1株人源mcr-1陽性多重耐藥沙門菌的特征分析

中圖分類號：S182 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0488-5368（2025）06-0013-09

Abstract：Salmonella，a zoonotic pathogen， poses a serious threat to human health and the development of animal husbandry. In China，multidrug resistance in Salmonell from both human and animal sources is a severe concern，with potential forcross-transmission.In2019，127 human fecal samples were collected from five hospitals in Henan Province. Salmonella was isolated using SS agar plates supplemented with 2μg/mL colistin and identified via Gram staining，biochemical tests，and PCR amplification targeting the 16S rRNA and invA genes. The presence of the colistin resistance gene mcr-1 was assessed，and antimicrobial susceptibility testing using the microbroth dilution method was conducted to evaluate the strains resistance to 15 commonly used antibiotics. Whole -genome sequencing was performed to analyze the strain’s genetic characteristics.A total of six Salmonella strains were identified （positivity rate： 4.7% ），among which one was mcr -1 -positive. The strain’s MIC for colistin was 8μg/mL . MLST identified the strain as ST34. It harbored multiple resistance genes，including blaTEM-116，bla CTX -M-14，bla OXA -1，oqxAB， tet（A） ， floR，catB3，catA1，sul1，sul2，sul3， （20 ant（3^′′） ，aph ，and dfrA12. The isolate was resistant to colistin，ampicillin，amoxicillin，ceftiofur， ceftazidime，gentamicin，spectinomycin，tetracycline，florfenicol，chloramphenicol，sulfisoxazole，sulfamethoxydiazine，enrofloxacin，and ciprofloxacin.The mcr-1-bearing plasmids were transferable and showed high similarity to previouslyreported IncHl2 plasmids，both in Chinaand abroad.Strengthening infection control measures and rational antibiotic use are esential to delaythe emergence of drug -resistant Salmonella strains.

Key words：Salmonella; Colistin； mcr -1； bla CTX -M-14；Multidrug Resistance

mcr－1陽性多重耐藥沙門菌是一種人畜共患病病原。在動物中，它可以感染多種家畜家禽，如豬、雞、牛等，在動物腸道內(nèi)定植并可導(dǎo)致動物發(fā)病，影響動物健康和養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)。在人與動物接觸過程中，如通過處理受污染的動物產(chǎn)品、接觸感染動物的排泄物等途徑，該病菌可以傳播給人類，使人類患病。其引發(fā)的人畜共患疾病對公共衛(wèi)生安全構(gòu)成一定威脅。腸道沙門菌是人類和動物腸道疾病中最常見的致病微生物之一，可以引起感染性腹瀉、菌血癥和腸炎1，被稱為食源性病原體，這意味著攝入受污染的食物，尤其是動物源性食物，是患者感染沙門菌最重要的因素[2]。世界范圍內(nèi)與耐藥病原體相關(guān)的食源性感染的增加和抗生素耐藥性的傳播是發(fā)達國家和發(fā)展中國家主要關(guān)注的問題之一[3]。無論是何種場合下使用抗生素，包括在家畜中治療疾病和促進生長，都可能導(dǎo)致耐藥細(xì)菌的廣泛傳播[4，5]

越來越多的證據(jù)表明，在動物中使用抗生素促進了沙門菌等多重耐藥人畜共患病原體的出現(xiàn)，從而影響了發(fā)生感染時對人類使用的抗菌藥治療的有效性[6。在過去幾十年中，沙門菌的細(xì)菌耐藥性（AMR）和新發(fā)現(xiàn)的耐藥性基因（ARG）數(shù)量顯著增加[7]。多重耐藥沙門菌對多種抗菌藥物，尤其是頭孢菌素和氟喹諾酮類抗生素的耐藥性可能會影響治療時抗生素的選擇，并降低抗生素的有效性[2.8]。隨著耐藥基因 mcr-1 的出現(xiàn)和傳播，作為對抗革蘭陰性菌感染的最后一道防線的黏菌素，其耐藥性問題也日益凸顯。迄今為止，在許多細(xì)菌物種中發(fā)現(xiàn)了mcr及其變體（ mcr-1 至 mcr-10 ），這包括大腸桿菌、肺炎克雷伯菌以及沙門菌，這表明mcr基因具有廣泛的宿主適應(yīng)性和高度的可轉(zhuǎn)移性[9＼～19]。由于在動物中使用黏菌素作為飼料添加劑， mcr 基因在動物源中普遍存在，并通過攜帶mcr-1質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移從動物傳播到人類和環(huán)境中[9，15，19，20] ○

為了研究人源沙門菌的黏菌素耐藥情況以及mcr-1在醫(yī)院的流行情況，本研究對省幾家醫(yī)院人源糞便樣品進行了沙門菌的分離鑒定并對沙門菌中mcr-1基因的流行情況進行檢測，并測定mcr-1陽性沙門菌的多重耐藥情況，對其耐藥特點和菌株特征進行分析。以期為臨床治療沙門菌感染時抗生素的合理使用，以及有效預(yù)防和控制耐黏菌素沙門菌的傳播提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 2021年從5家醫(yī)院采集

127份人源糞便樣品。

1.1.2抗菌藥物和質(zhì)控菌株本研究中所使用的黏菌素、氟苯尼考、氯霉素、磺胺異惡座和甲氧嘧啶均購自Sigma-Aldrich公司;利福平、氨芐西林、奧格門丁、頭孢噻呋、頭孢他啶、四環(huán)素、美羅培南、慶大霉素、大觀霉素、恩諾沙星和環(huán)丙沙星均購自北京索萊寶科技有限公司；作為質(zhì)控菌株的大腸桿菌ATCC 25922，以及大腸桿菌（Escherichiacoli）C600，均購自中國普通微生物菌種保存中心。1.1.3主要試劑本研究使用的主要試劑包括：LB肉湯、LB瓊脂、SS瓊脂和MHB肉湯培養(yǎng)基，均為青島海博生物技術(shù)有限公司的產(chǎn)品；瓊脂糖和2× EsTaqMasterMix則來自日本Takara公司；革蘭氏染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；沙門氏菌生化鑒定試劑盒為北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院的產(chǎn)品；熒光染料溴化乙錠和細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒則購于賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 方法

1.2.1菌株分離將127份人源糞便病料分別加人 3mL 的LB肉湯， 37^°C 培養(yǎng) 18～20h ，之后劃線于含有 2μg/mL 黏菌素的SS培養(yǎng)基，同樣在 37^°C 下培養(yǎng) 18～20h ，挑取單個菌落接種于LB肉湯中，并放置于搖床進行震蕩培養(yǎng)，持續(xù) 12h ，再次接種于含有 2μg/mL 黏菌素的SS培養(yǎng)基上，進行純化培養(yǎng)直至培養(yǎng)基生長的均為純黑色單菌落。最后，挑取黑色單菌落接種于 3mLLB 肉湯中，并置于 37^°C 搖床中， 180r/min 振蕩培養(yǎng) 18～20h 。

1.2.2提取DNA模板從含有 2μg/mL 黏菌素的SS培養(yǎng)基上挑取黑色單菌落，并將其接種至3mL的LB肉湯中，培養(yǎng) 18～20h，11000r/min 離心 2min 之后收集菌體，充分懸浮于含 200μL TEBufer中，煮沸加熱 10min ，之后再冰浴 5min 11 000r/min 離心 5min ，取上清液即得菌株模板DNA，放于 4^qC 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 菌株鑒定 主要有以下3種方法。

1.2.3.1革蘭氏染色：挑取培養(yǎng)基上可疑菌落，按照文獻報道的方法[21]，制作玻片，最后置于顯微鏡下進行觀察。同時，以參考菌株的革蘭染色觀察結(jié)果作為對照，進行比對分析。

1.2.3.2生化鑒定：從SS平板上挑選黑色單菌落，接種于 3mL 無菌LB肉湯中， 37^qC 培養(yǎng) 16～ ^18h ，用PBS稀釋到105CFU。取 100μL 的菌懸液接種于沙門氏菌生化鑒定試劑盒中的每種微量西林瓶與試管中。接種后，將西林瓶與試管套上膠塞，采用全加塞培養(yǎng)方式，放置于瓶架中， 37^°C 培養(yǎng) 24h 后，觀察培養(yǎng)結(jié)果。

1.2.3.3PCR鑒定：提取分離到的疑似沙門菌的基因組DNA。參考馬彩琿等[22.23]的引物序列、擴增體系和擴增程序，針對沙門菌的特異侵襲基因invA和16SrRNA，使用了北京擎科生物科技有限公司合成的引物序列進行擴增。隨后，對PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。同時將PCR產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司進行測序分析。測序結(jié)果使用DNAstar軟件進行序列分析，然后與NCBI 數(shù)據(jù)庫（htp：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）中沙門菌序列進行BLAST比對與分析。最后，對PCR鑒定為陽性的菌株，進一步采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF/MS）進行鑒定。

1.2.4黏菌素耐藥基因mcr-1的檢測采用PCR擴增技術(shù)，對黏菌素耐藥的沙門菌進行黏菌素耐藥基因mcr-1的檢測，使用表1中引物序列，參考馬彩琿22的擴增體系和程序。對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，之后用凝膠成像系統(tǒng)觀察，拍照并進行分析。PCR檢測呈陽性的產(chǎn)物，將其送至北京擎科生物科技有限公司進行測序分析。最后，將測序結(jié)果提交至NCBI數(shù)據(jù)庫，進行BLAST比對分析。

1.2.5抗生素敏感性測定本研究采用微量肉湯稀釋法，測定了15種常用藥物對mcr-1陽性沙門菌的最小抑菌濃度（MinimumInhibitoryConcentra-tion，MIC），遵循CLSI標(biāo)準(zhǔn)進行藥敏結(jié)果判讀，大腸桿菌ATCC ⑧25922 為質(zhì)控菌株。

1.2.6全基因組測序及分析首先按照試劑盒的說明書提取了菌株的基因組DNA，將提取的DNA樣本送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行測序、拼接組裝、基因預(yù)測及功能注釋。組裝好的全基因組數(shù)據(jù)利用CGE數(shù)據(jù)庫（htps：//cge.cbs.dtu.dk/）進行多位點序列分型（Multilocussequencetyp-ing，MLST）、耐藥基因、耐藥基因環(huán)境分析以及質(zhì)粒復(fù)制子類型預(yù)測。

1.2.7質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移試驗本研究采用具有利福平抗性大腸桿菌（Escherichiacoli）C6OO作為受體菌，用含有黏菌素（ 4μg/mL ）和利福平（400μg/mL ）的麥康凱培養(yǎng)基對轉(zhuǎn)化接合子進行篩選，對于在雙抗板上生長的菌落，使用 mcr-1 引物進行PCR擴增驗證。將供體菌和受體菌分別涂布在同時含有 4μg/mL 黏菌素和 400μg/mL 利福平的雙抗LB培養(yǎng)基上作為陰性對照。

2結(jié)果

2.1 沙門菌的分離與純化

127份人源糞便病料經(jīng)過涂布后有9株在沙門菌選擇培養(yǎng)基SS培養(yǎng)基上長出了黑色圓形菌落，在LB瓊脂上培養(yǎng) 18～24h 后，呈現(xiàn)出表面光滑、半透明、圓形的菌落形態(tài)。

2.2 菌株的鑒定

2.2.1革蘭氏染色和生化鑒定9株疑似沙門菌的革蘭染色結(jié)果均為紅色，在顯微鏡下觀察，菌株呈現(xiàn)為短小、兩端鈍圓的桿菌，少數(shù)成對或短鏈狀排列，表明分離的菌株都為革蘭陰性菌（如圖1）。

生化鑒定結(jié)果如表2，依據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗沙門氏菌檢驗》的標(biāo)準(zhǔn)進行判定，判別菌株 SX1905、SX1914、SX1947、SX1968、SX1991、SX1998為沙門菌。

2.2.2PCR鑒定結(jié)果9份樣品中的6份可以擴增出與陽性對照片段大小一樣的16SrRNA（圖2A）和侵襲基因invA（圖2B）特異性條帶。PCR產(chǎn)物測序結(jié)果經(jīng)DNAstar軟件、NCBI上比對，確認(rèn)6株菌的序列確定屬于沙門菌屬的invA基因和16SrRNA基因。此外，MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果經(jīng)分析后，與數(shù)據(jù)庫中的沙門菌同源性達到 98% 以上。綜上所述，127份人源糞便病料中成功分離出了6株沙門菌：SX1905、SX1914、SX1947、SX1968、SX1991、SX1998。

注：M：DL2O00DNAMarker;1＼～6：疑似沙門菌分離株;N：陰性對照;P：陽性對照。

2.3 mcr-1基因檢測結(jié)果

在成功分離的6株沙門菌中，如圖3所示，只有1株沙門菌，即SX1947能夠擴增出與mcr-1陽性對照匹配的 320bp 的擴增片段。進一步對測序結(jié)果進行序列分析，我們發(fā)現(xiàn)SX1947擴增的mcr-1序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的沙門菌mcr-1序列（GenBank：MN873698）具有高度的同源性，達到了 99% 以上。因此，可以確定沙門菌SX1947為mcr-1陽性菌株。

注：M：DL2000DNAMarker;1：SX1947;N：陰性對照;P：陽性對照。

2.4抗菌藥物敏感性試驗

根據(jù)CLSI-M100-S28判讀標(biāo)準(zhǔn)，黏菌素對菌株SX1947的MIC為 8μg/mL ，對美羅培南敏感，對氨芐西林、奧格門丁、頭孢噻呋、頭孢他啶、慶大霉素、大觀霉素、四環(huán)素、氟苯尼考、氯霉素、磺胺異惡唑、甲氧嘧啶、恩諾沙星、環(huán)丙沙星均為耐藥。具體結(jié)果見表3。

2.5基因組測序及耐藥基因分析

對mcr-1陽性菌株SX1947進行了全基因組測序，基因組大小為 5.299Mb 。分析發(fā)現(xiàn)該菌株為ST34型沙門菌。同時，耐藥基因預(yù)測結(jié)果顯示，SX1947的耐藥表型均可以通過獲得性耐藥基因得到解釋（表3）。另外重要的是，在SX1947內(nèi)鑒定出 mcr-1 導(dǎo)致該菌株對黏菌素產(chǎn)生耐藥性，并且包含有多個編碼超廣譜 β- 內(nèi)酰胺酶（ESBL）的基因 ，氨基糖苷抗生素耐藥基因 aac（3）-Iva，aph（3）- IaΔ?aph（4）Δ-IaΔ?aph（3）Δ-IbΔ?aph（6）Δ-IaaΔ?aac （6） -Ib-cr.aadA2 和 ant（3?） ，氟喹諾酮類抗生素耐藥基因qnrS 2，aac（6）-Ib-cr，oqxA 和oqxB，酰胺醇類抗生素耐藥基因fLoR，磺胺類藥物耐藥基因cmlA1、catA1、catB3、sul1、sul2、sul3和dfrA12，四環(huán)素耐藥基因tet（A）。耐藥質(zhì)粒預(yù)測發(fā)現(xiàn)多個復(fù)制子類型，有IncFII、IncHI2、IncHI2B復(fù)制子，表明沙門菌SX1947含有多個質(zhì)粒。

2.6攜帶 mcr-1 基因的質(zhì)粒及遺傳環(huán)境分析

從表3發(fā)現(xiàn)菌株SX1947對黏菌素耐藥，MIC為 8μg/mL 。通過對SX1947進行了全基因組測序及分析發(fā)現(xiàn)，攜帶 mcr-1 的質(zhì)粒與GenBank數(shù)據(jù)庫中的腸桿菌科細(xì)菌中的幾個質(zhì)粒（NCBI登錄號分別為CP019647.1和CP091599.1）具有較高的同源性（ gt;99% ）。該質(zhì)粒由與質(zhì)粒復(fù)制、轉(zhuǎn)移和穩(wěn)定功能相關(guān)的主干基因和負(fù)責(zé)多重耐藥性的可變區(qū)組成（圖4）。將該序列進行BLAST，與比對到的2個最同源的質(zhì)粒pSTM6-275（CP019647.1）和pR886-2（CP091599.1）進行了比較，2個質(zhì)粒均大于 280kb 。通過分析 mcr-1 的遺傳環(huán)境發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒pSTM6-275序列與SX1947的序列最具有同源性，同源性為 100% （圖5）。質(zhì)粒pR886-2序列不含有mcr-1基因，與本研究的序列的遺傳環(huán)境相同， mcr-1 基因上游是pap2，下游與TnAs1相連。猜測SX1947的mcr-1的序列可能是由質(zhì)粒pR886-2 序列進化而來， mcr-1 跨種屬水平轉(zhuǎn)移到了本研究的質(zhì)粒中。

注：耐藥基因用紅色標(biāo)示;藍色和黃色分別顯示了具有質(zhì)粒轉(zhuǎn)移功能的基因和具有移動元件的基因;其他基因顯示為灰色。

我們針對菌株SX1947進行了接合轉(zhuǎn)移實驗，并對在含有利福平和黏菌素的雙抗板上生長的疑似接合子菌落進行了PCR鑒定，通過測序驗證，發(fā)現(xiàn)擴增出來的 320bp 的基因片段均為mcr-1基因（圖6），這一結(jié)果證實，菌株SX1947中攜帶mcr-1基因的質(zhì)?？梢园l(fā)生接合轉(zhuǎn)移。

注：M：DL2O0ODNAMarker；1-3：疑似接合子的菌落PCR產(chǎn)物；N：陰性對照;P：陽性對照。

3討論

細(xì)菌耐藥性是一個持續(xù)存在的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題。這個問題不僅涉及導(dǎo)致醫(yī)院感染的細(xì)菌，還涉及在社區(qū)中傳播的致病性和非致病性細(xì)菌。醫(yī)院和農(nóng)場使用抗生素而導(dǎo)致多重耐藥菌株（MDR）和泛耐藥菌株的出現(xiàn)越來越多，而全球貿(mào)易和旅行加速了它們的全球傳播[24]。2016年，腸桿菌科新發(fā)現(xiàn)了一種編碼mcr-1介導(dǎo)黏菌素耐藥性的質(zhì)粒，它的存在對抗生素耐藥性的全球?qū)箻?gòu)成了嚴(yán)重威脅[9]。由mcr-1基因所編碼的mcr-1蛋白，作為一種完整的膜蛋白，具有磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶的催化活性。該蛋白能夠通過向脂質(zhì)A添加磷酸乙醇胺的方式，改變脂質(zhì)A的化學(xué)結(jié)構(gòu)，進而降低脂多糖（LPS）與黏菌素之間的結(jié)合親和力[25.26]。而黏菌素被認(rèn)為是治療由多重耐藥革蘭氏陰性菌引起的臨床感染的最后抗生素，尤其是碳青霉烯類耐藥腸桿菌科[27]。然而，由于抗生素的不合理使用促進了mcr基因介導(dǎo)的耐藥菌株的出現(xiàn)和傳播[28.29]。攜帶 mcr-1基因的質(zhì)粒，還有可能攜帶其他抗生素耐藥基因，尤其是ESBL基因blaOXA、blaTEM和blaCTX-M，從而產(chǎn)生對多種抗生素的耐藥性，并導(dǎo)致多重耐藥細(xì)菌在人群中的傳播[29]在已報道的mcr-1介導(dǎo)的黏菌素耐藥菌中，大部分是從動物源中分離出來的，只有少數(shù)是從醫(yī)院感染的住院患者中分離出來的[30.31]。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)攜帶mcr-1的質(zhì)粒似乎僅限于兩種腸桿菌科細(xì)菌（大腸桿菌和肺炎克雷伯菌）。然而，在歐洲以及中國的豬、家禽和醫(yī)院患者中都檢測到了攜帶 mcr-1 的沙門菌[32]

沙門菌是食品安全中的一個常見問題，因為沙門菌經(jīng)常從農(nóng)業(yè)動物和食品傳播給人類，導(dǎo)致大量胃腸炎病例，這些病原體每年造成60方人死亡[33]。美國監(jiān)測顯示，非傷寒沙門菌感染一直是食源性細(xì)菌病原體的主要死因，在5歲兒童中發(fā)病率最高（每10萬名兒童中有69.5例感染）[34，35]此外，多重耐藥沙門菌是抗生素耐藥基因傳播的重要媒介，已成為動物養(yǎng)殖部門的一個嚴(yán)重問題，并對人類構(gòu)成醫(yī)學(xué)威脅。在本研究中，成功分離的1株人源沙門菌SX1947，該菌展示了廣泛的耐藥譜和豐富的耐藥基因。同時我們檢測到了黏菌素耐藥基因mcr-1，以及ESBL基因blaOXA-1、bla-TEM-116和 的存在。這些耐藥基因的共存于染色體或質(zhì)粒上，賦予了細(xì)菌在多種抗生素壓力下的存活能力，并促進了耐藥性基因的傳播。特別重要的是，質(zhì)粒介導(dǎo)的水平轉(zhuǎn)移被認(rèn)為是種內(nèi)、種間和屬間耐藥基因傳播的關(guān)鍵機制。通過質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移實驗，證實了沙門氏菌SX1947中的mcr-1基因能夠水平轉(zhuǎn)移到大腸桿菌C600中，并使其對黏菌素表現(xiàn)出耐藥性。這一發(fā)現(xiàn)揭示了mcr-1 基因在腸桿菌科細(xì)菌之間潛在的水平傳播風(fēng)險。本研究中的沙門菌分離株SX1947與來自其他國家的 TW-Stm6 分離株屬于同一譜系，另外與肺炎克雷伯菌與SX1947的親緣關(guān)系較近，表明mcr-1基因正在跨區(qū)域和跨種屬傳播。

從健康的角度來看，碳青霉烯類耐藥基因與黏菌素耐藥基因 mcr-1 在人源高危克隆菌中的共存將對公共衛(wèi)生構(gòu)成危害。應(yīng)引起重視并加強革蘭陰性菌，尤其是沙門菌對黏菌素和ESBL共同耐藥的監(jiān)測，同時，深入研究 mcr-1 基因傳播的分子流行病學(xué)，為科學(xué)合理使用抗生素治療食源性細(xì)菌病原體感染提供有力的治療依據(jù)，以期有效防止這種黏菌素耐藥表型的進一步流行擴散或引起疫情暴發(fā)。

4結(jié)論

本研究報道了1株mcr-1陽性的多重耐藥人源沙門菌。該菌株表現(xiàn)出對黏菌素、氨芐西林、頭孢噻呋、四環(huán)素和恩諾沙星等多種抗生素的耐藥性，并且攜帶了可移動的黏菌素耐藥基因mcr-1?？紤]到mcr-1陽性沙門菌在禽肉食品和食物鏈中的長期流行，我國面臨的多重耐藥沙門菌感染風(fēng)險顯著增加。因此，應(yīng)加強沙門菌對黏菌素耐藥的監(jiān)測，以及深入研究 mcr-1 傳播的分子流行病學(xué)，對于合理使用抗生素治療細(xì)菌性感染、有效遏制耐藥菌株的流行擴散具有重要意義。

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