6種病毒復(fù)合侵染“瑪莎莉”甘薯的鑒定和分析

中圖分類號(hào)S435.31文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào) 0517-6611（2025）12-0141-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.12.032

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Identification and Analysisof a Mixed Infection of Six Viruses in Sweet Potato Cultivar“Mashali\"

ZHANG Xiao-yan1，LIUYu-shan’，ZHU Wen-l2etal（1.Shandong（Linyi）InstituteofModerAgriculture，ZhejiangUnivesiy，iiyi，Shandong 276OoO;2.Linyi Vocational University of Science and Technology，Linyi，Shandong 276034）

AbstractTranscriptomesequencingandRT-PCRwereperformedonfourswetpotatosamplescolectedfromLinyiCityShandongProvince，tostudyttysofusttfeedswpotato“Mashl，noertrovidfercforhdigoffotato sedlingsandthefoulationofprevetionandcotroltrategies.Theseetpotatosamplesof“ashali”showdobviousosaicndcrikling symptoms.Sixknoviuses，incdingsweepotatofatheryotlevirus（PFV），swetpotatolatenvius（SPLV），sweepoatoeafcurl virus（SPLCV），sweetpotatovirusG（SPVG），sweetpotatovirusC（SPVC）andsweetpotatovirus2（SPV2）wereidentified.Thspecific primersoftheaboveviruseswereseletedforRPCRdetectio，tetargeandsiththeexpectedsizeofthesixviuseswereobaidand thetargetviussequences wereverifdbysequencing.TeresultsofRT-CRandtranscriptomesequencingwereconsistentwittesulsf 3samplescontaining6virusesand1samplecontaining4viruses.TephylogeneticanalysisbasedontheCPgeneshowedthattheetected SPFMV hadacloseevolutionalrelationshipwithSPFMVrusetcrack（RC），thedetectedSPLCV，SPV2andSPVCwere mostcloselyrelated totheisolatesofina，PVGasostoelyelatedtoholatesofCndtheeresiantfrecsogisolatefroV colectefrodftgiouloftsdyillprvdealsisforstablstofldotroldvfr nology system of sweet potato cultivar“Marasali”.

Keywords Sweet potato virus disease;Mixed infection;Transcriptome;RT-PCR

甘薯[Ipomeabatatas（L.）Lam]是集飼料、糧食和工業(yè)原料于一體的多用途作物，是我國(guó)種植面積較大的作物之一。受繁殖方式的影響，甘薯在生長(zhǎng)和繁育過程中極易受到病毒感染，造成產(chǎn)量下降、品質(zhì)受損和種性退化等問題，嚴(yán)重影響甘薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

甘薯病毒病已經(jīng)成為威脅甘薯生產(chǎn)的第二大生物脅迫[2-3]。目前，全世界已鑒定到30余種病毒能夠侵染甘薯，在我國(guó)發(fā)生的主要有甘薯褪綠矮化病毒（Sweetpotatochlo-rotic stunt virus，SPCSV）、甘薯羽狀斑駁病毒（Sweetpotatofeatherymottlevirus，SPFMV）、甘薯G病毒（SweetpotatovirusG，SPVG）和甘薯潛隱病毒（Sweetpotato latentvirus，SPLV）等[3-10]。同時(shí)，甘薯的種植主要依靠枝條扦插，由于缺乏良種繁育體系，種薯種苗生產(chǎn)滯后，導(dǎo)致病毒復(fù)合侵染率高。其中SPFMV與SPCSV復(fù)合侵染形成的甘薯病毒?。⊿weetpotatovirusdisease，SPVD）是導(dǎo)致甘薯產(chǎn)量降低和種性退化的主要因素[1]。目前，利用小RNA 測(cè)序、RT-PCR、多重PCR、逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP）檢測(cè)方法、重組酶聚合酶核酸擴(kuò)增（Recombinase polymerase amplification，RPA）和側(cè)向流試紙條（Lateralflowdipsticks，LFD）相結(jié)合的可視化快捷檢測(cè)方法等建立了甘薯病毒的檢測(cè)體系[12-16]。因此，高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合PCR方法成為鑒定甘薯病毒復(fù)合侵染發(fā)生的重要技術(shù)手段。

目前，單一甘薯品種病毒病發(fā)生的報(bào)道較少，制約了針對(duì)單一品種甘薯的脫毒技術(shù)體系建立和抗病育種研究?！艾斏騖"甘薯引種于日本千葉縣，在遼寧、山東、河北、海南等地均有種植。該品種適應(yīng)能力強(qiáng)、產(chǎn)量高、口感細(xì)滑、香糯蜜甜，是目前日本最熱門、最具人氣的高端蜜薯之一。筆者通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和RT-PCR方法對(duì)山東省臨沂市甘薯種植區(qū)疑似病毒感染的“瑪莎莉”甘薯樣品進(jìn)行檢測(cè)和分析，確定其感染病毒的種類和數(shù)量，旨在為該品種脫毒種苗的繁育和防控提供理論依據(jù)，從而推動(dòng)該品種的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)和應(yīng)用。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料2021年9月山東省臨沂市甘薯種植區(qū)病毒病田間癥狀明顯，采集花葉、皺縮、畸形的甘薯葉片，低溫保存，經(jīng)液氮快速冷凍后，置于 -80°C 備用。

1.2文庫構(gòu)建和高通量測(cè)序分析 將采集的4個(gè)甘薯樣品送上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司分別進(jìn)行RNA提取和建庫。構(gòu)建好的文庫Agilent2100Bioanalyzer質(zhì)檢合格后，使用Illumina HiSeqX Ten進(jìn)行測(cè)序。使用Trimmomatic和Trinity（version：2.4）軟件獲得高質(zhì)量的cleanreads后進(jìn)行拼接。將拼接好的序列與GenBank中的參考基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)分析。

1.3RT-PCR和測(cè)序驗(yàn)證根據(jù)高通量測(cè)序獲得的病毒序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行驗(yàn)證，引物見表1。取上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司返回的RNA 2μL 于Eppendorf離心管中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。在離心管中分別加入 5×RT Buffer、dNTP Mix（ 10mmol/L each）、Random hexamers（ ）、RNaseinhibitor（ 40U/μL ）和RNaseinhibitor（ 40U/μL ），RNase-freeddH₂0 補(bǔ)齊至 20μL ，于 42% PCR儀中反應(yīng) 60min 。取 1μL 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCR，依次加入 2× PhantaMaxMasterMix、正向引物和反向引物， ddH₂0 補(bǔ)足至 50μL 95^°C 預(yù)變性 3min;95°C 變性 15s，54P 退火 15s，72% 延伸15s，30個(gè)循環(huán);最后 72^°C 延伸 5min 。PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果并拍照，在紫外燈下切割特異性片段并進(jìn)行回收，送杭州擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4進(jìn)化樹分析從NCBI下載SPFMV東非株系（EastAfrica，EA，GenBank登錄號(hào)：KP729265.1，F(xiàn)J795764.1，AH013779.2，MH763679.1，MH763681.1，MH763678.1），SPFMV褐裂株系（Russet Crack，RC，GenBank 登錄號(hào)：AF015540.1，KP115608.1，KP115610.1，KY296451.1）和 SPFMV 普通株系（Ordinary，O，GenBank登錄號(hào)：EU809488，AB439206.1，AB465608.1，D16664.1，KC771331.1）；SPLCV日本分離物（Genbank登錄號(hào)：AB33786，AB33787，AB33788），西班牙分離物（Genbank登錄號(hào)：MG254542，MG254543）和中國(guó)分離物（Genbank登錄號(hào)：KU323597，NC075421，MW021476）；SPLV韓國(guó)分離物（GenBank登錄號(hào)：KP115611，KP115614，KP115613），中國(guó)分離物（GenBank 登錄號(hào)：MK778806，MK778803，HQ844136，KP115613，KP115611，HQ844140，HQ844130）;SPV2美國(guó)分離物（Genbank登錄號(hào)：JN613807，OR829285，OR829284，NC017970，KP729268），中國(guó)分離物（Genbank登錄號(hào)：MK778812，MK778811，MK778809），澳大利亞分離物（Gen-bank登錄號(hào)：KX017448，KX017444）;SPVC澳大利亞分離物（Genbank登錄號(hào)：MF572057，MF572058，MG656436，MG656435），韓國(guó)分離物（Genbank登錄號(hào)：KP115621，MH388500，MH388499），中國(guó)分離物（Genbank登錄號(hào)：KU877879，MZ209145，MK778822，MK778821） ; SPVG CH1株系（Genbank 登錄號(hào)：MK778824，MK778823，JQ824374，MK778825，MK778844），CH2株系（Genbank登錄號(hào)：MK778832，KF790759，MK778833），CH3株系（Genbank登錄號(hào)：KX279878，MK778835，MK778836）CP基因核苷酸序列，并與該研究獲得的CP基因序列通過MEGA-10.1鄰接法（Neighbor-Joining，Bootstrap =1 000 ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1臨沂市甘薯病毒病主要癥狀 2021年9月在山東省臨沂市多個(gè)甘薯種植區(qū)進(jìn)行病毒病的調(diào)查，相較于其他品種，“瑪莎莉\"甘薯的病毒病癥狀明顯，發(fā)病程度更加嚴(yán)重，主要表現(xiàn)為花葉和皺縮（圖1）等。

2.2高通量測(cè)序及分析對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并鑒定到6種病毒，包括甘薯羽狀斑駁病毒（Sweetpotato featherymottlevirus，SPFMV）、甘薯卷葉病毒（Sweetpotato leafcurl vi-rus，SPLCV）甘薯潛隱病毒（Sweet potato laten virus，SPLV）、甘薯2號(hào)病毒（Sweet potato virus2，SPV2）、甘薯C病毒（Sweet potato virusC，SPVC）和甘薯G 病毒（Sweet potato virusG，SPVG）。其中，SPFMV、SPLV、SPVG、SPVC和SPV2這5種病毒屬于馬鈴薯Y病毒屬，SPLCV屬于菜豆金色黃花葉病毒屬。利用Trinity軟件拼接組裝，獲得注釋為SPFMV的包含10885個(gè)核苷酸（nucleotide，nt）的contig，注釋為SPLCV的包含 1526nt 的contig，注釋為SPLV的包含 10551nt 的contig，注釋為SPV2的包含10441nt的contig，注釋為SPVG的包含 10254nt 的contig，注釋為SPVC的包含 9 046nt 的contig。

2.3 RT-PCR檢測(cè)甘薯樣品中的病毒 為進(jìn)一步確定田間

采集的4個(gè)甘薯樣品的帶毒情況，結(jié)合高通量測(cè)序結(jié)果，分別用SPLV、SPFMV、SPVG、SPV2、SPLCV和SPVC的特異性引物對(duì)樣品進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，擴(kuò)增獲得了與預(yù)期相符的6種病毒目的條帶，其大小分別為879、948、1068、996、762和732bp （圖2）。為進(jìn)一步確定結(jié)果的可靠性，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收并進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明，陽性樣品中6種病毒的核酸序列均符合目的病毒序列。經(jīng)鑒定，3個(gè)樣品中均含有6種病毒，1個(gè)樣品中含有4種病毒（表2），RT-PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致。

注：M.DL2000 標(biāo)記;1＼～4.甘薯樣品;CK.陰性對(duì)照。

Note：M.DL2 OOO marker;1-4.Sweet potato sample;CK.Negative control.

圖2瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)SPV2、SPVC、SPVG、SPLV、SPLCV和SPFMV

Fig.2Electrophoretogram of detection SPV2，SPVC，SPVG，SPLV，SPLCV and SPFMV after RT-PCR

2.4基于CP基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析SPFMV是導(dǎo)致SPVD 的重要病毒之一[17-18]，為進(jìn)一步分析 SPFMV 的親緣關(guān)系，將其CP基因與已報(bào)道的分離物構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示：SPFMV分為EA、O和RC株系3個(gè)分支，檢測(cè)到的SPFMV（Genbank登錄號(hào)：PP069762）聚在RC株系的分支中，與RC株系中AF015540.1關(guān)系最近（圖3a）;而SPLV分離物地區(qū)之間的親緣差異比較大，檢測(cè)到的SPLV（Genbank登錄號(hào)：PP683082）與KP115613關(guān)系最近（圖3b）；檢測(cè)到的SPLCV（Genbank登錄號(hào)：PP683081）、SPV2（Genbank登錄號(hào)：PP683083）和SPVC（Genbank登錄號(hào)：PP683084）與中國(guó)分離物的親緣關(guān)系最近（圖3c、3d、3e）；檢測(cè)到的SPVG（Genbank登錄號(hào)：PP683085）與CH1株系的親緣關(guān)系最近（圖3f）。

3結(jié)論與討論

甘薯是我國(guó)重要的糧食經(jīng)濟(jì)作物，甘薯產(chǎn)業(yè)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了從追求產(chǎn)量到提升品質(zhì)的升級(jí)轉(zhuǎn)型，但甘薯生產(chǎn)上仍面臨巨大挑戰(zhàn)。甘薯病毒病嚴(yán)重影響甘薯產(chǎn)量和品質(zhì)，已經(jīng)成為制約甘薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素之一[19]。目前國(guó)際上已報(bào)道可侵染甘薯的病毒有30余種，國(guó)內(nèi)已報(bào)道可侵染甘薯的病毒有10余種，其中利用小RNA測(cè)序技術(shù)鑒定到吉林省和海南省甘薯存在10種病毒，利用嫁接法和分子生物學(xué)方法鑒定到江蘇省存在 10 種 RNA 病毒[16.20-21]。由于甘薯主要靠枝條捍插進(jìn)行種植，同時(shí)甘薯病毒病通過昆蟲和汁液傳播，因此田間一般都是復(fù)合侵染產(chǎn)生危害。

該研究發(fā)現(xiàn)，“瑪莎莉”甘薯存在6種病毒復(fù)合侵染的現(xiàn)象，對(duì)山東省臨沂市甘薯種植區(qū)采集的4個(gè)疑似病毒病的“瑪莎莉”甘薯樣品分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，檢測(cè)到馬鈴薯Y病毒屬已知病毒SPFMV、SPLV、SPVG、SPVC和SPV2以及菜豆金色黃花葉病毒屬的SPLCV。對(duì)已知病毒分別進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在3個(gè)樣品中6種病毒均存在，1個(gè)樣品中含有除SPV2、SPLCV的4種病毒，RT-PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果保持一致。根據(jù)CP序列可將SPFMV分為EA、O和RC株系，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，獲得的SPFMV屬于SPFMVRC株系，檢測(cè)到的SPLCVSPV2和SPVC與中國(guó)分離物的親緣關(guān)系最近，檢測(cè)到的SPVG與CH1株系的親緣關(guān)系最近，而SPLV分離物地區(qū)之間的親緣差異比較大，檢測(cè)到的SPLV與KP115613關(guān)系最近。

甘薯病毒復(fù)合侵染的組合類型有多種形式，福建省甘薯病毒有12種，其中6種病毒復(fù)合侵染的比例僅占 2.88% ，云南省甘薯病毒多數(shù)為2＼～5種病毒復(fù)合侵染，江蘇省存在10種 RNA病毒，并以3＼～5種RNA病毒復(fù)合侵染為主[2I-23]。在山東省甘薯病毒調(diào)查中，最多發(fā)現(xiàn)6種病毒復(fù)合侵染的組合[24]，其中 SPV2、SPFMV、SPLV和SPVG 在該研究中也被檢測(cè)到。因此，在“瑪莎莉”的種植過程中，要注意使用脫毒種苗，保證甘薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展，同時(shí)，病毒病的鑒定為“瑪莎莉”甘薯的脫毒工作和病毒防控提供了理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

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