牛蒡子苷元調(diào)節(jié)Hippo信號通路對黑素瘤細(xì)胞化療耐藥性的影響

[摘要]目的：探究牛蒡子苷元（Arctigenin，ARG）對黑素瘤細(xì)胞化療耐藥性的影響以及該過程中對Hippo信號通路的調(diào)節(jié)機(jī)制。方法：利用不同濃度的維莫非尼（Vemurafenib，VEM）持續(xù)培養(yǎng)A375細(xì)胞以獲得耐藥性黑素瘤細(xì)胞株A375/VEM；CCK-8檢測不同濃度VEM對A375和A375/VEM細(xì)胞的增殖活性以及不同濃度ARG對A375/VEM細(xì)胞的毒性；將A375/VEM細(xì)胞分為對照組、VEM組、ARG組、ARG+VEM組、ARG+VEM+Hippo抑制劑組，CCK-8法檢測各組A375/VEM細(xì)胞的存活率；克隆形成實驗檢測各組A375/VEM細(xì)胞的增殖情況；流式細(xì)胞術(shù)檢測各組A375/VEM細(xì)胞的凋亡情況；Western blot檢測各組細(xì)胞中Cyclin D1、ERK1/2、p-ERK1/2、AKT、p-AKT及Hippo途經(jīng)相關(guān)蛋白的表達(dá)；建立耐藥性黑素瘤小鼠移植模型并觀察腫瘤生長情況。結(jié)果：與對照組相比，VEM組、ARG組及ARG+VEM組A375/VEM細(xì)胞的存活率、克隆形成數(shù)量、Cyclin D1、p-ERK1/2、p-AKT、Yes相關(guān)蛋白（Yes-associated protein，YAP）表達(dá)均降低（P＜0.05），且ARG+VEM組低于VEM組和ARG組（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率、LATS1、p-YAP水平升高（P＜0.05），且ARG+VEM組高于VEM組和ARG組（P＜0.05）；與ARG+VEM組相比，ARG+VEM+Hippo抑制劑組A375/VEM細(xì)胞的存活率、克隆形成數(shù)量、Cyclin D1、p-ERK1/2、p-AKT、YAP表達(dá)均升高（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率、LATS1、p-YAP水平降低（P＜0.05）；裸鼠移植瘤體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，ARG+VEM組小鼠腫瘤重量和體積均明顯低于VEM組和ARG組（P＜0.05）；進(jìn)一步加入Hippo途徑的抑制劑，發(fā)現(xiàn)ARG對A375/VEM細(xì)胞耐藥性的抑制作用被逆轉(zhuǎn)（P＜0.05）。結(jié)論：ARG可能是通過激活Hippo途徑來抑制黑素瘤細(xì)胞的化療耐藥性。

[關(guān)鍵詞]牛蒡子苷元（ARG）；黑素瘤細(xì)胞；化療；耐藥性；Hippo信號通路

[中圖分類號]R285" " [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A" " [文章編號]1008-6455（2025）07-0001-06

Impact of Arctigenin on Chemoresistance of Melanoma Cells by Regulating Hippo Signal Pathway

GAO Yang1， DU Ziwei1， WANG Haifei2

（ 1.Department of Dermatology， Hebei College of Traditional Chinese Medicine， Shijiazhuang 050000， Hebei， China; 2.Department of Dermatology， Luanping County Traditional Chinese Medicine Hospital， Chengde 068250， Hebei， China ）

Abstract： Objective" To explore the impact of arctigenin （ARG） on chemoresistance of melanoma cells and its regulation mechanism on Hippo signaling pathway in this process. Methods" The drug resistant melanoma cell line A375/VEM was obtained by continuously culturing A375 cells with different concentrations of vemurafenib （VEM）. CCK-8 was applied to detect the proliferative activity of VEM at different concentrations on A375 and A375/VEM cells， and the toxicity of ARG at different concentrations on A375/VEM cells. A375/VEM cells were grouped into control group， VEM group， ARG group， ARG+VEM group， and ARG+VEM+Hippo inhibitor group， CCK-8 method was applied to detect the survival rate of A375/VEM cells in each group， clone formation experiment was applied to detect the proliferation of A375/VEM cells in each group， flow cytometry was applied to detect the apoptosis of A375/VEM cells in each group. Western blot was applied to detect the expression of Cyclin D1， ERK1/2， p-ERK1/2， AKT， p-AKT， and Hippo pathway related proteins of cells in each group， the transplantation model of drug-resistant melanoma in mice was established， and the tumor growth was observed. Results" Compared with the control group， the survival rate of A375/VEM cells， clone formation quantity， the expression of Cyclin D1， p-ERK1/2， p-AKT， and Yes-associated protein in the VEM group， ARG group， and ARG+VEM group reduced （P＜0.05）， and the ARG+VEM group were lower than the VEM group and ARG group （P＜0.05）， the apoptosis rate， and the levels of LATS1 and p-YAP increased （P＜0.05）， and the ARG+VEM group were higher than the VEM group and ARG group （P＜0.05）. Compared with the ARG+VEM group， the survival rate of A375/VEM cells， clone formation quantity， the expression of Cyclin D1， p-ERK1/2， p-AKT， and YAP in the ARG+VEM+Hippo inhibitor group increased （P＜0.05）， the apoptosis rate， and the levels of LATS1 and p-YAP decreased （P＜0.05）. In vivo experiments on nude mice transplanted with tumor cells showed that the tumor weight and volume in the ARG+VEM group were obviously lower than those in the VEM and ARG groups （P＜0.05）. Further addition of Hippo pathway inhibitors revealed that the inhibitory effect of ARG on drug resistance in A375/VEM cells was reversed （P＜0.05）. Conclusion" ARG may inhibit the chemoresistance of melanoma cells by activating Hippo pathway.

Key words： arctigenin（ARG）; melanoma cells; chemotherapy; resistance; hippo signaling pathway

黑素瘤主要是黑素細(xì)胞發(fā)展而來，紫外線輻射通過其對皮膚的有害影響和直接的DNA損傷而成為皮膚黑素瘤形成的主要因素，加速腫瘤發(fā)生[1-2]。據(jù)了解，BRAF基因突變是黑素瘤最常見的突變，BRAF抑制劑維莫非尼（Vemurafenib，VEM）已被用于黑素瘤的治療，但化療后會產(chǎn)生的耐藥性[3]。Hippo途徑是一種腫瘤抑制途徑，其失調(diào)會導(dǎo)致下游效應(yīng)子轉(zhuǎn)錄輔調(diào)節(jié)蛋白Yes相關(guān)蛋白（Yes-associated protein，YAP）和具有PDZ結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄輔激活因子（Transcriptional co-activator with PDZ-binding motif，TAZ）過度激活并促進(jìn)癌癥的發(fā)展和進(jìn)展，包括皮膚癌[4]。有研究已經(jīng)證明，Hippo腫瘤抑制通路的激活促進(jìn)了黑素細(xì)胞生長停滯[5]。牛蒡子苷元（ARG）是從牛蒡子的種子中分離的活性成分，具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)以及對乳腺癌、卵巢癌等多種癌癥的抗腫瘤作用[6-7]，同時另一項研究發(fā)現(xiàn)ARG可在微環(huán)境應(yīng)激條件下抑制結(jié)腸癌細(xì)胞對依托泊苷的耐藥性[8]。但其對黑素瘤細(xì)胞以及耐藥性的作用尚未明確。因此，本研究旨在探討ARG對黑素瘤細(xì)胞耐藥性的影響以及該過程中的具體作用機(jī)制。

1" 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物和細(xì)胞：SPF級BALB/c Nude裸鼠，雌性，6周齡，（18±2）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2021-0011，將裸鼠在溫度24℃～26℃，濕度60%的環(huán)境中適用性飼養(yǎng)1周。人惡性黑素瘤細(xì)胞A375購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.2 主要試劑和儀器：牛蒡子苷元（純度：HPLC≥98%）購自四川省維克奇生物科技有限公司；維莫非尼片（規(guī)格：240毫克/片），國藥準(zhǔn)字HJ20170124；CCK-8細(xì)胞增殖/毒性檢測試劑盒購自艾美捷科技有限公司，貨號KTC011001；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海弗元生物科技有限公司，貨號FY600003；Cyclin D1、ERK1/2、p-ERK1/2、LATS1、YAP、p-YAP兔單抗及AKT、p-AKT兔多抗購自英國abcam公司，貨號ab134175、ab184699、ab278538、ab243656、ab52771、ab76252、ab8805、ab38449；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）購自上海和元李記生物技術(shù)有限公司，貨號AP31L014。SpectraMax Gemini EM熒光酶標(biāo)儀購自上海美谷分子儀器有限公司；奧林巴斯CKX53倒置顯微鏡購自上海儀景通光學(xué)科技有限公司；BD FACS Canto II流式細(xì)胞儀購自上海遠(yuǎn)耀生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：將A375細(xì)胞接種至含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素混合液的DEME培養(yǎng)基中，并放置在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d換一次液并傳代。隨后為了獲得VEM耐藥性細(xì)胞株A375/VEM，將A375細(xì)胞系以1×104個細(xì)胞/毫升的密度接種在60 mm的培養(yǎng)皿中，用1μM濃度的VEM處理細(xì)胞6周，每3 d處理一次，然后將VEM的濃度增加至2μM，同樣每3 d處理細(xì)胞一次，持續(xù)6周以獲得耐藥性細(xì)胞株A375/VEM。接著將VEM的濃度增加至5μM，每周處理細(xì)胞兩次以保持耐藥性。A375/VEM細(xì)胞的培養(yǎng)方式與A375細(xì)胞相同，使用第3代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.2 CCK-8檢測VEM對A375和A375/VEM細(xì)胞的增殖活性：將A375和A375/VEM細(xì)胞分別接種至96孔板中（1×104個細(xì)胞/孔），然后用濃度為0.1、0.5、1、5、10、20μM的VEM處理A375細(xì)胞和A375/VEM細(xì)胞，每孔100μl。同時設(shè)立未用VEM處理的對照組，24 h后，每孔加入10 μl的CCK-8溶液在37℃下繼續(xù)孵育4 h，使用酶標(biāo)儀檢測490 nm處的吸光度（OD值），并計算細(xì)胞存活率及半數(shù)抑制濃度IC50。細(xì)胞存活率（%）=（ODVEM處理組-OD空白組）/（OD對照組-OD空白組）×100%。

1.2.3 CCK-8檢測ARG對A375/VEM細(xì)胞的毒性：將A375/VEM細(xì)胞接種至96孔板中（1×104個細(xì)胞/孔），隨后用不同濃度（1、2.5、5、10、20、40 mg/L）的ARG[7]處理細(xì)胞，同樣設(shè)置未做任何處理的對照組，24 h后按照1.2.2的實驗方法計算細(xì)胞存活率及半數(shù)抑制濃度IC50。

1.2.4 A375/VEM細(xì)胞分組及處理：將A375/VEM細(xì)胞分為對照組、VEM組、ARG組、ARG+VEM組、ARG+VEM+Hippo抑制劑組。VEM組細(xì)胞用1μM的VEM培養(yǎng)，ARG組細(xì)胞用20 mg/L的ARG培養(yǎng)，ARG+VEM組細(xì)胞先后依次加入20 mg/L的ARG和1μM的VEM進(jìn)行共培養(yǎng)，ARG+VEM+Hippo抑制劑組細(xì)胞先用Hippo抑制劑XMU-MP-1處理30 min[9]，然后再加入20 mg/L ARG和1μM VEM進(jìn)行培養(yǎng)。48 h后按照1.2.2的方法檢測各組A375/VEM細(xì)胞的存活率。

1.2.5 克隆形成實驗檢測各組A375/VEM細(xì)胞的增殖情況：將A375/VEM細(xì)胞接種在6孔板中（1×103個細(xì)胞/孔），以1.2.4的分組培養(yǎng)細(xì)胞，14 d后，棄去培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，并用0.1%結(jié)晶紫染色。1 h后，PBS洗滌細(xì)胞，在顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的克隆形成情況，并對克隆細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組A375/VEM細(xì)胞的凋亡情況：將A375/VEM細(xì)胞接種至6孔板中（1×105個細(xì)胞/孔），以1.2.4的分組培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞用預(yù)冷的PBS沖洗并用1×結(jié)合緩沖液重懸，然后依次加入5μl Annexin V-FITC和5μl PI在室溫下避光孵育15 min，使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況，并計算細(xì)胞凋亡率。

1.2.7 Western blot檢測各組細(xì)胞中Cyclin D1、ERK1/2、p-ERK1/2、AKT、p-AKT及Hippo途經(jīng)相關(guān)蛋白的表達(dá)：收集按1.2.4分組培養(yǎng)48 h后的A375/VEM細(xì)胞，PBS洗滌后加入蛋白裂解液提取蛋白，并用BCA檢測蛋白濃度。將變性后的蛋白在10% SDS-PAGE中電泳分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜在5%脫脂牛奶中封閉1 h，TBST清洗后與一抗（Cyclin D1、ERK1/2、p-ERK1/2、YAP、p-YAP比例1∶10 000，AKT、p-AKT比例1∶500，LATS1比例1∶1 000）在4℃冰箱中孵育過夜再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二級抗體（1∶3 000）在室溫下孵育1 h，TBST洗滌后用ECL試劑避光孵育10 min，最后蛋白質(zhì)凝膠成像系統(tǒng)中檢測蛋白表達(dá)并拍照，使用Image J軟件對蛋白灰度值進(jìn)行分析。

1.2.8 移植瘤小鼠模型的建立：將按1.2.4分組培養(yǎng)48 h后A375/VEM細(xì)胞重懸并調(diào)整至密度為2×106個細(xì)胞/毫升，將小鼠隨機(jī)分為對照組、VEM組、ARG組、ARG+VEM組、ARG+VEM+Hippo抑制劑組，每組6只。然后按分組皮下注射1 ml細(xì)胞懸液至無胸腺裸鼠的右前肢下以形成異種移植腫瘤，每天觀察腫瘤生長情況，并利用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），每周測量3次，并計算腫瘤體積（V），V（mm3）=（ab2）/2。3周后，將所有小鼠用1%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉后斷頸處死，取出腫瘤組織并稱重。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析：Graphpad prism 8.0軟件對數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以表示，兩組比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩多重比較采用Tukey's檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2" 結(jié)果

2.1 不同濃度VEM對A375和A375/VEM細(xì)胞增殖的影響：0.1、0.5、1、5、10、20μM VEM處理后的A375細(xì)胞存活率低于未處理組（P＜0.05），1、5、10、20μM VEM處理后A375/VEM細(xì)胞存活率低于未處理組（P＜0.05），且同一濃度下的A375細(xì)胞的存活率明顯低于A375/VEM細(xì)胞（P＜0.05）；A375/VEM細(xì)胞的IC50（56.76μM）明顯高于A375細(xì)胞的IC50（1.40μM）。其中VEM濃度為1μM時對A375/VEM細(xì)胞有較小的抑制作用，因此后續(xù)實驗選擇1μM的VEM，見表1。

2.2 不同濃度ARG對A375/VEM細(xì)胞增殖的影響：與未處理組相比，2.5、5、10、20、40 mg/L ARG處理后的A375/VEM細(xì)胞存活率降低（P＜0.05）；且ARG處理A375/VEM細(xì)胞48 h后的IC50為20.05 mg/L。因此，本實驗選擇濃度為20 mg/L作為后續(xù)實驗ARG處理細(xì)胞的最佳濃度，見表2。

2.3 ARG對各組A375/VEM細(xì)胞存活率及克隆形成能力的影響：與對照組相比，VEM組、ARG組和ARG+VEM組細(xì)胞的存活率和克隆形成數(shù)量均降低（P＜0.05），且ARG+VEM組細(xì)胞存活率和克隆形成數(shù)量低于VEM組和ARG組（P＜0.05）；與ARG+VEM組相比，ARG+VEM+Hippo抑制劑組細(xì)胞的存活率和克隆形成數(shù)量升高（P＜0.05），見圖1、表3。

2.4 ARG對各組A375/VEM細(xì)胞凋亡的影響：與對照組相比，VEM組、ARG組和ARG+VEM組細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05），且ARG+VEM組細(xì)胞凋亡率高于VEM組和ARG組（P＜0.05）；與ARG+VEM組相比，ARG+VEM+Hippo抑制劑組細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05），見圖2、表4。

2.5 ARG對各組A375/VEM細(xì)胞中Cyclin D1和ERK1/2、AKT及其磷酸化蛋白表達(dá)的影響：與對照組相比，VEM組、ARG組和ARG+VEM組細(xì)胞中Cyclin D1、p-ERK1/2、p-AKT表達(dá)均降低（P＜0.05），且ARG+VEM組Cyclin D1、p-ERK1/2、p-AKT表達(dá)低于VEM組和ARG組（P＜0.05）；與ARG+VEM組相比，ARG+VEM+Hippo抑制劑組細(xì)胞中Cyclin D1、p-ERK1/2、p-AKT表達(dá)均升高（P＜0.05），見圖3、表5。

2.6 ARG對各組A375/VEM細(xì)胞中Hippo途經(jīng)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響：與對照組相比，VEM組、ARG組和ARG+VEM組細(xì)胞中LATS1、p-YAP表達(dá)升高，YAP表達(dá)降低（P＜0.05），且ARG+VEM組LATS1、p-YAP表達(dá)高于VEM組和ARG組，YAP表達(dá)低于VEM組和ARG組（P＜0.05）；與ARG+VEM組相比，ARG+VEM+Hippo抑制劑組細(xì)胞中LATS1、p-YAP表達(dá)降低，YAP表達(dá)升高（P＜0.05），見圖4、表6。

2.7 ARG對移植瘤小鼠的腫瘤生長情況的影響：與對照組相比，VEM組、ARG組和ARG+VEM組小鼠的腫瘤組織重量、體積均減小（P＜0.05），且ARG+VEM組腫瘤重量和體積均小于VEM組和ARG組（P＜0.05）；與ARG+VEM組相比，ARG+VEM+Hippo抑制劑組腫瘤組織重量、體積均升高（P＜0.05），見表7。

3" 討論

黑素瘤仍然是皮膚癌導(dǎo)致死亡的主要原因，易發(fā)生轉(zhuǎn)移和侵襲，且發(fā)病率和死亡率逐年升高。BRAF突變黑素瘤占黑素瘤患者的50%以上，其中V600E突變占70%～90%[10]。目前，BRAF抑制劑VEM被批準(zhǔn)用于黑素瘤治療，主要通過特異性靶向V600E突變的BRAF，顯示出明顯的抗腫瘤活性，并提高了BRAF V600E突變黑素瘤患者的存活率[11]。盡管VEM具有快速的療效和良好的反應(yīng)率，但大多數(shù)黑素瘤患者在治療8～9個月后出現(xiàn)腫瘤耐藥性，嚴(yán)重影響了患者的生存和預(yù)后[12]。因此，克服BRAF抑制劑耐藥性對提高患者存活率具有重要意義。本研究利用VEM持續(xù)誘導(dǎo)獲得人黑素瘤耐藥細(xì)胞株A375/VEM，并通過不同濃度的VEM分別處理A375和A375/VEM細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VEM處理后A375細(xì)胞的IC50明顯低于A375/VEM細(xì)胞，提示A375/VEM細(xì)胞對VEM的敏感性降低，VEM耐藥性黑素瘤細(xì)胞株A375/VEM誘導(dǎo)成功。

ATG是牛蒡的主要活性成分，已被證明具有較強(qiáng)的抗癌活性，該活性主要歸因于在乳腺癌、肺癌和結(jié)腸癌等癌細(xì)胞中誘導(dǎo)由線粒體破壞和細(xì)胞周期停滯介導(dǎo)的凋亡[13]。研究顯示ATG可通過激活自噬來增強(qiáng)結(jié)直腸癌順鉑耐藥細(xì)胞的敏感性[14]。但對黑素瘤細(xì)胞耐藥性的作用還未了解。本研究結(jié)果顯示，與對照組和VEM組相比，ARG處理A375/VEM細(xì)胞后存活率、克隆形成數(shù)量降低，細(xì)胞凋亡率升高，而ARG和VEM共同處理細(xì)胞后存活率、克隆形成數(shù)量明顯低于ARG組，凋亡率高于ARG組，提示ARG能夠提高A375/VEM耐藥細(xì)胞對VEM的敏感性，即抑制其耐藥性。

據(jù)報道，BRAF是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑中的關(guān)鍵蛋白，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡等功能[11]。已知MAPK/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）途徑和磷酸肌醇3-激酶（PI3K）-AKT途徑的再激活是BRAF抑制劑耐藥的分子機(jī)制[15]。細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）是由CCND1基因編碼的一種重要的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，研究顯示Cyclin D1的過度表達(dá)可能使BRAF突變的黑素瘤細(xì)胞對VEM產(chǎn)生耐藥性[16]。本研究結(jié)果顯示，ARG組A375/VEM細(xì)胞中Cyclin D1、p-ERK1/2、p-AKT表達(dá)低于VEM組，而ARG+VEM組細(xì)胞中Cyclin D1、p-ERK1/2、p-AKT表達(dá)低于ARG組，揭示了ARG可以抑制Cyclin D1蛋白的表達(dá)，同時可以抑制MAPK/ERK和PI3K/AKT通路激活，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖及對VEM的耐藥性。

Hippo途徑是一個進(jìn)化上保守的級聯(lián)，該途徑核心成分包括絲氨酸/蘇氨酸激酶（Mammalian sterile 20 like kinase，MST1/2）、大腫瘤激活因子1/2（Large tumor suppressor kinase，LATS1/2）和主要下游介體YAP/TAZ。MST和LATS兩種激酶的激活導(dǎo)致YAP/TAZ磷酸化，限制了它們的穩(wěn)定性、核定位和轉(zhuǎn)錄活性[17]。在BRAFV600E突變的黑素瘤細(xì)胞系中延長VEM治療可誘導(dǎo)肌動蛋白細(xì)胞骨架重塑，增加YAP核定位并促進(jìn)耐藥性和癌細(xì)胞活力[18]。因此，YAP的核定位被認(rèn)為是癌癥患者的不良預(yù)后。為了防止YAP的增殖活性，通過激活Hippo途徑中LATS1，隨后磷酸化途徑效應(yīng)子YAP，并驅(qū)動YAP從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中滯留和降解[19]。研究顯示，泛素特異性肽酶22的過表達(dá)導(dǎo)致黑素瘤中YAP蛋白水平升高，促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞對VEM的耐藥性[20]。本研究結(jié)果顯示，ARG組A375/VEM細(xì)胞中LATS1和p-YAP水平高于VEM組，YAP表達(dá)低于VEM組，而ARG+VEM組細(xì)胞中LATS1和p-YAP水平高于ARG組，YAP表達(dá)低于ARG組，揭示了ARG可以通過激活耐藥細(xì)胞A375/VEM中的Hippo途徑中LATS1的表達(dá)，促進(jìn)YAP的磷酸化，進(jìn)而使YAP降解并失活。為了明確Hippo途徑在ARG抑制A375/VEM細(xì)胞耐藥性過程中的作用，進(jìn)一步加入Hippo途徑的抑制劑，結(jié)果顯示ARG對A375/VEM細(xì)胞耐藥性的抑制作用被逆轉(zhuǎn)，提示了ARG抑制黑素瘤細(xì)胞耐藥性的作用機(jī)制可能與Hippo信號通路被激活有關(guān)。最后本研究通過裸鼠移植瘤實驗，進(jìn)一步驗證了ARG可以抑制體內(nèi)黑素瘤細(xì)胞對VEM的耐藥性。

綜上所述，ARG可能是通過激活Hippo途徑來抑制黑素瘤細(xì)胞的耐藥性。本研究為黑素瘤細(xì)胞對BRAF抑制劑的耐藥性提供了新的治療藥物和抗耐藥機(jī)制。但黑素瘤細(xì)胞的耐藥機(jī)制比較復(fù)雜，本研究僅選擇一種BRAF抑制劑進(jìn)行實驗，關(guān)于黑素瘤細(xì)胞對其他化療藥物的耐藥性還需更多的研究進(jìn)行探索。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Teixido C， Castillo P， Martinez-Vila C， et al. Molecular markers and targets in melanoma[J]. Cells， 2021，10（9）：2320.

[2]Barreno A， Orgaz J L. Cytoskeletal remodelling as an Achilles' Heel for therapy resistance in melanoma[J]. Cells， 2022，11（3）：518.

[3]Dratkiewicz E， Simiczyjew A， Pietraszek-Gremplewicz K， et al. Characterization of melanoma cell lines resistant to vemurafenib and evaluation of their responsiveness to EGFR- and MET-inhibitor treatment[J]. Int J Mol Sci， 2019，21（1）：113.

[4]Howard A， Bojko J， Flynn B， et al. Targeting the Hippo/YAP/TAZ signalling pathway： Novel opportunities for therapeutic interventions into skin cancers[J]. Exp Dermatol， 2022，31（10）：1477-1499.

[5]Vittoria M A， Kingston N， Kotynkova K， et al. Inactivation of the Hippo tumor suppressor pathway promotes melanoma[J]. Nat Commun， 2022，13（1）：3732.

[6]Shi H， Zhao L， Guo X， et al. Arctigenin attenuates breast cancer progression through decreasing GM-CSF/TSLP/STAT3/β-Catenin signaling[J]. Int J Mol Sci， 2020，21（17）：6357.

[7]趙佼，王丹波.牛蒡子苷元通過調(diào)控miR-1靶向干預(yù)磷酸戊糖途徑對人卵巢癌SKOV3細(xì)胞的影響[J].中國病理生理雜志，2023，39（3）：487-495.

[8]Yoon S B， Park H R. Arctigenin inhibits etoposide resistance in HT-29 colon cancer cells during microenvironmental stress[J]. J Microbiol Biotechnol， 2019，29（4）：571-576.

[9]王自闖，張娟，陳小永.白花蛇舌草提取物通過Hippo-YAP信號通路抑制胰腺癌SW1990細(xì)胞上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化[J].中國免疫學(xué)雜志，2020，36（16）：1957-1961.

[10]Radi R， Huang C， Elsey J， et al. Indolium 1 exerts activity against vemurafenib-resistant melanoma in vivo[J]. Antioxidants （Basel）， 2022， 11（5）：798.

[11]Wang L， Otkur W， Wang A， et al. Norcantharidin overcomes vemurafenib resistance in melanoma by inhibiting pentose phosphate pathway and lipogenesis via downregulating the mTOR pathway[J]. Front Pharmacol， 2022， 13：906043.

[12]Tang F， Li S， Liu D， et al. Sorafenib sensitizes melanoma cells to vemurafenib through ferroptosis[J]. Transl Cancer Res， 2020， 9（3）：1584-1593.

[13]Lee K S， Lee M G， Kwon Y S， et al. Arctigenin enhances the cytotoxic effect of doxorubicin in MDA-MB-231 breast cancer cells[J]. Int J Mol Sci， 2020， 21（8）：2997.

[14]Wang Y， Lina L， Xu L， et al. Arctigenin enhances the sensitivity of cisplatin resistant colorectal cancer cell by activating autophagy[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2019，520（1）：20-26.

[15]Tangella L P， Clark M E， Gray E S. Resistance mechanisms to targeted therapy in BRAF-mutant melanoma - A mini review[J]. Biochim Biophys Acta Gen Subj， 2021， 1865（1）：129736.

[16]Wu H Z， Li L Y， Jiang S L， et al. RSK2 promotes melanoma cell proliferation and vemurafenib resistance via upregulating cyclin D1[J]. Front Pharmacol， 2022， 13：950571.

[17]Kang J， Wang J， Yao Z， et al. Fascin induces melanoma tumorigenesis and stemness through regulating the Hippo pathway[J]. Cell Commun Signal， 2018，16（1）：37.

[18]Garcia-Rendueles M E R， Krishnamoorthy G， Saqcena M， et al. Yap governs a lineage-specific neuregulin1 pathway-driven adaptive resistance to RAF kinase inhibitors[J]. Mol Cancer， 2022，21（1）：213.

[19]Ikonomopoulou M P， Fernandez-Rojo M A， Pineda S S， et al. Gomesin inhibits melanoma growth by manipulating key signaling cascades that control cell death and proliferation[J]. Sci Rep， 2018，8（1）：11519.

[20]Wei Y， Jiang Z， Lu J. USP22 promotes melanoma and BRAF inhibitor resistance via YAP stabilization[J]. Oncol Lett， 2021，21（5）：394.

[收稿日期]2023-08-10

本文引用格式：高陽，杜紫微，王海飛.牛蒡子苷元調(diào)節(jié)Hippo信號通路對黑素瘤細(xì)胞化療耐藥性的影響[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2025，34（7）：1-6.