，在高溫下充當(dāng)?shù)鞍酌?，以幫助在熱休克期間去除未折疊的蛋白質(zhì)。HtrA1下調(diào)促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，而其表達(dá)增強(qiáng)時(shí)減弱細(xì)胞運(yùn)動(dòng)[22，24]。腦損傷誘導(dǎo)RAS中 HtrAl 的表達(dá)，內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞增殖增加。

綜上所述，電針干預(yù)可有效下調(diào)MCAO模型大鼠梗死區(qū) HtrAl 蛋白的表達(dá)，可能與電針抑制AS激活及炎癥因子的表達(dá)有關(guān)。

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（收稿日期 2024-07-28）