過(guò)表達(dá)NtMYC2對(duì)煙草多酚物質(zhì)合成及鹽脅迫抗性的影響

中圖分類號(hào)：S572.03 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-5119（2025）03-0029-08

Effects of NtMYC2 Overexpression on Polyphenol Synthesis and Salt Stress Resistance in Tobacco

QU Xiaoling， CHEN Shuai， LI Xiuchun， YANG Aiguo， REN Min， TONG Ying， WU Xiuming， SUN Yangyang （Institute of Tobacco Research， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Qingdao 266101， China）

Abstract：InthisstudytheNtMC2transeriptionfactorwassuccefullylonedviaomologousconing.Toanalyzeitsbological functionsinpolyphenolbiosynthesisandsaltstressresistance，weemployedRealtimePCRtoanalyzeitsregulatoryefecton NtCHS1，a keyrate-limitingenzymegeneinflavonoid biosynthesis.NtMYC2-overexpressionlines wereconstructed，andthe diferences inpolyphenolicsubstancesandkeyenzymegenesbetweetheNMYC2-overexpresionlinesandthewild-typelineswere analyzed.ThegerminationrateandresistancephysiologicalindicatorsoftobaccoseedsundersaltstresswerealsodeterminedThe results showed that NtMYC2transcription factorlocalizes tothenucleusandfunctionsasapositiveregulator，ativatingthe transcriptionalactivityofthe NCHS1gene promoter.Overexpressionof NMYC2 significantlyupregulated theexpressonlevelof severalkeystructuralenzymegenes involved inpolyphenolsbiosynthesis pathway，uchasPALandCHS，leadingtosignificantly increasedlevelsofogenccidcorogeicciddtotetinasgicaccoes.rtoredh the wild-type controls，under 100mmol/L NaCl treatment， the germination rate of NtMYC2-overexpressing transgenic lines was significantly increased. Under 200 mmol/L NaCl stress， the MDA and H₂O₂ content of NtMYC2-overexpressing transgenic lines were significantlyrduced，hile teODandAPXactivitiesweresigniicantlyincreased.InummaryNMC2positielygulateskey polyphenolsythesisgenes，enancingthesthesisofpolypheolicsubstances，andpotentiallhacingplatsalttrssistace through improved oxidative stress tolerance.

Keywords： Nicotiana tabacum; NtMYC2; expression regulation; polyphenol synthesis; salt stress resistance

多酚類化合物是一類廣泛存在于植物中的次生代謝物質(zhì)，目前已經(jīng)從植物中分離鑒定出近萬(wàn)種，按結(jié)構(gòu)大致可分為類黃酮、芪類、酚酸類和木酚素類。作為植物體內(nèi)重要的生物活性物質(zhì)，多酚類化合物在植物生長(zhǎng)發(fā)育、色素沉著及抵御多種生物脅迫和非生物脅迫中發(fā)揮重要的功能[1]，并影響煙草生長(zhǎng)發(fā)育、調(diào)制特性、烤后煙葉等級(jí)等，其種類和含量是衡量煙葉品質(zhì)的一個(gè)重要因素[2]。

多酚類化合物的合成起始于苯丙氨酸，經(jīng)苯丙烷代謝途徑和類黃酮代謝途徑生成多酚類物質(zhì)。多酚類物質(zhì)的合成在轉(zhuǎn)錄水平上受多種類型轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，MYB類轉(zhuǎn)錄因子、bHLH類轉(zhuǎn)錄因子、WD40類轉(zhuǎn)錄因子通常形成MBW復(fù)合體行使調(diào)控多酚合成的功能，亦可單獨(dú)行使調(diào)控功能[3]。WRKY類轉(zhuǎn)錄因子如MdWRKY11、WRK-Y71-L、NtWRKY41a等，在煙草綠原酸、類黃酮生物合成中發(fā)揮重要功能[4-5]。與此同時(shí)，上述類型的轉(zhuǎn)錄因子也在鹽脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用[]。Chen等[7]發(fā)現(xiàn) NtMYB4 能夠響應(yīng)高濃度鹽脅迫并調(diào)控類黃酮的生物合成。

MYC2屬于bHLH家族，不僅是植物茉莉酸類激素響應(yīng)途徑中的核心轉(zhuǎn)錄因子，而且能夠響應(yīng)和調(diào)控GA、ABA、SA、ETH和IAA的合成積累，在植物抵御病原菌、病蟲(chóng)害等生物脅迫和增強(qiáng)低溫、冷害、重金屬等非生物脅迫耐受性方面，以及調(diào)控倍半萜、花青素、煙堿等次生代謝物合成方面發(fā)揮重要作用[8]，然而其對(duì)鹽脅迫的抗性鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究克隆到一個(gè)NtMYC2轉(zhuǎn)錄因子，以NtMYC2基因過(guò)表達(dá)和其野生型植株為材料，分析其過(guò)表達(dá)對(duì)煙草中多酚物質(zhì)含量及鹽脅迫下煙草種子發(fā)芽率的影響，并測(cè)定了過(guò)氧化氫 （H₂O₂） 、MDA含量及POD和APX等氧化酶活性，以期為進(jìn)一步研究NtMYC2轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控多酚物質(zhì)合成和鹽脅迫抗性方面的功能，以及煙草品質(zhì)育種研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑

普通煙草紅花大金元（HD）種子由國(guó)家煙草種質(zhì)資源中期庫(kù)（青島）提供，HD幼苗培養(yǎng)于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所遺傳育種中心溫室中。ChamQTM SYBR Color Qpcr Master Mix（Q411-01）、FastPure Plasmid Mini Kit（DC201）、HiScript?Ⅱ 1stStrand cDNA SynthesisKit（+gDNAwiper）、Clon-Express II One Step Cloning Kit（C112-02）、RNATrizol購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司，大腸桿菌Trans-T1、農(nóng)桿菌EHA105購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1NtMYC2基因的克隆使用RNATrizol法提取煙草葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，使用PrimeSTARMax高保真酶及引物對(duì)NtMYC2-F： 5^′ -ATGACGGACTATAGAATACC-3'和 NtMYC2-R： 5^′ -TCATCGCGATTCAGCAATTCTG-3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增NtMYC2基因。反應(yīng)條件： 95°C 預(yù)變性 3min ； 95°C 變性15s ， 52°C 退火 20s ， 72^°C 延伸 50s ，32次循環(huán)；72^°C 延伸 10min 。通過(guò) 1% （質(zhì)量分?jǐn)?shù)）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，隨后將獲得的PCR產(chǎn)物分別與Blunt載體（南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化，挑選陽(yáng)性克隆測(cè)序。

1.2.2NtMYC2轉(zhuǎn)錄因子亞細(xì)胞定位通過(guò)引物對(duì)NtMYC2-YFP-F： 5^′? -ATCTCGAGCTCAAGCTTCGAAATGACGGACTATAGAATACC-3'和INtMYC2-YFP-R： 5^′ -GTACCGTCGACTGCAGAATTCCTCATCGCGATTCAGCAATTCTG-3將NtMYC2基因的CDS全長(zhǎng)序列引入帶有BamHI酶切位點(diǎn)的CPB載體接頭序列。根據(jù)Chen等[9提供的亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建方法及處理方法，進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。

1.2.3NtMYC2 轉(zhuǎn)錄活性分析

（1）GAL4-GUS瞬時(shí)激活/抑制驗(yàn)證系統(tǒng)。利用GAL4-GUS系統(tǒng)分析NtMYC2的轉(zhuǎn)錄活性。首先，利用NtMYC2BD-F：5^′. -CCGAATTCCCGGGGATCATGACGGACTATAGAATACC-3'和 NtMYC2BD-R：5'-CGCTGCAGGTCGACGGATCTCATCGCGATTCAGCAATTCTG-3將NtMYC2基因的CDS全長(zhǎng)序列引入帶有BamHI酶切位點(diǎn)的pGBKT7載體接頭序列，獲得NtMYC2-BD質(zhì)粒。隨后，利用GAL4-BDF 5^′ -CTCGACTCTAGAGGATCCATGAAGCTACTGTCTTCTATCG-3'和 pMDC32-NtMYC2R：5'-ATCGGGGAAATTCGAGCTCTCATCGCGATTCAGCAATTCTG-3'從NtMYC2-BD質(zhì)粒上擴(kuò)增獲得GAL4-NtMY-C2序列。利用同源重組法將GAL4-NtMYC2序列連接到pMDC32載體，獲得pMDC32載體-GAL4-NtMYC2質(zhì)粒。根據(jù)Liu等[0]提供的GAL4-GUS瞬時(shí)激活/抑制驗(yàn)證系統(tǒng)方法，進(jìn)行NtMYC2的瞬時(shí)激活/抑制活性分析。

（2）轉(zhuǎn)錄激活/抑制試驗(yàn)。為分析NtMYC2基因?qū)ζ浜蜻x靶基因NtCHS1基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活/抑制作用，本研究利用引物對(duì)NtCHS1-PM-F：5-CGACTCACTATAGGGCGAATTCCATTTTTAAAAAGTTCATTATACA-3'和 NtCHS1-PM-R： 5^′ -TAGTGGATCCACGCGTGAGCTCTTTCGCCGGAAAAAATGATGGAC-3擴(kuò)增長(zhǎng)度為 1500bp 的NtCHS1基因的啟動(dòng)子序列CHS-pro，通過(guò)酶切連接法將CHS-pro 的序列結(jié)合到轉(zhuǎn)錄激活載體pGreen（Rep-orter質(zhì)粒），與psoup（輔助質(zhì)粒）共轉(zhuǎn)到農(nóng)桿菌中，挑取陽(yáng)性克隆。將NtMYC2基因連接到過(guò)表達(dá)載體pMDC32（Effector質(zhì)粒），轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，同時(shí)將pMDC32空載體、P19分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌并挑取陽(yáng)性克隆。將上述轉(zhuǎn)化成功的陽(yáng)性農(nóng)桿菌單克隆活化培養(yǎng)至OD值為1.0左右時(shí)，按照V（Reporter）：V（Effector）：V（Pl9）=3：3：1 配制農(nóng)桿菌混合液，注射本氏煙葉片。隨后采用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.2.4過(guò)表達(dá)NtMYC2對(duì)多酚物質(zhì)及其合成主要結(jié)構(gòu)基因的影響分析

（1）NtMYC2過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化。在擴(kuò)增NtMYC2基因的上游和下游引物序列中分別引入限制性酶切位點(diǎn)XbaI（TCTAGA）和SacI（GAGCTC），以便構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體。將擴(kuò)增獲得的NtMYC2基因序列與經(jīng)過(guò)XbaI和SacI酶切的pCHF1載體連接，獲得pCHF1-NtMYC2載體。

將煙草種子用 10% 過(guò)氧化氫消毒處理 5min 之后用無(wú)菌水沖洗3＼～5次，吸干水分后，點(diǎn)種于MS培養(yǎng)基中，待無(wú)菌苗長(zhǎng)至4＼～5葉期，取無(wú)菌葉片用于葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化。將含有目的基因的過(guò)表達(dá)載體導(dǎo)入煙草葉片中，經(jīng)組織培養(yǎng)和抗生素抗性篩選，獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。

（2）NtMYC2轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量檢測(cè)。利用Perlprimer軟件設(shè)計(jì)NtMYC2基因的特異擴(kuò)增引物qNtMYC2-F： 5^′ -ATACACCAACTCCACGGAGTTC-3'和qNtMYC2-R： 5^′ -TCCACGCTTCGCGAGCCCCG-3^′ 。以NtMYC2過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系葉片cDNA為模板，煙草Tob103基因（GenBank登錄號(hào)為U60495）作為內(nèi)參基因，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)NtMYC2基因的表達(dá)量；利用Takara公司SYBR？PremixExTaqTM（TliRNaseHPlus）（RR420A）熒光定量試劑盒的說(shuō)明配制qPCR反應(yīng)體系。反應(yīng)程序?yàn)椋?95^°C 30s ，（ 95°15s ， 58°34s）×40 個(gè)循環(huán)。qPCR上機(jī)操作方法參照ABI7500FastReal-TimePCRSystem的操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。每個(gè)反應(yīng)樣品3次生物學(xué)重復(fù)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果選擇MYC2OE-99、MYC2OE-100、MYC2OE-122三個(gè)株系做為后續(xù)試驗(yàn)用植株。

（3）NtMYC2過(guò)表達(dá)植株多酚類物質(zhì)合成主要結(jié)構(gòu)基因測(cè)定。多酚物質(zhì)合成主要結(jié)構(gòu)基因（包括PAL、4CL、CHS、CHI、DFR、FLS、ANS和ANR）的熒光定量引物序列參照Chen等[提供的引物序列，以MYC2OE-99、MYC2OE-100、MYC2OE-122三個(gè)株系的cDNA為模版，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因株系及野生型株系體內(nèi)結(jié)構(gòu)酶基因的表達(dá)量，反應(yīng)體系及分析方法同“NtMYC2轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量檢測(cè)”所述方法。

（4）NtMYC2過(guò)表達(dá)對(duì)煙葉多酚類物質(zhì)合成的影響。野生HD及NtMYC2過(guò)表達(dá)的T3代轉(zhuǎn)基因株系在人工氣候室條件下培養(yǎng)至5＼～6葉期，取第3＼～4葉位的葉片用于測(cè)定其綠原酸、新綠原酸、蕓香昔等多酚類物質(zhì)含量。

測(cè)定方法：準(zhǔn)確稱取煙草葉片樣品 0.05g 于2mLEP管中，用 1mL1% 鹽酸甲醇溶液提取，每 15min 振蕩1次。 4^°C 下 10000r/min 離心 2min ，上清液通過(guò) 0.2μm 濾膜過(guò)濾到樣品瓶中。吸取10μL 濾液用HPLC（Chromaster5430，日立公司）進(jìn)行分析。HPLC分析程序如下：流動(dòng)相A為水（含 0.2% 乙酸），B為乙腈。梯度洗脫程序： 0～ 2min ， 95%A ； 2～17min ， 95%A～80%A ； 17～ 27min ， 80%A50%A ： 27～7min ， 50%A35%A ：37～42min ， 35%A?5%A ; 42～48min ， 5%A ； 48～ 49min ， 5%A95%A ； 49～57min ， 95%A （平衡）。洗脫柱（型號(hào)為UltimateXB-C18，規(guī)格為 4.6mm× 250mm ， 5μm 溫度 30^°C ，進(jìn)樣量 10μL ，流速1mL/min ，檢測(cè)波長(zhǎng) 354nm 。每個(gè)樣品3次生物學(xué)重復(fù)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：多酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參照標(biāo)準(zhǔn)YC/T202—2006《煙草及煙草制品多酚類化合物綠原酸、茛蓉亭和蕓香苷的測(cè)定》。

1.2.5NtMYC2對(duì)煙草耐鹽脅迫抗性的影響

（1）NtMYC2鹽脅迫處理下種子發(fā)芽率統(tǒng)計(jì)。在一次性無(wú)菌培養(yǎng)皿中鋪兩張滅菌濾紙，鹽脅迫處理用3mL 滅菌的 100mmol/LNaCl 溶液將濾紙完全打濕，對(duì)照處理用 3mL 無(wú)菌水將濾紙完全打濕。將NtMYC2過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系種子與野生型對(duì)照種子分別點(diǎn)種于培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿中點(diǎn)種50粒，每個(gè)處理3次重復(fù)。以露白作為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，從點(diǎn)種后第4天開(kāi)始每天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，并于第10天拍照采集圖像。

（2）鹽脅迫下NtMYC2基因的表達(dá)模式及抗性生理指標(biāo)測(cè)定。以溫室中長(zhǎng)至3＼～4片真葉的煙草幼苗作為試驗(yàn)材料，利用 200mmol/L 的NaCl溶液澆灌處理，于處理后0、1、 12h 取第二葉位幼嫩葉片樣品，提取RNA，用于分析鹽脅迫處理下NtMYC2基因的表達(dá)模式；于0、24、 48h 取第三葉位葉片樣品，用于檢測(cè)過(guò)氧化氫 （H₂O₂） ）、MDA、POD和APX含量。每個(gè)樣品3次生物學(xué)重復(fù)。

H₂O₂ 、MDA、POD和APX等生理指標(biāo)的含量測(cè)定采用可見(jiàn)分光光度計(jì)參照蘇州科銘生物技術(shù)有限公司提供的相應(yīng)測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel整理與統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，顯著性水平采用t-test統(tǒng)計(jì)方法。

2結(jié)果

2.1NtMYC2轉(zhuǎn)錄因子的克隆、亞細(xì)胞定位及轉(zhuǎn)錄活性分析

以紅花大金元（HD）的cDNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行高保真PCR擴(kuò)增，獲得全長(zhǎng)為1977bp的NtMYC2基因的CDS序列。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，NtMYC2轉(zhuǎn)錄因子定位于細(xì)胞核內(nèi)（圖1A）。瞬時(shí)表達(dá)NtMYC2基因能夠顯著提高GAL4-GUS瞬時(shí)轉(zhuǎn)錄激活/抑制系統(tǒng)的GUS基因的表達(dá)，推測(cè)煙草NtMYC2為正向調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子（圖1B）。為進(jìn)一步分析NtMYC2轉(zhuǎn)錄因子對(duì)類黃酮合成限速酶基因NtCHS1的調(diào)控模式，開(kāi)展了瞬時(shí)轉(zhuǎn)錄激活/抑制試驗(yàn)。結(jié)果顯示，連接有NtMYC2的Effector與空載Effector相比，Luc熒光強(qiáng)度上升了2.5倍（圖1C），說(shuō)明NtMYC2能夠顯著激活NtCHS1基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。綜合上述研究結(jié)果表明NtMYC2可能作為正向調(diào)控因子調(diào)控NtCHS1基因的轉(zhuǎn)錄活性。

注：A為亞細(xì)胞定位結(jié)果；B為USA/GAL4-GUS系統(tǒng)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄活性結(jié)果；C為雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)瞬時(shí)轉(zhuǎn)錄激活水平結(jié)果。**代表 plt;0.01 下同。

2.2NtMYC2過(guò)表達(dá)對(duì)多酚物質(zhì)合成相關(guān)酶基因表達(dá)的影響

通過(guò)篩選獲得3個(gè)表達(dá)量較高的轉(zhuǎn)基因株系MYC2OE-99、MYC2OE-100和 MYC2OE-122，其NtMYC2表達(dá)量較野生型提高17＼～146倍不等（圖2）。以上3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系作為后續(xù)功能研究分析的轉(zhuǎn)基因材料。為檢測(cè)NtMYC2是否調(diào)控?zé)煵荻喾宇愇镔|(zhì)合成途徑結(jié)構(gòu)酶基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)對(duì)NtMYC2過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的苯內(nèi)烷代謝途徑和類黃酮代謝途徑主要結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明：與野生型煙草相比，在NtMYC2過(guò)表達(dá)煙草株系中，除部分株系DFR基因表達(dá)量下調(diào)外，其他主要結(jié)構(gòu)基因 ?_PAL 、 4CL 、CHS、CHI、FLS、ANS、ANR）的表達(dá)量均有提高，其中以CHS基因的表達(dá)量上調(diào)最為顯著，上調(diào)了5＼～8倍（圖3）。因此NtMYC2轉(zhuǎn)錄因子可能通過(guò)上調(diào)多酚類物質(zhì)合成途徑的關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，在多酚類物質(zhì)生物合成調(diào)控中發(fā)揮作用。

2.3NtMYC2過(guò)表達(dá)對(duì)煙草多酚類物質(zhì)的影響

由圖4可以看出，3個(gè)NtMYC2過(guò)表達(dá)株系的新綠原酸、綠原酸和蕓香昔含量均顯著升高。相較于野生型，MYC2OE-99、MYC2OE-100和MYC2OE-122新綠原酸含量分別提高了0.57、1.17、1.17倍；綠原酸分別提高了3.62、10.04、1.8倍；蕓香苷含量分別提高了1.402、8.505、0.98倍。試驗(yàn)結(jié)果表明NtMYC2轉(zhuǎn)錄因子在煙草多酚物質(zhì)合成中發(fā)揮重要作用。

2.4NtMYC2在鹽脅迫抗性中的功能分析

研究發(fā)現(xiàn)NtMYC2的表達(dá)量在200mmol/LNaC1處理后顯著上調(diào)（圖5A），說(shuō)明NtMYC2轉(zhuǎn)錄因子可能在煙草抵御鹽脅迫中發(fā)揮一定的作用。為明確NtMYC2在鹽脅迫抗性中的功能，本研究將NtMYC2過(guò)表達(dá)煙草株系和野生型煙草進(jìn)行鹽脅迫下種子發(fā)芽率試驗(yàn)。結(jié)果顯示， 100mmol/L NaC1處理能夠降低野生型煙草和NtMYC2過(guò)表達(dá)煙草株系種子的發(fā)芽率（圖5B）。在清水發(fā)芽試驗(yàn)中，煙草NtMYC2過(guò)表達(dá)株系種子的萌發(fā)時(shí)間與野生型對(duì)照相比提前了2d（圖 5C）。在 100mmol/L NaC1處理下，煙草NtMYC2過(guò)表達(dá)株系種子的萌發(fā)時(shí)間由2d延長(zhǎng)至4d，而野生型對(duì)照由4d延長(zhǎng)至7d；與野生型煙草種子相比，NtMYC2過(guò)表達(dá)株系種子的萌發(fā)時(shí)間提前了約3d（圖5D）。在鹽脅迫處理下，煙草NtMYC2過(guò)表達(dá)株系的發(fā)芽率為71%～84% ，而野生型煙草的發(fā)芽率僅為 18% 。

圖6示出，經(jīng)200mmol/LNaC1處理 24h 后，NtMYC2過(guò)表達(dá)株系的MDA含量顯著低于野生型對(duì)照； H₂O₂ 含量有所降低，但MYC2OE-100、MYC2OE-122兩個(gè)株系的含量與對(duì)照相比未達(dá)到顯著水平；POD活性沒(méi)有顯著變化；APX活性升高，但MYC2OE-100株系的含量與對(duì)照相比未達(dá)到顯著水平。 200mmol/LNaCl 處理 48h 后，過(guò)表達(dá)株系體內(nèi) H₂O₂ 含量和MDA含量顯著低于野生型對(duì)照，POD和APX活性高于野生型對(duì)照，但MYC2OE-99與對(duì)照差異不顯著。說(shuō)明NtMYC2過(guò)表達(dá)植株與野生型相比，具有較好的抗氧化能力。

3討論

MYC2轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控多酚類物質(zhì)合成方面發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，MdMYC2通過(guò)正調(diào)控花青素合成關(guān)鍵基因MdDFR、MdUF3GT、MdF3H、MdCHS而促進(jìn)蘋(píng)果的花青素積累[11]。丹參SmMYC2通過(guò)與SmbHLH60競(jìng)爭(zhēng)來(lái)調(diào)控多酚與花青素生物合成[12]。水稻OsMYC2顯著增強(qiáng)櫻花素合成關(guān)鍵基因OsNOMT的表達(dá)活性，在JA介導(dǎo)的櫻花素生物合成中發(fā)揮重要作用[13]。本研究在煙草中克隆獲得NtMYC2轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)亞細(xì)胞定位、瞬時(shí)轉(zhuǎn)錄激活等試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)NtMYC2為正向調(diào)控因子。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)NtMYC2基因過(guò)表達(dá)后，轉(zhuǎn)基因煙草葉片中多酚合成代謝主要結(jié)構(gòu)酶基因，如NtPAL、Nt4CL、NtCHS、NtCHI、NtFLS等轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量顯著上調(diào)，且新綠原酸、綠原酸、蕓香苷等多酚化合物含量顯著增加，說(shuō)明NtMYC2作為正向調(diào)控因子，參與煙草多酚物質(zhì)的合成調(diào)控。

MYC2在植物抵御非生物脅迫抗性中發(fā)揮重要作用。MYC2可能通過(guò)增強(qiáng)類黃酮生物合成和抗壞血酸氧化還原循環(huán)，正調(diào)節(jié)JA介導(dǎo)的抗蟲(chóng)性和對(duì)氧化脅迫的耐受性[14]。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥WRKY46與MYC2結(jié)合形成WRKY46-MYC2復(fù)合體正向調(diào)控TT4基因和CHIL基因，從而引起類黃酮物質(zhì)，特別是柚皮素的積累，并在植物抗蟲(chóng)方面發(fā)揮重要作用[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸、黃酮醇、花青素等多酚類物質(zhì)可能是通過(guò)其清除活性氧的能力維持鹽脅迫下植物體內(nèi)活性氧的平衡，使植物細(xì)胞免受活性氧的毒害，在鹽脅迫下正常生長(zhǎng)[16-18]。本研究發(fā)現(xiàn)NtMYC2過(guò)表達(dá)煙草株系在鹽脅迫條件下發(fā)芽率顯著高于野生型對(duì)照，且具有較高的氧化酶活性和較低的活性氧水平，推測(cè)NtMYC2可能通過(guò)增強(qiáng)對(duì)氧化脅迫的耐受性，提高了植株的鹽脅迫抗性。

4結(jié)論

本研究通過(guò)同源克隆法，成功克隆到NtMYC2轉(zhuǎn)錄因子。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，NtMYC2轉(zhuǎn)錄因子定位于細(xì)胞核內(nèi)，能夠激活NtCHS1基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，正向調(diào)控多數(shù)多酚生物合成途徑關(guān)鍵酶基因，增強(qiáng)新綠原酸、綠原酸、蕓香苷等多酚類物質(zhì)生物合成。在 100mmol/LNaCl 處理下，NtMYC2基因過(guò)表達(dá)株系的發(fā)芽率顯著高于野生型對(duì)照；在200mmol/LNaCl 處理 48h 后，過(guò)表達(dá)株系體內(nèi)H₂O₂ 含量和MDA含量顯著低于野生型對(duì)照，POD和APX活性高于野生型對(duì)照。綜上，NtMYC2能夠正向調(diào)控NtCHS1基因等結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，引起轉(zhuǎn)基因煙草體內(nèi)多酚類物質(zhì)的顯著積累，并在煙草鹽脅迫抗性中發(fā)揮重要作用。

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