p53調(diào)控TGF-β1誘導(dǎo)的翼狀肉成纖維細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)分化的研究

中圖分類號：R772；R730 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10. 19907/j. 0490-6756.250041

HAN2，CHEN2，LIU Jia-Lin2，GUOSheng-Hong2 （1.The Afiliated Hospital ， 832OO3，China; 2. Medicine，832Oo3，China）

Abstract： This study aimed to investigate whether p53 mediates the role mammalian target rapamycin （mTOR） signaling in transforming growth factor beta 1（TGF-βl）-induced proliferation and transdiferentiation human pterygium fibroblasts （HPFs）. Primary HPFs were isolated and cultured from human pterygium tissues. Following pre-activation with 10ng/mL TGF- _?β1 for 48h ，p53was either silenced via lentiviral transduction or activated using 10μmol/L Nutlin-3. Cell viability was assessed by CCK-8 assay，migra tion capacity by wound-healing assay，and expression levels proliferation cell nuclear antigen（PCNA），α -smooth muscle actin （ α -SMA），p53，p-mTOR，and mTOR by quantitative polymerase chain reaction （qPCR） and Western blotting. TGF- _?β1 stimulation significantly enhanced HPFs viability and migration，and upregulated PCNA and α -SMA expression. Compared to TGF-βl treatment alone，p53 knockdown markedly further increased cell viability and migration，upregulated PCNA and p-mTOR/mTOR expression levels，but downregulated α -SMA expression. Conversely，Nutlin-3-mediated p53 activation significantly reduced cell viability and migration，downregulated PCNA and p-mTOR/mTOR expression levels，yet upregulated α -SMA expression levels relative to the TGF-βl group. These results indicate that p53 critically regulates TGF-β1-driven proliferation and transdiffrentiation in HPFs through mTOR signaling.Notably， p53 exerts diferential regulatory effects onproliferation and transdiferentiation，highlighting its functional plasticity within the fibrotic microenvironments.

Keywords：Pterygium fibroblast；p53；mTOR；Proliferation；Transdifferentiation

1引言

翼狀裔肉是一種常見的慢性增殖性疾病，它是以局部球結(jié)膜纖維血管組織增生并侵犯到角膜為特點(diǎn)的慢性炎癥性疾病.臨床上，翼狀裔肉表現(xiàn)為翼狀結(jié)膜增厚，遷移到角膜邊緣，通常從鼻側(cè)開始，可侵犯并覆蓋角膜中央和視軸.隨著病情的發(fā)展可以導(dǎo)致眼部異物感、眼紅、刺痛、干燥、角膜散光、視力下降12.目前關(guān)于翼狀努肉的手術(shù)方式有很多種，其中有部分手術(shù)方法，如翼狀裔肉單純切除，翼狀裔肉切除 + 羊膜移植等，由于纖維血管增生3，常存在術(shù)后復(fù)發(fā)率高與修復(fù)困難等缺點(diǎn)4，目前主流的手術(shù)方式為翼狀肉切除十帶角膜緣干細(xì)胞的結(jié)膜瓣移植術(shù)4.各種外部刺激可激活人翼狀肉成纖維細(xì)胞（human pterygium fibroblasts，HPFs），被激活的成纖維細(xì)胞進(jìn)而發(fā)生增殖，轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞.肌成纖維細(xì)胞能表達(dá)a -平滑肌肌動蛋白（alpha smoothmuscleactin，α-SMA），沉積病理性細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM），是導(dǎo)致纖維化的主要因素[5.以上病理改變過程涉及到p53、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetrapamycin，mTOR）及轉(zhuǎn)化生長因子 βl（transforming growth factor beta 1，TGF-β1）等多種因子和信號通道[6.7]．因此，對HPFs的發(fā)病機(jī)制展開深入研究是十分必要的.

TGF-β1作為纖維化的主要誘導(dǎo)因子，在HPFs的形成中起關(guān)鍵作用[8.9].TGF-β1激活肌成纖維細(xì)胞，上調(diào)眼內(nèi)ECM的合成[9.10].有報(bào)道稱，TGF-β1在翼狀裔肉組織中的表達(dá)水平高于正常結(jié)膜組[11].且與原發(fā)翼狀裔肉相比，復(fù)發(fā)性HPFs培養(yǎng)中TGF-β1表達(dá)更高12.翼狀肉中肌成纖維細(xì)胞的存在和TGF-β1的過表達(dá)提示TGF-β1參與了翼狀裔肉的發(fā)病和進(jìn)展．本研究中，TGF-β1用于誘導(dǎo)HPFs的纖維化活化.

p53/mTOR信號參與了多種纖維化與炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展[13.14].p53的功能障礙與mTOR的過度激活通常是一些增殖性疾病的特征.調(diào)節(jié)p53和mTOR之間的平衡是細(xì)胞增殖和存活的保證.有研究表明，p53能在多個水平上參與對mTOR信號的調(diào)控：（1）p53直接調(diào)控mTOR.已知的mTOR復(fù)合體1（mechanistictarget rapamycincomplex1，mTORC1）的多個負(fù)性調(diào)節(jié)分子均為p53的下游靶基因，如DNA損傷反應(yīng)調(diào)節(jié)基因1（regulated in development and DNA damage re-sponsesl，Redd1）[15]，肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1）[16.17]，AMPKβ[18]，結(jié)節(jié)性硬化癥蛋白復(fù)合體 2（tuberous sclerosis complex 2，TSC2）[18].磷酸酶PTEN，能將PIP3去磷酸化為PIP2，從而抑制PI3K/AKT信號通路，它包含p53結(jié)合位點(diǎn)，并能夠被p53反式激活[19]，在基因毒性應(yīng)激下，p53還可通過AMPK、TSC2上調(diào)Sestrinl、Sestrin2表達(dá)，進(jìn)而抑制mTORC1活性[16]；（2）p53下游的微小RNAs（microRNAs，miRNAs）可通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控mTOR信號通路，其中 miR-34a/b/c 是p53最主要的靶基因[20]；（3）胞質(zhì)中的p53可能通過蛋白之間的相互作用來調(diào)控AMPK-mTOR軸抑制自噬[21].但是p53調(diào)控mTOR信號在TGF-β1誘導(dǎo)的HPFs增殖、轉(zhuǎn)分化中的作用目前尚不清楚.

前期試驗(yàn)工作已發(fā)現(xiàn)mTOR在翼狀努肉中高表達(dá)，且mTOR信號通路在HPFs的增殖、轉(zhuǎn)分化中發(fā)揮了重要作用[22.23].本研究旨在闡明p53介導(dǎo)mTOR在TGF-β1誘導(dǎo)的HPFs增殖、轉(zhuǎn)分化中的作用，為翼狀裔肉的靶向治療提供一種有前途的治療策略.

2 材料與方法

2.1材料

2.1.1翼狀肉樣本來源翼狀肉選自2023/5-2023/12在診斷為原發(fā)性翼狀裔肉，且接受翼狀裔肉切除術(shù) + 自體角膜緣干細(xì)胞移植術(shù)的患者21例，年齡 49～76 歲，男性8例，女性13例.本研究嚴(yán)格按照《赫爾辛基宣言》執(zhí)行，通過倫理委員會審批（No：KJ2023-354-01）.所有患者均知情并簽署知情同意書.

2.1.2主要儀器和試劑全自動酶標(biāo)儀（AmericanThermoScientific公司），離心機(jī)/超凈臺（美國Thermo ElectronCorporation），高速低溫離心機(jī)（AmericanThermoScientific公司），移液器（美國Eppendorg公司），水浴鍋（北京光明醫(yī)療儀器廠），GEL-DOC2000凝膠成像儀（美國BioRad公司），電轉(zhuǎn)儀（美國BioRad公司），電泳儀（美國BioRad公司），實(shí)時熒光定量PCR儀（美國BioRad公司），逆轉(zhuǎn)錄儀（中國TaKaRa公司），倒置顯微鏡（日本OLYMPUS），DMEM/F12培養(yǎng)基（美國GIBCO公司）， （1× PBSSolution（美國GIBCO公司），胎牛血清（美國GIBCO公司），慢病毒載體（shRNA/shNC）（蘇州吉瑪基因股份有限公司），CCK-8液（日本同仁技術(shù)有限公司），TGF-β1（美國MedChemexpress生物科技公司），Nutlin-3（美國MedChe-mexpress生物科技公司），Trizol（美國Thermo公司），氯仿替代物（武漢賽維爾生物科技有限公司），RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Thermo公司），實(shí)時熒光定量PCR試劑盒FastSYBRMixture（北京康為生物科技有限公司），Vimentin抗體（ThermoFisher Scientific，1： 250，MA5-11883），Cytokeratin抗體（Thermo Fisher Scientific；1：25O，MA5-32118），IgG（Abcam，1：200，ab150077），DAPI（Abcam;1：5000，ab104139），TGF-β1抗體（SantaCruzBiotechnology，1：1000，sc-52893），p53抗體（Bioswamp，1：1000，PAB30082），mTOR抗體（Bioswamp，1： 1000，PAB30674），p-mTOR 抗體（Boster，1：1000，BM4840），PCNA 抗體（Bio-swamp，1：1000，PAB37099）， a -SMA抗體（Ab-cam，1：1000，ab240678），GAPDH抗體（Proteintech，1： 1000，60004-1-Ig）.

2.2方法

2.2.1HPFs的分離與培養(yǎng)將手術(shù)切除的翼狀肉組織保存于含有 100U/mL 青霉素 .100mg/L 鏈霉素的磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered solution，PBS）中， 2h 內(nèi)運(yùn)輸?shù)綗o菌超凈臺上，在超凈臺上用PBS沖洗翼狀肉組織3遍，并將其剪成約 1mm×1mm×1mm 大小的組織塊，平鋪于細(xì)胞培養(yǎng)皿底部.待 30min 組織塊貼壁后向培養(yǎng)皿中加入含有 100U/mL 青霉素、 100mg/L 鏈霉素及 10% FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基，將培養(yǎng)Ⅲ放置于 37^°C，5%CO₂ 細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每 2～3d 換液一次，待細(xì)胞密度生長到 80%～90% 時采用胰蛋白酶消化傳代，取 3～6 代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).

2.2.2細(xì)胞鑒定將HPFs細(xì)胞接種于培養(yǎng)Ⅲ中，待細(xì)胞密度達(dá)到 80% 后吸除培養(yǎng)基，PBS洗滌，使用 4% 多聚甲醛在室溫環(huán)境下固定細(xì)胞15min.PBS洗滌， 0.5% 曲拉通X-100室溫通透細(xì)胞30min .PBS洗滌， 5% 牛血清白蛋白（bovinese-rumalbumin，BSA）在室溫下封閉1h.棄去封閉液，分別加入 5%BSA 用 5% BSA稀釋的vimentin抗體（1：250）、用 5%BSA 稀釋的pancytokeratin抗體（1：250），在 4^°C 孵育過夜.PBS洗滌，添加A1-exaFluor488（用 5%BSA 稀釋）標(biāo)記IgG二抗（1：200），并在室溫避光下培養(yǎng)1h.PBS洗滌，加入DAPI避光孵育 10min .PBS洗滌，使用熒光顯微鏡觀察并獲得圖片．

2.2.3 CCK-8法檢測HPFs的細(xì)胞活力于96孔板中接種HPFs，每孔 5×10³ 個的細(xì)胞密度來設(shè)置，每組設(shè)置3個復(fù)孔.待HPFs貼壁后吸除孔內(nèi)培養(yǎng)基，先將HPFs使用 10ng/mL TGF-β1預(yù)處理^48h 后，再分別使用慢病毒轉(zhuǎn)染敲低p53，以及使用 10μmol/L Nutlin-3處理TGF-β1誘導(dǎo)的HPFs^48h ，然后吸除培養(yǎng)基，并用PBS沖洗一遍后，將CCK8試劑 10μL 與DMEM/F12培養(yǎng)基 90μL 混勻后加入各個干預(yù)孔.最后，利用酶標(biāo)儀測定每孔在 450nm 波長處的吸光度值.

2.2.4劃痕實(shí)驗(yàn)將HPFs接種于6孔板中.培養(yǎng) 24h 后，每個孔的細(xì)胞個數(shù)達(dá)到 10⁵ 個/孔，細(xì)胞密度達(dá)到 90% 的融合度，用 100μL 無菌移液管在預(yù)先準(zhǔn)備的標(biāo)記處垂直于培養(yǎng)皿底部刮拭.隨后，用PBS洗滌劃痕孔3次，并按照第2.2.3節(jié)中所述方法干預(yù)細(xì)胞，選擇一個固定點(diǎn)，在添加選定濃度的藥物處理后選定分別于 ^0h 和后續(xù)合適的時間拍攝劃痕照片.使用ImageJ軟件測量每張圖像中的細(xì)胞遷移面積.數(shù)據(jù)以 ^0h 劃痕面積量化，以100% 為標(biāo)準(zhǔn)．

2.2.5shRNA重組表達(dá)載體的構(gòu)建將設(shè)計(jì)好的序列導(dǎo)入慢病毒載體，經(jīng)過克隆及工具細(xì)胞轉(zhuǎn)染等，收獲病毒顆粒后經(jīng)純化、濃縮及滴度檢測后保存?zhèn)溆?（慢病毒載體包裝過程由蘇州吉瑪基因股份有限公司完成）

shRNA基因序列對照 ）：

sh-NC：TTCTCCGAACGTGTCACGT（Re

portnumber：R2023-SH5010） sh-p53-Homo-738： GAAATTTGCGTGTG

GAGTATT（Reportnumber：R2023-SH5009） sh-p53-Homo-1105： ACCACTGGATGGAG

AATATTT（Reportnumber：R2023-SH5008） sh-p53-Homo-1265： CAGTCTACCTCCCG

CCATAAA（Report number：R2023-SH5007）

2.2.6細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞鋪板：將貼壁細(xì)胞以 10×10⁴， /孔鋪到六孔板中.搖勻六孔板， 37^°C ，5%CO₂ 過夜，以備次日轉(zhuǎn)染.病毒的稀釋： 2mL 稀釋液，以 5μg/mL Polybrene的濃度，向稀釋液中添加 40μL 的慢病毒原液.吸走細(xì)胞培養(yǎng)液，將稀釋后的病毒液加入其中，并設(shè)立對照（blank，negative），在 37^°C，5%CO₂ 條件下培養(yǎng)過夜.24h后將轉(zhuǎn)染細(xì)胞的病毒液移走，使用 2mL 新鮮常規(guī)完全培養(yǎng)液代替，在 37% （20 CO₂ 條件下培養(yǎng)過夜.再繼續(xù)培養(yǎng) 2～3d ，用熒光顯微鏡檢測GFP陽性率，以此來判定細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率．

2.2.7實(shí)時熒光定量PCR（quantitativePCR）各組HPFs經(jīng)第2.2.3節(jié)中所述方法干預(yù)后使用Trizol提取總RNA.使用NanoDrop1OO0UV分光光度計(jì)測定RNA濃度和OD260/OD280比率；每個逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)約使用 1μg RNA（thermo反轉(zhuǎn)錄試劑盒）.根據(jù)thermo反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)SYBRGREENPCRmastermix試劑盒的說明進(jìn)行后續(xù)實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng).使用 2^-ΔΔCT 法計(jì)算目標(biāo)基因的相對表達(dá)量．引物序列見表1.

2.2.8WesternBlotting各組HPFs經(jīng)第2.2.3節(jié)中所述方法干預(yù)后用PBS浸洗3次.棄PBS后用RIPA裂解液冰上裂解細(xì)胞 30min，4^°C12000r/ min 離心 15min 后收集上清液.以BCA（ThermoFisherScientific）法對蛋白定量，向上清液中添加適量體積的PBS及蛋白上樣緩沖液，以達(dá)到 2{μg/ μL 的最終蛋白質(zhì)濃度，蛋白質(zhì)在 100^°C 條件下變性 10min ，然后于 -80^°C 保存.行 12% SDS-PAGE電泳，上樣量為 20μL，80V 電泳 30min 后改為100V繼續(xù)電泳"^1h"采用濕轉(zhuǎn)的方式 （100mA，1h） 將蛋白電轉(zhuǎn)到PVDF膜上（MerckMillipore，Bilerica，MA，USA）.TBST洗膜3次， 5% 脫脂牛奶封閉 2h TBST洗膜3次，分別加入用抗體稀釋液稀釋的 a -SMA抗體（1：100O），PCNA抗體（1：1000），mTOR抗體（1：1000）， Δp -mTOR抗體（1：1000），p53抗體（1：1000），GAPDH抗體（1：1000）， 4^°C 孵育過夜.TBST洗膜3次，將IgG二抗（1：5000）使用抗體稀釋液稀釋后，在室溫條件下孵育"^2h".TBST洗膜3次，滴加ECL后進(jìn)行顯色.使用ImageJ計(jì)算各個條帶的灰度值.

2.2.9統(tǒng)計(jì)分析每一次實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)．一項(xiàng)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞來自同一批同一人.使用GraphPadPrism1O軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖.數(shù)據(jù)以均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）表示．運(yùn)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)來進(jìn)行兩組間數(shù)據(jù)的比較，運(yùn)用單因素方差分析進(jìn)行多組間的比較，以Plt;0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

3結(jié)果

3.1HPFs的細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定

組織塊培養(yǎng)第3～5d開始出現(xiàn)少量長梭形細(xì)胞從組織塊邊緣長出.傳代至第3代后，細(xì)胞為形態(tài)均一的長梭形（圖1a）.細(xì)胞免疫熒光染色（圖1b）：在HPFs內(nèi)，Vimentin蛋白主要分布于胞漿，呈綠色熒光，呈束狀或纖維狀排列，而cytokeratin蛋白呈陰性.結(jié)合細(xì)胞形態(tài)、vimentin蛋白和cytokeratin蛋白染色結(jié)果，初步判定原代細(xì)胞是HPFs.

（a）翼狀肉成纖維細(xì)胞（HPFs）；（b）免疫熒光檢測角蛋白、波形蛋白的表達(dá)情況.

3.2調(diào)控p53影響TGF-β1誘導(dǎo)的HPFs增殖、遷移

CCK-8測定結(jié)果顯示：在加入不同濃度的TGF-β1誘導(dǎo) 12h，24h，48h 后，各組細(xì)胞活力隨著TGF-β1誘導(dǎo)時間的延長而增強(qiáng)，呈時間依賴性.在 10ng/mL TGF-β1處理 48h 后，HPFs的細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)（ Plt;0.0001 （圖2a），表明TGF-βl處理可以促進(jìn)HPFs增殖.

通過qPCR結(jié)果顯示，在3組不同位點(diǎn)敲低組中，sh-p53-Homo-738的敲低效果最好，故選用該敲低位點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)（ Plt;0.0001） （圖2b）.我們通過CCK-8實(shí)驗(yàn)先檢測了在TGF-β1誘導(dǎo)的HPFs中敲低p53后的細(xì)胞活力改變，CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與單純TGF- _β1 處理組比較，敲低p53后，細(xì)胞活力顯著增強(qiáng) （Plt;0.0001） （圖2c）.而通過Nutlin-3來解除MDM2-p53軸對于p53的活性抑制，重新激活p53的生長抑制和促凋亡活性后，與單獨(dú)TGF-β1處理組相比，細(xì)胞活力明顯降低 Plt; 0.0001）（圖2d），且結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[24.25]，故選用10μmol/L 濃度的Nutlin-3進(jìn)行后續(xù)信號分子的檢測.

劃痕結(jié)果顯示，與對照組相比， 10ng/mL TGF-β1作用 48h 后，HPFs的遷移能力明顯增強(qiáng)，表現(xiàn)為細(xì)胞前沿遷移面積明顯擴(kuò)大（ ?Plt;0.05） ；與單純TGF-β1處理組比較，敲低p53后，細(xì)胞的遷移能力顯著增強(qiáng) （Plt;0.05） ；與單獨(dú)TGF-β1處理組相比，再使用Nutlin-3處理后，細(xì)胞的遷移能力也顯著減弱 （Plt;0.05） （圖2e）.

3.3p53介導(dǎo)mTOR參與了TGF-β1誘導(dǎo)的HPFs的增殖與轉(zhuǎn)分化過程

為了探討p53是否通過調(diào)控mTOR在TGF-βl誘導(dǎo)的HPFs增殖、轉(zhuǎn)分化的潛在功能，接下來我們通過qPCR和Westernblotting分析了調(diào)控p53后，相應(yīng)分子的mRNA以及蛋白的改變. qPCR 結(jié)果顯示：與對照組相比， 10ng/mL TGF-β1處理 48h 后，PCNA（ ?Plt;0.05） 、 a -SMA （ Plt;0.0001 ）的mRNA表達(dá)量明顯上調(diào)；與單純TGF-β1處理組比較，敲低 p53 后，PCNA的mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)?Plt;0.0001） ，而 α -SMA的mRNA表達(dá)量顯著下調(diào) （Plt;0.0001） ; 10μmol/L Nutlin-3處理TGF- _β1 誘導(dǎo)后的HPFs，與單獨(dú)TGF-β1處理組比較，PCNA的mRNA表達(dá)明顯下調(diào) ?Plt;0.05） 1，a -SMA的mRNA表達(dá)顯著上調(diào) ?Plt;0.0001） （圖3a，3b）.Westernblotting結(jié)果進(jìn)一步表明，與對照組相比， 10ng/mL TGF-β1作用 ^48h 后，PCNA（Plt;0.0001 ） Ω_?α -SMA（ Plt;0.001） 的表達(dá)顯著上調(diào)（圖3d）;與單純TGF-β1處理組比較，敲低p53后，PCNA （Plt;0.0001）.p.mTOR/mTOR（Plt;0.0001） 的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)， p53（Plt;0.0001） ） α -SMA P lt;0.001? 的蛋白表達(dá)量呈顯著下調(diào)（圖3c，3d）.10μmol/L Nutlin-3處理TGF-β1誘導(dǎo)后的HPFs，與單獨(dú)TGF- ^?β1 處理組比較，PCNA（ Plt;0.0001）._F ！mTOR/mTOR（ Plt;0.001） 蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，p53（Plt;0.0001 ） α -SMA（ Plt;0.0001? 的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（圖3c，3d）.

4討論

多種細(xì)胞因子有助于HPFs的纖維化進(jìn)展．目前證據(jù)表明，翼狀裔肉中的上皮細(xì)胞在增殖和凋亡之間的平衡發(fā)生了改變，導(dǎo)致間質(zhì)活化成纖維細(xì)胞過度生長、新生血管形成、炎癥細(xì)胞浸潤以及彈性蛋白和膠原蛋白的異常ECM積累9，故HPFs是翼狀努肉產(chǎn)生纖維化和ECM成分的主要細(xì)胞類型.然而，翼狀努肉纖維化的機(jī)制在很大程度上仍未被探索，并且缺乏有效的治療方法.根據(jù)既往研究，我們發(fā)現(xiàn)HPFs在受到TGF-β1刺激后，能促進(jìn)其增殖、遷移并向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化[26]，這依賴于mTOR等多種信號分子的激活[6.23.27，28].在本研究中，從翼狀裔肉組織中分離出原代成纖維細(xì)胞，并基于前期 mTOR 在翼狀裔肉中的研究基礎(chǔ)，首次評估了p53介導(dǎo)mTOR在TGF-β1誘導(dǎo)的HPFs增殖、轉(zhuǎn)分化中的作用，這為抑制翼狀裔肉的纖維化提供了潛在的治療靶點(diǎn).

（a）CCK-8檢測不同濃度TGF 作用不同時間（12h、24h、48h）后HPFs的細(xì)胞活力的變化；（b）慢病毒轉(zhuǎn)染敲低p53后，qPCR檢測不同敲低位點(diǎn)的敲低效率；（c）在TGF-β1誘導(dǎo)的HPFs中敲低p53后，CCK-8檢測細(xì)胞活力的改變；（d）CCK-8檢測不同濃度Nutlin -3（0μmol/L，2.5μmol/L.5μmol/L，10μmol/L，20μmol/L）/ 處理TGF-β1誘導(dǎo)的HPFs48h后細(xì)胞活力的改變；（e）劃痕實(shí)驗(yàn)檢測各組中細(xì)胞遷移能力的改變. n=3，ns ：無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異； ^*Plt;0.05 ^**Plt;0.01 ^***Plt;0.001 ****Plt;0.0001 業(yè)

（a）CCK-8 detected changes inviabilityHPFsafter treatment with TGF-β1 （5ng/mL ， 10ng/mL ， 15ng/mL ，and 20ng/mL） for12， 24and4speiel；）fctifreoclts；）-8eedgilli fterp53kckoinGF-βdedHs;d）CCK-8eteedteagscellitiF-dudHtreatediln3 at different concentrations 0μmol/L_?2.5μmol/L_?5μmol/L_?10μmol/L_?20μmol/L_?）for 4μL_? 48h ；（e）Thecell migrationability different treatment groups was detected by wound healing assay. n=3 ， ns ：not significant; ^*Plt;0.05 ^**Plt;0.01 . ^***Plt;0.001 ·****Plt;0.0001

紫外線（ultraviolet，UV照射被認(rèn)為是冀狀肉的主要原因.紫外線可以通過對細(xì)胞的直接光毒性作用、產(chǎn)生活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）來破壞、改變細(xì)胞的DNA、產(chǎn)生炎癥因子來誘導(dǎo)翼狀憫肉的發(fā)病過程[29.30].近年來，慢性紫外線暴露誘導(dǎo)的皮膚纖維化機(jī)制研究呈現(xiàn)快速增長趨勢，其中p53/mTOR信號軸因在細(xì)胞自噬與纖維化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的樞紐作用，已成為該領(lǐng)域分子機(jī)制探索的核心靶.Strozyk等研究發(fā)現(xiàn)，p53與AKT/mTOR通過動態(tài)拮抗調(diào)控UV應(yīng)激下的細(xì)胞凋亡、自噬、衰老等，兩者的動態(tài)拮抗失衡是皮膚癌發(fā)生的關(guān)鍵分子開關(guān)[31].p53/mTOR信號通路在許多纖維化疾病中的作用已被報(bào)道.蒼術(shù)多糖通過抑制 p53/mTOR 通路以減輕自噬的過度激活，進(jìn)而減少非酒精性脂肪性肝炎的細(xì)胞損傷和纖維化的發(fā)生[32].在Gata1低表達(dá)小鼠模型中，TGF-β1信號異常通過激活 p53/mTOR 通路加劇骨髓纖維化，表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞活化增強(qiáng)、骨硬化及血管增生；抑制TGF-β1可下調(diào)p53/mTOR信號活性，減少膠原沉積、恢復(fù)正常造血功能及降低脾髓外造血負(fù)荷，從而逆轉(zhuǎn)纖維化進(jìn)程[14].值得一提的是，文獻(xiàn)報(bào)道稱p53/mTOR通路也參與了干細(xì)胞的調(diào)節(jié).例如，p53-mTOR調(diào)控網(wǎng)絡(luò)通過細(xì)胞凋亡、自噬等過程確保干細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)與生長調(diào)控[33].在前期研究中，Zhao等報(bào)道翼狀裔肉中mTOR表達(dá)較正常結(jié)膜增高，且p70S6K表達(dá)與臨床嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，雷帕霉素可降低HPFs中α-SMA的表達(dá)[28].而本研究基于前期研究的基礎(chǔ)上，我們發(fā)現(xiàn)，p53通過mTOR參與介導(dǎo)了TGF- ?β 1誘導(dǎo)的HPFs增殖、轉(zhuǎn)分化過程，且在此過程中，敲低p53誘導(dǎo)的HPFs增殖或轉(zhuǎn)分化能被雷帕霉素抑制.這證實(shí)了mTOR在翼狀肉增殖、轉(zhuǎn)分化中的重要作用．同時，也提示我們，靶向p53mTOR軸來調(diào)控HPFs的增殖和轉(zhuǎn)分化似乎是一種很有前景的治療策略，這值得進(jìn)一步探究.

（a）qPCR檢測不同處理組中PCNA的mRNA表達(dá)情況;（b）qPCR檢測不同處理組 α -SMA的mRNA表達(dá)情況;（c）Westernbloting檢測不同處理組p53蛋白的表達(dá)情況；（d）Westernblotting檢測不同處理組PCNA、 α -SMA、p-mTOR/mTOR蛋白的表達(dá)情況. n=3，ns ：無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異； ^*Plt;0.05 ^**Plt;0.01 ^***Plt;0.001 ****Plt;0.0001

Fig.3p53-mediated mTOR is involved in the proliferation and transdiffrentiation TGF-β1-induced HPFs

（a）qPCRdetects the mRNA expressionPCNA indiferenttreatment groups；（b）qPCRdetects the mRNA expression α -SMAindifferentreatmntgros;Westelotietectsteproteepresas5iinttreamntosd）Westoigde tects the protein expression changes PCNA，α-SMA，and p-mTOR/mTOR in diffrent treatment groups. n=3 ， ns ：not significant; ^*Plt; 0.05; **Plt;0.01 ***Plt;0.001 ****Plt;0.0001

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)調(diào)控p53后，p53的表達(dá)與PCNA呈負(fù)相關(guān)，與 a -SMA呈正相關(guān)，這似乎是有爭議的.p53作為一種常見的腫瘤抑制因子，可誘導(dǎo)衰老和細(xì)胞凋亡，這似乎與翼狀裔肉不受抑制的生長相矛盾.有學(xué)者推測，這可能與p53受到某些結(jié)合蛋白的調(diào)控，如MDM2，從而抑制了其表達(dá)活性有關(guān)[34].也有學(xué)者認(rèn)為，氧化應(yīng)激和炎癥是與翼狀努肉密切相關(guān)的病理生理過程.ROS積累可引發(fā)氧化應(yīng)激，涉及凋亡、壞死和自噬等多種生物過程[35].長期紫外線照射會造成大量ROS累積，引起p53基因的突變，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡失控[35.36].研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物細(xì)胞中，p53是抑制TGF- ?β 誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖的重要因子，缺乏p53時，會導(dǎo)致這種抑制作用出現(xiàn)障礙，以及在某些細(xì)胞類型中無法有效啟動CDK抑制劑 p21^waF1 的表達(dá)[37].此外，也有研究表明， p53 通過與受體激活的smad絡(luò)合而成為TGF- β 信號通路中的一個輔助調(diào)節(jié)因子，與TGF- β 協(xié)同調(diào)節(jié)腎臟纖維化過程[38].故TGF- ?β 與p53在機(jī)體生理和病理活動中可能存在一定的聯(lián)系．

越來越多的證據(jù)證實(shí)，p53參與EMT和纖維化[39，40].進(jìn)一步研究表明，TGF-β驅(qū)動的纖維化通過smad依賴或非smad途徑介導(dǎo)，并由輔助受體和相互作用網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié).TGF-β1/Smad信號通路是調(diào)節(jié)纖維化的重要途徑，TGF-β1是最有效的促纖維化細(xì)胞因子.TGF-β1主要受Smads超家族調(diào)控.Smad2/3的磷酸化是通過激活膜特異性絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，然后與常見型Smad4結(jié)合形成寡聚物，并將其轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)啟動TGF-β1的表達(dá)，導(dǎo)致 α -SMA、Collagenl、FN等纖維化相關(guān)基因水平升高[41，42].值得注意的是，TGF-β1/Smad通路介導(dǎo)了細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換，而 α -SMA的表達(dá)則受到Smad2和Smad3的協(xié)同調(diào)控，而Smad3在這一過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用.對Smad3基因敲除小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)中，Smad3缺失導(dǎo)致成纖維細(xì)胞無法被TGF-β1趨化，不能自分泌TGF-β1[43]，同時被TGF-β1刺激后 α -SMA的表達(dá)也不增加[44].TGF-β還可激活不依賴Smads的其他信號級聯(lián)反應(yīng)，如MAPK通路等[45].由此，我們推斷Nutlin-3處理后，胞核中p53的激活不能抑制TGF-β1/Smad級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致的 α -SMA的上調(diào)，或是Nutlin-3處理后p53的激活可能不依賴于Smads.既往研究報(bào)道，MMC和Nutlin均能顯著抑制翼狀肉細(xì)胞的增殖.與MMC相比，Nutlin能特異性抑制翼狀肉細(xì)胞的增殖和遷移.這種行為可能歸因于Nutlin對MDM2-p53相互作用.Nutlin對細(xì)胞增殖的抑制作用依賴于野生型p53的激活，通過激活p21等下游靶基因.另外，細(xì)胞中MDM2被抑制后需要一段時間來積累足夠的p53分子來觸發(fā)細(xì)胞凋亡[25].故我們推測，Nutlin-3特異性抑制增殖但可能不干擾TGF-β誘導(dǎo)的促纖維化信號，且p53激活途徑可能獨(dú)立于Smad通路.以上內(nèi)容提示，p53的生物學(xué)效應(yīng)高度依賴微環(huán)境及相互作用網(wǎng)絡(luò)調(diào)控.

無論是敲低p53還是Nulin-3處理，其本質(zhì)都是對野生型p53調(diào)控，然而，關(guān)于p53調(diào)控的復(fù)雜性不僅限于野生型.翼狀裔肉中本身存在著大量突變p53基因[46]，在成纖維細(xì)胞中，突變的p53可以改變腫瘤細(xì)胞分泌組并導(dǎo)致CAF亞群的變化，從而調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的招募和組織．一項(xiàng)研究表明，結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞中的p53R273H會誘導(dǎo)外泌體miR-21-3p和miR-769-3p增加，這些外泌體被成纖維細(xì)胞攝取并激活TGF- ?β -Smad信號通路，從而有助于免疫抑制性TME和EMT，表明p53突變可以重新編程成纖維細(xì)胞以改變腫瘤免疫微環(huán)境47.故可能在TGF-β1誘導(dǎo)HPFs中，突變型p53（而非野生型p53）通過TGF- ?β -Smad軸直接驅(qū)動成纖維細(xì)胞活化，并可能通過免疫微環(huán)境調(diào)控間接增強(qiáng)纖維化表型，導(dǎo)致 a -SMA表達(dá)與p53水平呈正相關(guān)．這一現(xiàn)象反映了突變型p53的獨(dú)特功能對纖維化過程的特異性調(diào)控.

本研究雖取得具有說服力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但仍存在若干局限性需予闡明.需指出的是，本論文尚未探究TGF-β1處理后，p53在轉(zhuǎn)錄、活性等方面的變化；且慢病毒敲低p53或Nutlin-3激活p53后，尚缺乏回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證p53下游效應(yīng)的特異性．未來需完善p53轉(zhuǎn)錄、活性的檢測，補(bǔ)充Nutlin- 3+ p53敲低的回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，并結(jié)合多組學(xué)分析排除脫靶效應(yīng).總的來說，本研究證實(shí)了HPFs響應(yīng)TGF-βl的刺激，通過p53來介導(dǎo)mTOR信號參與了TGF-β1誘導(dǎo)的HPFs增殖、轉(zhuǎn)分化過程，并揭示p53可能通過非Smad依賴的分支信號途徑促進(jìn)HPFs轉(zhuǎn)分化現(xiàn)象.上述發(fā)現(xiàn)不僅深化了對翼狀肉發(fā)病機(jī)制中關(guān)鍵分子的認(rèn)知，更為開發(fā)靶向p53-mTOR信號軸的精準(zhǔn)治療策略提供了潛在干預(yù)靶標(biāo).

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