高通量測序技術(shù)在豆瓣微生物研究中的應(yīng)用進(jìn)展

Advances in the Application of High-Throughput Sequencing Technology in the Study of Microbial Communities in Douban

ZHAO Lu， XIE Shiling， LI Youyou， LIU Rongjun， SHI Yaoqiang （SichuanWater Conservancy Vocational College， Chengdu 61l231， China）

Abstract： Douban， as a traditional fermented bean product in China， involves a complex microbial community in its fermentation process，which plays a crucial role in the favor， nutritional value，and safetyof the product.This article systematically explains the principles and characteristics of high-throughput sequencing technology，and focuses on exploring its application progress in theanalysis of microbial community diversity，dynamic succession research， functional prediction and metabolic network analysis，as wellas processoptimization and quality control in Douban. Research has shown that high-throughput sequencing technology not only provides strong support for revealing the composition， metabolic functions，and flavor substance formation mechanisms of microorganisms duringthe fermentation processofDouban，but also provides scientific basis foroptimizing fermentationprocesses， improving product quality and safety，and promoting the modernization process of traditional fermented food production.

Keywords： high-throughput sequencing; Douban; microbiology

豆瓣作為一種典型的發(fā)酵食品，是中國傳統(tǒng)豆類發(fā)酵制品的杰出代表。其因風(fēng)味醇厚、紅棕油亮、醬香濃郁等特點，已成為川菜烹飪中必不可少的調(diào)味品，享有“川菜之魂”的美譽[。高通量測序技術(shù)具有無須培養(yǎng)微生物、可高分辨率解析菌群結(jié)構(gòu)和功能基因等優(yōu)勢，在食品微生物研究領(lǐng)域受到了研究人員的廣泛關(guān)注和青睞，已成為該領(lǐng)域的重要研究工具之一[2]。近年來，隨著高通量測序技術(shù)在豆瓣微生物研究中的廣泛應(yīng)用，其在解析豆瓣細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)、豐度及演替規(guī)律方面發(fā)揮了重要作用。同時，結(jié)合頂空固相微萃取-氣相色譜/質(zhì)譜法（HeadspaceSolid-Phase Microextraction-Gas Chromatography/MassSpectrometry，HS-SPME-GC-MS），研究人員能夠深入分析豆瓣中特征揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與優(yōu)勢細(xì)菌群落之間的相關(guān)性。這些技術(shù)手段的應(yīng)用，推動了豆瓣微生物研究從傳統(tǒng)的“經(jīng)驗驅(qū)動”模式向更加精準(zhǔn)的“數(shù)據(jù)驅(qū)動”模式轉(zhuǎn)變，為豆瓣發(fā)酵工藝優(yōu)化和品質(zhì)提升提供了科學(xué)依據(jù)。

1高通量測序技術(shù)概述

1.1高通量測序技術(shù)原理

高通量測序技術(shù)，也被稱為下一代測序（Next-GenerationSequencing，NGS）或大規(guī)模并行測序，是一種能夠在單次運行中同時處理多個樣本的測序技術(shù)。高通量測序技術(shù)是現(xiàn)代基因組學(xué)研究中的核心方法之一，它通過將脫氧核糖核酸（DNA）或互補脫氧核糖核酸（cDNA）進(jìn)行隨機片段化、加接頭和文庫構(gòu)建等步驟，結(jié)合大規(guī)模并行測序技術(shù)對數(shù)以萬計的基因片段進(jìn)行延伸反應(yīng)，并通過檢測信號檢測獲取序列信息。該技術(shù)不僅速度快、效率高，還能夠生成海量的遺傳信息，已被廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品的菌群研究[3]。

1.2 高通量測序技術(shù)特點

高通量測序技術(shù)憑借其卓越的性能，已成為現(xiàn)代生物學(xué)研究中的強大工具。該技術(shù)能夠在單次實驗中同時分析數(shù)百萬甚至數(shù)十億條DNA或RNA序列，其高通量特性使其能夠全面覆蓋復(fù)雜的微生物群落、基因組或轉(zhuǎn)錄組，從而為深入開展遺傳學(xué)分析提供了可能。此外，高通量測序技術(shù)還具備高分辨率的優(yōu)勢，能夠?qū)⑽⑸锶郝滂b定至屬或種水平，甚至可以揭示稀有物種的存在。在基因組學(xué)研究中，高通量測序技術(shù)能夠檢測低頻突變、單核苷酸多態(tài)性以及小片段插入／缺失，從而提供高精度的遺傳信息。相較于傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物研究方法（如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳和實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)），高通量測序技術(shù)的優(yōu)勢在于能夠深人具體的生物學(xué)功能層面，從而提供更為深入和全面的生物學(xué)信息[3]。

2高通量測序技術(shù)在豆瓣微生物研究中的應(yīng)用

豆瓣中的微生物對豆瓣品質(zhì)有著至關(guān)重要的作用，其種類和數(shù)量不僅決定了豆瓣醬的風(fēng)味與口感，還對其安全性產(chǎn)生直接影響。高通量測序技術(shù)作為一種革命性的技術(shù)，突破了傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法僅能從環(huán)境中獲得 1% 左右的微生物的局限性。該技術(shù)可以直接基于樣本的總基因組進(jìn)行分析，無須依賴微生物的培養(yǎng)，從而高效解析微生物群落結(jié)構(gòu)。高通量測序技術(shù)被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵過程的動態(tài)調(diào)控和功能基因的挖掘，成為研究豆瓣微生物代謝和功能不可或缺的技術(shù)手段。近年來，高通量測序技術(shù)在發(fā)酵食品微生物研究中得到了廣泛應(yīng)用，涵蓋了菌群結(jié)構(gòu)動態(tài)變化、功能菌群組成以及微生物代謝能力等多個方面的研究[4

2.1解析群落多樣性

在豆瓣醬的發(fā)酵過程中，多種微生物共同作用，形成了復(fù)雜的微生物群落結(jié)構(gòu)。利用高通量測序技術(shù)對豆瓣中微生物群落進(jìn)行分析已成為豆瓣微生物研究中的重要手段。對樣品中微生物DNA進(jìn)行高通量測序和分析，可以獲取豐富的微生物群落信息，包括微生物種類、數(shù)量和分布情況。劉平等[5利用高通量測序技術(shù)對郫縣豆瓣后發(fā)酵時期的微生物群落進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌群落多樣性指數(shù)初期較高，真菌相對較低，表明細(xì)菌在發(fā)酵初期起主導(dǎo)作用，隨著發(fā)酵進(jìn)程的推進(jìn)，真菌種類和數(shù)量逐漸增加，并對產(chǎn)品的風(fēng)味和品質(zhì)產(chǎn)生重要影響。曾艷[通過利用高通量測序技術(shù)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在整個后發(fā)酵期間，郫縣豆瓣及其紅油制品中細(xì)菌群落的Alpha多樣性指數(shù)顯著高于真菌群落。武亞婷等[利用高通量測序技術(shù)對不同地區(qū)發(fā)酵辣椒醬的真菌和細(xì)菌結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究時也發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌的物種豐度顯著高于真菌。這些研究表明，細(xì)菌在豆瓣發(fā)酵過程中具有更高的物種豐富度和均勻度，從而在微生物群落中占據(jù)主導(dǎo)地位。利用高通量測序?qū)蟀l(fā)酵時期的豆瓣細(xì)菌多樣性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)鄲縣豆瓣后發(fā)酵期涉及57個門、921個屬的細(xì)菌，其中非培養(yǎng)菌占主導(dǎo)地位[]，且混合發(fā)酵階段微生物多樣性顯著高于單一原料階段。利用高通量測序技術(shù)進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)的解析，不僅有助于研究者掌握豆瓣中微生物的群落結(jié)構(gòu)，還為分析不同生產(chǎn)區(qū)域、不同生產(chǎn)原料以及不同加工工藝下的微生物群落差異提供了科學(xué)依據(jù)。

2.2 動態(tài)演替研究

在豆瓣發(fā)酵過程中，微生物數(shù)量和種類會發(fā)生變化，其變化的速度和幅度取決于不同的發(fā)酵條件。高通量測序技術(shù)為研究豆瓣發(fā)酵過程中微生物變化和動態(tài)演替提供了有力的工具和方法。目前，關(guān)于豆瓣中微生物動態(tài)演替的研究主要集中在發(fā)酵時間和空間異質(zhì)性（如發(fā)酵容器或環(huán)境工藝）對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。例如，趙紅宇等[研究發(fā)現(xiàn)，在豆瓣后發(fā)酵階段（1周至6年），腸桿菌科減少，鞘脂單胞菌科和芽孢桿菌科呈現(xiàn)先增后減趨勢。關(guān)統(tǒng)偉等[對郫縣豆瓣全發(fā)酵過程中的細(xì)菌群落演替規(guī)律進(jìn)行了研究，結(jié)果表明郫縣豆瓣中有185個細(xì)菌屬，其中葡萄球菌屬（Staphylococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、片球菌屬（Pediococcus）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和棒狀桿菌屬（Corynebacterium）和芽孢桿菌屬（Bacillus）是豆瓣發(fā)酵的主要優(yōu)勢菌群。通過高通量測序技術(shù)分析豆瓣醬發(fā)酵過程中微生物動態(tài)演替，研究者能夠全面掌握微生物群落的動態(tài)變化，包括微生物的種類、數(shù)量及其分布特征。這一技術(shù)的應(yīng)用揭示了細(xì)菌和真菌在發(fā)酵不同階段的主導(dǎo)作用及其相互關(guān)系。研究表明，細(xì)菌在發(fā)酵過程中具有更高的物種豐富度和均勻度，尤其在發(fā)酵初期占據(jù)主導(dǎo)地位，而真菌隨著發(fā)酵進(jìn)程的推進(jìn)數(shù)量逐漸增加，對風(fēng)味和品質(zhì)的形成起到關(guān)鍵作用。高通量測序技術(shù)的應(yīng)用不僅解析了豆瓣醬發(fā)酵中微生物群落的動態(tài)演替規(guī)律，還為提升產(chǎn)品風(fēng)味與品質(zhì)提供了科學(xué)支撐。

2.3功能預(yù)測與代謝網(wǎng)絡(luò)

高通量測序技術(shù)結(jié)合代謝組學(xué)分析已成為揭示豆瓣微生物功能與食品風(fēng)味關(guān)系的重要手段?；贙EGG和COG數(shù)據(jù)庫的支持，可以預(yù)測微生物發(fā)酵過程中的代謝通路和功能，如碳水化合物代謝、氨基酸合成和酯化反應(yīng)等[。高通量測序技術(shù)與代謝組學(xué)的聯(lián)合應(yīng)用，可深入解析豆瓣醬發(fā)酵中微生物群落與風(fēng)味物質(zhì)的關(guān)聯(lián)。代謝網(wǎng)絡(luò)分析方法通過量化代謝流分布，揭示微生物代謝途徑特征，為優(yōu)化發(fā)酵工藝提供依據(jù)。穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)則通過追蹤代謝物流動，精準(zhǔn)評估代謝通量，從而進(jìn)一步闡明代謝途徑間的動態(tài)聯(lián)系。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，豆瓣中微生物群落結(jié)構(gòu)與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)（如酯類、醇類）之間存在顯著相關(guān)性。例如，通過高通量測序與HS-SPME-GC-MS技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，研究者發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢菌群（如曲霉屬和乳桿菌屬）在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物直接影響豆瓣風(fēng)味[1]。趙紅宇等[8]的研究指出，微生物群落的動態(tài)演替與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的生成密切相關(guān)。這種關(guān)聯(lián)性分析為優(yōu)化發(fā)酵工藝和開發(fā)高品質(zhì)豆瓣產(chǎn)品提供了理論依據(jù)[1]。借助高通量測序技術(shù)的深度解析能力，研究者能夠量化微生物群落的動態(tài)演替及其功能貢獻(xiàn)，從而為優(yōu)化豆瓣醬的生產(chǎn)工藝、提升其風(fēng)味和營養(yǎng)價值提供有力支持。

2.4工藝優(yōu)化與質(zhì)量控制

高通量測序技術(shù)在豆瓣醬工藝優(yōu)化與質(zhì)量控制方面展現(xiàn)出顯著的應(yīng)用潛力。 ① 通過高通量測序監(jiān)測發(fā)酵過程中的關(guān)鍵菌群（如芽孢桿菌屬），能夠精準(zhǔn)調(diào)控發(fā)酵參數(shù)，如溫度和鹽度，從而優(yōu)化發(fā)酵條件[3]。 ② 結(jié)合機器學(xué)習(xí)模型，高通量測序技術(shù)還可用于預(yù)測發(fā)酵終點或識別異常發(fā)酵風(fēng)險。通過分析微生物群落的動態(tài)變化，機器學(xué)習(xí)模型能夠?qū)崟r監(jiān)測發(fā)酵過程中的潛在問題，從而實現(xiàn)精準(zhǔn)的質(zhì)量控制，為傳統(tǒng)發(fā)酵工藝的現(xiàn)代化和標(biāo)準(zhǔn)化提供了有力支持。

3結(jié)語

近年來，高通量測序技術(shù)與代謝組學(xué)、機器學(xué)習(xí)等多學(xué)科的交叉融合，進(jìn)一步拓展了其在傳統(tǒng)發(fā)酵食品領(lǐng)域的應(yīng)用潛力，推動了豆瓣發(fā)酵工藝的現(xiàn)代化和標(biāo)準(zhǔn)化。然而，盡管高通量測序技術(shù)在豆瓣微生物研究中取得了顯著進(jìn)展，但仍存在一些挑戰(zhàn)，如數(shù)據(jù)解讀的復(fù)雜性、微生物功能驗證的技術(shù)困難以及成本效益的平衡等問題。未來，隨著技術(shù)的不斷完善和多組學(xué)技術(shù)的深度融合，高通量測序技術(shù)有望在豆瓣及其他傳統(tǒng)發(fā)酵食品的研究中發(fā)揮更大的作用，為傳統(tǒng)發(fā)酵食品的品質(zhì)提升和工業(yè)化生產(chǎn)提供更有力的支持，進(jìn)一步推動食品微生物學(xué)研究的發(fā)展。

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