紅花木R2R3-MYB基因LcMYB113調(diào)控花青苷合成

中圖分類(lèi)號(hào)：Q943 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1000-3142（2025）06-1137-12

Function of R2R3-MYB gene LcMYB113 on regulating anthocyanin biosynthesis in Loropetalum chinense var. rubrum

LU Peng'，RONG Duoyan’，LIAO Xiaoshan2， XIAO Yangyao’， ZHANG Bangyue ¹ ovincialEngineering Research CenterofLilyGermplasmResourceInnovationandDeep Processing，CollegeofLifeScie Chemistry，HunanUniversityof Technology，Zhuzhou 412OO7，Hunan，China；2.Zhuzhou Institute ofAgricultural Sciences，Zhuzhou 4120o7，Hunan，China）

Abstract：AnthocyaninsareoneofthekeyfactorsaffctingtheformationofornamentalvalueofLoropetalumchinense var.rubrum.In order to investigate the molecular mechanisms of anthocyanin biosynthesis in L. chinensevar.rubrum，an anthocyanin biosynthesis-related R2R3-MYB gene，named LcMYB113 with GenBank accesion number OR344758，was cloned from L. chinense var.rubrum.The deduced amino acid sequence of LcMYB113 gene wasanalyzed by bioinformatics methods.The relative expression levels of LcMYB113 gene in leaves of L. chinense var. rubrum and L.chinense were tested byreal-time fluorescencequantitative RT-PCR method.The phenotypes of leaves andflowers of transgenic tobacco lines were recorded.Therelative expresion levelsofanthocyanin biosyntheticstructural gees in leaves of transgenictobacco lines were examined.The results were as folows：（1）Theopen reading frameof LcMYB113 gene was 789 bplong，encoding 262aminoacids.Multiple alignment analysis showed thattheN-terminal ofLcMYB13 contained a canonical R2R3 DNA binding domain and a bHLH transcript factor binding motif ?D/E?Lx₂?R/K?x₃Lx₆ （204號(hào) Lx3R.Two anthocyanin biosynthesis activator characteristic motifs ANDV and ?K/R?P?Q/R?P?Q/R? were also found inthe aminoacid sequenceofLcMYB113.Phylogenetictreeanalysis indicated that LcMYB113 was closely related to anthocyanin specific R2R3-MYB subfamily transcription factors，including PsMYB58 of and VvMYBA1 of Vitis vinifera.（2）The anthocyanin content and relative expresion levelof LcMYB113 gene in leavesof L. chinense var. rubrum were 7.4 and 1O1 times that of L_* ：chinenserespectively，which indicated that the relative expresionlevel of LcMYB113 gene was corelated with theanthocyanin content in leaves.（3）The LcMYB113 gene overexpression vector was constructed and transformed into tobacco variety WS38.Heterologous expresion of LcMYB113 gene intobacco inducedanthocyanin accumulation in leaves and flowers of transgenic lines.Further more，compared with wide type tobacco line，transgenic lines hadremarkablyhigherrelativeexpresion levelsofanthocyanin biosynthetic structural genes，such as NtANS，NtDFR and NtCHS.In summary，this research results indicate that LcMYB113 can regulate the biosynthesisof anthocyanin，and provide theoretical support for leaf color breeding of L_* chinense var. rubrum.

Key words：Loropetalum chinensevar.rubrum，anthocyanin，LcMYBl13，gene cloning，real-time fluorescence quantitative RT-PCR

紅花木（Loropetalumchinensevar.rubrum）為金縷梅科繼木屬的多年生植物，樹(shù)姿挺拔，枝條紅褐色，花紅葉艷，觀賞性極佳，是原產(chǎn)于我國(guó)的特色觀花觀葉植物（董淑龍等，2022）。此外，紅花木適應(yīng)性強(qiáng)、耐修剪、易于塑形，在長(zhǎng)江流域及南方地區(qū)常作為主要的彩葉觀賞植物大量應(yīng)用于城市道路、公園、社區(qū)等綠化中（張藝帆等，2022）。

紅花檐木作為我國(guó)特色的觀花觀葉園林綠化植物（彭閏珉和于曉英，2012；Zhangetal.，2023），其花青苷物質(zhì)類(lèi)型及含量的差異是造成紅花木不同品種間葉色差異的基礎(chǔ)，在紅花檐木的葉片中已經(jīng)檢測(cè)到15種花青苷物質(zhì)，包括天竺葵素、矢車(chē)菊素、錦葵素等（陳倩如等，2021）。已有研究表明，花青苷物質(zhì)的生物合成依賴(lài)于多種結(jié)構(gòu)酶類(lèi)的活性，包括苯丙氨酸解氨酶（phenylalanineammonialyase，PAL）、查爾酮合成酶（chalconesynthase，CHS）、查爾酮異構(gòu)酶（chalcone isomerase，CHI）、黃烷酮3-羥化酶（flavanone 3-hydroxylase，F(xiàn)3H）、黃烷酮 3^′ -羥化酶（flavanone 3^′ -hydroxylase，F(xiàn)3^′H ）、二氫黃酮醇4-還原酶（dihydroflavonol 4-reductase，DFR）、花青素合成酶（anthocyanidinsynthase，ANS）等（Li et al.，2014;Chaves-Silvaetal.，2018；Khusnutdinovetal.，2021）。在植物中，R2R3-MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子被認(rèn)為是調(diào)控花青苷生物合成結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，R2R3-MYB能夠結(jié)合花青苷生物合成結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子區(qū)域并激活靶基因的表達(dá)，從而促進(jìn)花青苷物質(zhì)的積累；此外，R2R3-MYB還能與bHLH及WD40形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體共同調(diào)控花青苷物質(zhì)的合成（Felleretal.，2011;Li，2014；An et al.，2020；Yan et al.，2021）。Wu等（2022）研究表明，R2R3-MYBs蛋白的N端R2R3DNA結(jié)構(gòu)域相對(duì)保守，而C端具有多樣性。基于擬南芥R2R3-MYB蛋白AtWER的晶體結(jié)構(gòu)分析，證明R2R3結(jié)構(gòu)域形成2組各3個(gè)α 螺旋的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)域特異識(shí)別DNA序列 5^′ 1AACNGC- 3^′ （Wangetal.，2020），而R3 結(jié)構(gòu)中的RB基序是識(shí)別bHLH的特征序列（Zimmermannetal.，2004；WangBHetal.，2022）。在觀賞植物中，已經(jīng)陸續(xù)克隆并鑒定了多個(gè)調(diào)控花青苷合成的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子，包括菊花（Chrysanthemum × morifolium）（WangYGetal.，2022）、牡丹（Paeonia）（Liu et al.，2022;Shi et al.，2022）、百合（Lilium）（Yinetal.，2021）和貼梗海棠（Chaenomeles speciosa）（Ren et al.，2023）等，這些R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子在花青苷生物合成中起重要的調(diào)控作用。例如：菊花的 CmMYB9a 正調(diào)控花瓣中花青苷物質(zhì)的合成，該轉(zhuǎn)錄因子能夠結(jié)合并轉(zhuǎn)錄激活花青苷生物合成結(jié)構(gòu)基因CmCHS和CmDFR的啟動(dòng)子活性，在菊花中瞬時(shí)過(guò)表達(dá)或煙草中穩(wěn)定過(guò)表達(dá) CmMYB9a 基因都能誘導(dǎo)花青苷物質(zhì)的積累（WangYGetal.，2022）；卵葉牡丹（Paeonia qiui）的 PqMYB113 能夠轉(zhuǎn)錄激活靶基因PqDFR和 PqANS 的活性，從而促進(jìn)葉片花青苷物質(zhì)的合成，在煙草和擬南芥中異源表達(dá)PqMYB113基因也能夠促進(jìn)花青苷生物合成結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)及產(chǎn)物的積累（Liuetal.，2022）；紫斑牡丹（Paeonia rockii）的 PrMYB5 能轉(zhuǎn)錄激活PrDFR基因的表達(dá)并正調(diào)控花瓣中花青苷物質(zhì)的合成（Shietal.，2022），這與卵葉牡丹 PqMYB113 的功能類(lèi)似；LvMYB5是東方百合栽培品種‘Vivian’（LiliumorientalhybridscultivarVivian）花瓣花青苷物質(zhì)合成的正調(diào)控因子，抑制該基因的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致百合花瓣花青苷積累減少，而煙草葉片中瞬時(shí)表達(dá)該基因會(huì)促進(jìn)花青苷色素的積累（Yin et al.，2021）。此外，貼梗海棠（Chaenomeles speciosa）（Ren et al.，2023）、雞爪楓（Acer palmatum）（Sun et al.，2022）、斜紋粗肋草（Aglaonemacommutatum）（Lietal.，2022）和月季（Rosahybrida）（李茂福等，2022）等觀賞植物的R2R3-MYBs因子也被發(fā)現(xiàn)能夠正調(diào)控花青苷物質(zhì)的合成。目前，除了在紅花繼木中克隆了多個(gè)花青苷生物合成途徑的結(jié)構(gòu)基因外（張翔，2020；李彩虹，2021），對(duì)其生物合成調(diào)控的相關(guān)分子機(jī)制尚不清楚，也沒(méi)有關(guān)鍵調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子R2R3-MYB功能的報(bào)道。

本研究基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)克隆了紅花木R2R3-MYB家族的1個(gè)LcMYB113基因，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體及遺傳轉(zhuǎn)化煙草，對(duì)比分析轉(zhuǎn)基因和野生型煙草在表型、花青苷含量、花青昔合成結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)量之間的差異，擬探討以下問(wèn)題： （1）LcMYB113 蛋白理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、所屬家族及物種間的進(jìn)化關(guān)系； （2）LcMYB113 基因在紅花繼木和白花繼木葉片中的表達(dá)情況；（3）通過(guò)LcMYB113基因在煙草中異源表達(dá)分析其是否能夠誘導(dǎo)花青昔生物合成。通過(guò)對(duì)LcMYB113基因的克隆及功能研究，本研究確定LcMYB113基因編碼蛋白歸屬于正調(diào)控花青昔合成的R2R3-MYB因子，該基因的表達(dá)能夠促進(jìn)植物中花青昔合成結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)及花青苷物質(zhì)的積累，這為進(jìn)一步開(kāi)展紅花木葉色育種提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1植物材料

紅花木植株為6＼～8年扦插苗，白花木植株為6＼～8年實(shí)生苗，野生型煙草（Nicotianatabacum）株系（Wisconsin-38，WS38）及轉(zhuǎn)基因煙草株系盆栽于湖南工業(yè)大學(xué)百合工程研究中心植物生長(zhǎng)室，生長(zhǎng)條件為 22^°C 恒溫，光照周期為 ^16h 光照 ?^8h 黑暗。新鮮的葉片用于直接提取花青苷物質(zhì)，部分新鮮葉片經(jīng)液氮速凍后放置于 -80°C 冰箱中，用于進(jìn)一步的RNA提取、cDNA第一鏈合成及實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析。

野生型及轉(zhuǎn)基因煙草種子在培養(yǎng)基生長(zhǎng)2周后，移植到營(yíng)養(yǎng)土中再繼續(xù)生長(zhǎng)約18周后，植株主花序正常開(kāi)花，采集主花序向下的第5或第6片葉片。一部分新鮮的葉片材料用于直接提取花青苷物質(zhì)，另一部分經(jīng)液氮速凍后放置于 -80^°C 冰箱中，用于進(jìn)一步的基因表達(dá)分析。

1.2LcMYB113克隆和遺傳轉(zhuǎn)化煙草

使用通用植物RNA快速提取試劑盒RN52（北京艾德萊生物科技有限公司）提取紅花木的總RNA。使用M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒［生工生物工程（上海）股份有限公司]合成cDNA的第一鏈。利用高保真酶GXL［寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司］擴(kuò)增紅花木LcMYB113（GenBank序列號(hào)OR344758）的開(kāi)放閱讀框（Openreadingframe，ORF）序列，基因特異引物見(jiàn)表1，擴(kuò)增體系為50μL_ν 。PCR體系配置如下： 5×GXL Buffer 10.0μL dNTP Mixture （2.5mmol?L^-1）4.0μL ，正向、反向引物各 1.0μL ，第一鏈cDNA模板 0.5μL，GXL 高保真酶 1.0μL，ddH₂O 補(bǔ)充至 50μL 。PCR擴(kuò)增程序如下：預(yù)變性 1min ，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)； 72^°C 延伸 5min，10^qC 保存。LcMYB113ORF的PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳及回收后，利用 ClonExpress II One Step Cloning Kit（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）無(wú)縫連接到pSuper1300過(guò)表達(dá)載體中（榮朵艷等，2019）。重組過(guò)表達(dá)載體pSuper-LcMYB113通過(guò)熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài) DH5α ，單菌落測(cè)序正確后，提取陽(yáng)性菌的質(zhì)粒，并利用液氮凍融法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105中。

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法將LcMYB113基因轉(zhuǎn)化到煙草WS38中（Galloisamp;Marinho，1995）。轉(zhuǎn)基因煙草材料在含 20mg?L^-1 的潮霉素和200mg?L^-1 的特美汀抗性培養(yǎng)基中分化及生根，再移栽到營(yíng)養(yǎng)土中盆栽生長(zhǎng)。利用植物基因組DNA快速提取試劑盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］提取轉(zhuǎn)基因煙草T0代植株葉片的基因組DNA，利用潮霉素抗性基因（Hygromycinphosphotransferase，HYG）LcMYB113基因的鑒定引物（表1，轉(zhuǎn)基因鑒定引物）進(jìn)行PCR鑒定并獲得陽(yáng)性苗，繼續(xù)養(yǎng)護(hù)至開(kāi)花、收獲種子。選取3個(gè)具有代表性表型的轉(zhuǎn)基因株系TO代種子，經(jīng)過(guò)含潮霉素培養(yǎng)基篩選后，將T1代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性幼苗移植于營(yíng)養(yǎng)土中繼續(xù)生長(zhǎng)，直至主花序正常開(kāi)花，用于進(jìn)一步的取樣分析。代表性轉(zhuǎn)基因植株的葉片在早期生長(zhǎng)階段局部出現(xiàn)斑點(diǎn)狀的色素積累，隨著生長(zhǎng)時(shí)間的增加，色素斑點(diǎn)不斷增加并連成片，葉片大部分面積最終表現(xiàn)為紫紅色。利用轉(zhuǎn)基因鑒定引物對(duì)3個(gè)選定的轉(zhuǎn)基因株系中LcMYB113基因的表達(dá)進(jìn)行半定量RT-PCR檢測(cè)，內(nèi)參基因選擇NtActin（GenBank序列號(hào)：LOC107831145）。

引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。

1.3生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN6.0軟件對(duì)LcMYB113基因進(jìn)行序列分析，利用BLASTP（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/進(jìn)行同源蛋白搜索，并利用Mega5軟件及鄰接法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，并進(jìn)行了1000次重復(fù)的bootstrap測(cè)試。運(yùn)用在線網(wǎng)站InterPro（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/）對(duì)蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)。運(yùn)用在線網(wǎng)站ProtParam（https：//web.expasy. org/protparam/）對(duì)蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用在線網(wǎng)站SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）對(duì)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

檢測(cè)紅花木LcMYB113基因相對(duì)表達(dá)量的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR引物見(jiàn)表1，內(nèi)參基因選擇甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）（張力等，2013）。同時(shí)訂購(gòu)煙草花青苷生物合成結(jié)構(gòu)基因（包括NtANS、NtDFR、NtCHS等）及內(nèi)參基因NtActin的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR引物（Liuetal.，2022）。利用FastStartEssentialDNAGreenMaster（羅氏生命科學(xué)公司）實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)基因在組織中的相對(duì)表達(dá)情況。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系為 20μL：2×GreenI Master混合液10.0μL ，正向、反向引物各 1.0μL ，稀釋后的cDNA模板 5.0μL ，去離子水補(bǔ)足至 20.0μL 。擴(kuò)增程序如下： 95^°C 預(yù)變性 10s，72%10s ，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)設(shè)3次重復(fù)。利用Excel2010軟件和 2^-ΔΔCt 法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，用GraphPadPrism9.5軟件進(jìn)行柱形圖的繪制。進(jìn)行紅花樾木葉片中基因相對(duì)表達(dá)量分析時(shí)，以白花繼木葉片中對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)量為單位1進(jìn)行計(jì)算；進(jìn)行轉(zhuǎn)基因煙草葉片中相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量分析時(shí)，以野生型煙草葉片中對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)量為單位1進(jìn)行計(jì)算。利用SPSS20軟件及T檢驗(yàn)以確定基因表達(dá)量的差異性。不同的材料分別選取3個(gè)獨(dú)立植株的葉片提取RNA并進(jìn)行后續(xù)實(shí)時(shí)定量分析，通過(guò)3次生物學(xué)重復(fù)確定數(shù)據(jù)的可靠性。

1.5花青苷含量測(cè)定

紅花繼木和白花木的葉片、煙草葉片的花青苷提取及含量測(cè)定用鹽酸乙醇方法（李長(zhǎng)江，2018）進(jìn)行。具體操作如下：剪取相應(yīng)組織新鮮材料葉片，在分析天平上進(jìn)行稱(chēng)重，約 20mg ;將樣品放入石英研缽中，同時(shí)加入 4mL 的提取液（0.1mol?L^-1 的鹽酸乙醇溶液）進(jìn)行充分研磨，將研磨后的溶液轉(zhuǎn)至 15mL 離心管中，將離心管在 95^°C 水浴鍋中加熱 5min ，在 28^°C 的黑暗條件下過(guò)夜孵育；室溫離心機(jī) 1000g 離心 1min ，取出上清液，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定 oD 值（ OD₅₃₀ 與OD₆₅₀ ）；根據(jù)[ （OD₅₃₀-0.25×OD₆₅₀）×V（mL）]/m （g）公式計(jì)算樣品中的花青苷含量，單位為 μg?Ω g^-1FW 。共進(jìn)行3個(gè)獨(dú)立株系的葉片花青苷物質(zhì)的測(cè)定，并用于進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析，用GraphPadPrism9.5軟件進(jìn)行柱形圖的繪制，利用SPSS20軟件及Duncan氏方法進(jìn)行不同材料之間花青苷含量的顯著差異性分析。

表1基因克隆、表達(dá)分析引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1LcMYB113基因克隆及生物信息學(xué)分析

基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)基因擴(kuò)增特異引物，以紅花木葉片的cDNA為模板PCR擴(kuò)增LcMYB113基因的ORF序列（圖1）。測(cè)序結(jié)果表明， LcMYB113 的ORF為 789bp ，編碼262個(gè)氨基酸。利用Protparam在線分析LcMYB113蛋白的理化性質(zhì)，預(yù)測(cè)出該蛋白分子量為 30 125.55kDa ，分子式為 C₁₃₂₆H₂₁₂₅N₃₈₉O₃₈₉S₁₂ ，亮氨酸（leucine，Leu）含量最高（占 11.1% ），組氨酸（histidine，His）含量最低（占 1.5% ），等電點(diǎn)為9.2，呈堿性，不穩(wěn)定系數(shù)為39.3，疏水性為 -0.578 ，是負(fù)值，表明LcMYB113蛋白是堿性且不穩(wěn)定的疏水蛋白。利用SWISSMODEL在線軟件，以擬南芥R2R3-MYB蛋白AtWER為模板構(gòu)建了LcMYB113蛋白R(shí)2R3結(jié)構(gòu)域的三級(jí)結(jié)構(gòu)，LcMYB113蛋白與擬南芥AtWER蛋白的R2R3結(jié)構(gòu)域氨基酸序列一致性達(dá)到 62.39% ，并且R2和R3結(jié)構(gòu)域各有3個(gè) ∝ 螺旋（圖2）。

將LcMYB113氨基酸序列在NCBI中進(jìn)行BLASTP搜索，并進(jìn)行同源氨基酸序列的多重比對(duì)及保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果如圖3所示。LcMYB113的N端含有典型的R2R3DNA識(shí)別結(jié)構(gòu)域，其中R3結(jié)構(gòu)域中還包含1個(gè)與bHLH結(jié)合識(shí)別的[D/E] Lx₂[R/K]x₃Lx₆Lx₃R 基序。此外，還發(fā)現(xiàn)了與花青苷合成調(diào)控相關(guān)的ANDV和［K/R]P［Q/R]P[Q/R]特征基序。

A.紅花檐木總RNA（M.DL500Omarker）；B.LcMYB113基 因擴(kuò)增。 A.TotalRNAofLoropetalumchinensevar.rubrum（M.DL5000 marker）；B.Amplification of LcMYB113 gene.

利用Mega5對(duì)包括LcMYB113在內(nèi)的多種植福 0物MYB氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，結(jié)果如圖4所示，紅花木LcMYB113與來(lái)源于木本植物的牡丹（Paeonia × suffruticosa）PsMYB114和PsMYB58聚為一類(lèi)，并且與草本植物擬南芥（Arabidopsisthaliana）的AtMYB113、矮牽牛1 Petunia×hybrida× 的PhAN2等的親緣關(guān)系較近，它們同屬于調(diào)控花青昔合成的MYB轉(zhuǎn)錄因子，暗示這些MYB轉(zhuǎn)錄因子在花青昔的合成中可能具有相似的促進(jìn)作用。

2.2紅花檐木和白花木葉片花青苷含量及 LcMYB113基因表達(dá)分析

紅花繼木是白花繼木的變種，其葉片中都能夠顯著積累花青苷物質(zhì)（圖5：A）。通過(guò)對(duì)紅花繼木和白花繼木的葉片中花青苷物質(zhì)進(jìn)行提取分析，紅花木的葉片中花青苷物質(zhì)含量為（ 180±6X （20 μg?g^-1FW ，顯著高于白花木葉片中的花青苷物質(zhì)含量 Ω_{（24±2）μg?g^-1FW]} （圖5：B）。對(duì)紅花樾木及白花木葉片中的LcMYB113基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn) LcMYB113 在紅花木葉片中的相對(duì)表達(dá)量是白花繼木的101倍（圖5：C）。這表明LcMYB113在紅花木與白花木葉片中的表達(dá)趨勢(shì)與其花青苷含量的趨勢(shì)相一致。

2.3基因克隆及過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建

為深入探究LcMYB113基因的功能特性，本研究從紅花繼木組織中提取總RNA（圖1：A），再利用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用LcMYB113基因ORF序列的特異性引物，通過(guò)PCR技術(shù)成功克隆得到目的長(zhǎng)度約為 800bp 的LcMYB113基因片段（圖1：B）。利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒將PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化與回收，并與線性化的pSuper1300過(guò)表達(dá)載體相連接，得到的重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài) DH5α 及測(cè)序正確。構(gòu)建的重組載體轉(zhuǎn)化至EHA105感受態(tài)菌株中，利用基因ORF擴(kuò)增引物對(duì)單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證。結(jié)果（圖6）表明，所獲得的PCR產(chǎn)物大小與預(yù)期長(zhǎng)度一致，表明過(guò)表達(dá)載體的成功構(gòu)建。

2.4遺傳轉(zhuǎn)化煙草和轉(zhuǎn)基因株系表型分析

為了確定LcMYB113基因能夠調(diào)控花青苷物質(zhì)的合成，將LcMYB113基因構(gòu)建到過(guò)表達(dá)載體上，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法，將LcMYB113基因轉(zhuǎn)入煙草基因組中（圖7：A-F），對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，表明潮霉素抗性基因HYG和LcMYB113基因均整合到13個(gè)T0代轉(zhuǎn)基因株系的基因組中（圖8）。3個(gè)代表性T1代轉(zhuǎn)基因煙草株系的葉片（圖9：A）、花朵（圖9：C）等組織中均能夠觀察到花青苷物質(zhì)的積累。半定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果也表明，LcMYB113基因的轉(zhuǎn)錄本在這3個(gè)T1代轉(zhuǎn)基因株系中正常表達(dá)（圖9：B）。3個(gè)代表性T1代轉(zhuǎn)基因株系的葉片中花青苷含量分別為（ 187±16 ）、（ 309±10 ）、（ 245±35， μg?g^-1 FW，均遠(yuǎn)高于野生型煙草葉片花青苷的含量 （19±2） ） μg?g^-1 FW（圖9：D）。進(jìn)一步對(duì)不同T1代轉(zhuǎn)基因株系葉片花青苷生物合成結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)進(jìn)行分析，3個(gè)代表性轉(zhuǎn)基因株系中包括NtANS，NtDFR，NtCHS，NtF3H，NtF3^′H 等多個(gè)花青苷生物合成結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)量顯著升高（圖10）。其中，2號(hào)轉(zhuǎn)基因株系葉片中NtDFR、NtANS和NtF3^′H 的相對(duì)表達(dá)量為野生型株系的200倍以上，受到的誘導(dǎo)表達(dá)最為明顯。上述結(jié)果表明，LcMYB113能夠促進(jìn)煙草中花青苷生物合成結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)及花青苷物質(zhì)的積累。

3 討論與結(jié)論

本研究基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，從紅花木中分離得到了1個(gè)R2R3-MYB基因LcMYB113，該基因編碼262個(gè)氨基酸，LcMYB113的N端具有保守的R2R3DNA結(jié)合域，三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明其與擬南芥AtWER的R2R3結(jié)構(gòu)域相似，均由2組各3個(gè) ∝ 螺旋構(gòu)成，已經(jīng)證實(shí)AtWER的R2R3結(jié)構(gòu)域能夠特異結(jié)合靶DNA序列（Wangetal.，2020），推測(cè)LcMYB113的R2R3結(jié)構(gòu)域也具備識(shí)別特異靶DNA序列的能力。在LcMYB113的R3結(jié)構(gòu)域中有1個(gè)識(shí)別bHLH轉(zhuǎn)錄因子的RB基序，該基序保守地存在很多R2R3-MYB家族蛋白的R3結(jié)構(gòu)域中（Zimmermann et al.，2004;Wu et al.，2022），推測(cè)LcMYB113能夠利用RB基序與細(xì)胞內(nèi)特定的bHLH因子結(jié)合形成調(diào)控復(fù)合物。在LcMYB113的N端R3結(jié)構(gòu)域和C端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域中還分別存在1個(gè)促進(jìn)花青苷合成的ANDV和［K/R]P［QR]P[Q/R]基序（Yamagishietal.，2010；Liuetal.，2022），這區(qū)別于抑制花青昔合成蛋白AtMYBL2的TLLLFR基序（Matsuietal.，20O8），也不同于抑制羥基肉桂酸合成蛋白AtMYB4的EAR基序（Jinetal.，2000，Wuetal.，2022）。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明LcMYB113與其他植物調(diào)控花青苷合成調(diào)控R2R3-MYB分在同一亞組，如牡丹的PsMYB58、葡萄的VvMYBA1、矮牽牛的PhAN2等，這與促進(jìn)花青苷合成的PqMYB113（Liuetal.，2022）和RhMYB113c（李茂福等，2022）的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果相似。以上生物信息學(xué)分析結(jié)果支持LcMYB113基因編碼促進(jìn)花青苷合成的R2R3MYB因子。

LcMYB113基因在紅花繼木葉片中的表達(dá)顯著高于白花檐木中的表達(dá)，并且與葉片中花青苷物質(zhì)的含量高度相關(guān)，這種結(jié)果與其他正調(diào)控R2R3-MYBs基因的表達(dá)相似，如菊花的 CmMYB9a （WangYGetal.，2022）、卵葉牡丹的PqMYB113（Liuetal.，2022）和月季的RhMYB113c（李茂福等，2022），推測(cè)紅花繼木葉片中積累花青苷物質(zhì)是由LcMYB113基因的高表達(dá)量引起的。在煙草中異源表達(dá)LcMYB113基因能夠顯著促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植株葉片、花瓣及萼片等組織中花青苷的積累，同時(shí)也檢測(cè)到花青苷合成結(jié)構(gòu)基因表達(dá)量的提高，這與牡丹PsMYB58（Zhangetal.，2021）和卵葉牡丹 PqMYB113 （Liu etal.，2022）轉(zhuǎn)基因煙草植株結(jié)果相似。菊花 CmMYB9a （Wang YG etal.，2022）和紫斑牡丹PrMYB5（Shietal.，2022）在煙草異源表達(dá)僅影響花瓣色素的積累，而紅掌（Anthuriumandraeanum）AaMYB6（李崇暉等，2021）在煙草中100—草莓Fragaria × ananassaFaMYB9 99 月季花RosachinensisRcMYB123 100 43 桃Prmis prscaPpPMYB6123 100．葡萄V.viniferaVvMYBPA1 葡萄VviniferaVvMYB308 100 楓香樹(shù)LiquidambarformosanaLfMYB123 53 楊梅MorellarubraMrMYB5 78—淡紅薺Capsella rubella CrMYB111 100 花椰菜 Brassica oleracea var.botrytis BoMYB12 擬南芥Arabidopsisthaliana AtMYB111 100 桃Prumuspersica PpMYB29 蘋(píng)果Malus domestica MdMYB22 100 99-白梨Pyrus bretschneideriPbMYB11 100牡丹Paeonia × suffruticosa PsMYB114 97 牡丹Paeonia × suffruticosa PsMYB58 紅花橙木Loropetalumchinense var.rubrumLcMYB113 葡萄VitisviniferaVvMYBA1 100 4 100 茶asl 59 葡萄Vitis vinifera VvMYB113 32 擬南芥Arabidopsis thaliana AtMYB113 矮牽牛Petunia × hybridaPhAN4 52 矮牽牛Petunia × hybrida PhAN2 0.1 88 100 矮牽牛 Petunia guarapuavensis PgAN2 45- 紫花矮牽牛P.integrifoliaPiAN2

A.白花機(jī)木與紅花繼木葉片；B.葉片花青苷含量；C.葉片中LcMYB113相對(duì)表達(dá)量。 ^** 表示差異顯著（ Plt;0.01? ，下同。 A.Leaves of Loropetalum chinense and L. chinense var.rubrum；B.Anthocyanin contents in leaves；C.Relative expression levels of LcMYB11 inleaves.** shows significant differences（ Plt;0.01 ），the same below.

Fig.5Phenotype and LcMYB113 relative expresion level in leaves of Loropetalum chinense and L.chinense var.rubrum

1-8.8個(gè)農(nóng)桿菌菌落；M.DL5000marker；P.陽(yáng)性對(duì)照；E.空白對(duì)照。

1-8.Eight Agrobacterium tumefaciens colonies；M. DL5oOO marker；P.Positive control;E.Empty control.

A.預(yù)培養(yǎng)；B.農(nóng)桿菌侵染；C.共培養(yǎng)；D.誘導(dǎo)生芽；E.誘導(dǎo)生根；F.轉(zhuǎn)基因植株。 A.Pre-cultiatio；B.AgobctetumefacectioC.Cova;Doiuctio；E.Rootiductio;F.scla

1-13.不同的TO代轉(zhuǎn)基因株系；M.DL500O marker；WT.野生型；E.空白對(duì)照；P.陽(yáng)性對(duì)照。

1-13.Individual TO transgenic lines；M.DL5OOO marker；WT.Wild type;E.Emptycontrol;P.Positive control.

A.野生型及T1代轉(zhuǎn)基因植株葉片（#1、#2、#3均表示代表性T1代轉(zhuǎn)基因株系，下同）；B.不同株系花朵；C.不同株系葉片中LcMYB113基因表達(dá)；D.不同株系葉片花青苷含量。不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（ Plt;0.01 。

A.Leavesfildtandraencants（##2#3alleprsteprstatieTragesebelo）；osfdifentlins；expssiafitls；DAnoaosisofintllettersindicate significantdifferences（ Plt;0.01 ）

異源表達(dá)只促進(jìn)花絲中色素的積累，這與LcMYB113轉(zhuǎn)基因煙草的表型相差較大，說(shuō)明不同的R2R3-MYBs基因在促進(jìn)花青昔合成的能力上具有一定的差異性。以上結(jié)果表明，紅花檐木LcMYB113基因具有較強(qiáng)的促進(jìn)花青昔合成的能力。

綜上所述，本研究克隆了紅花繼木1個(gè)R2R3MYB基因LcMYB113，其編碼氨基酸具有典型的R2R3DNA結(jié)合域bHLH識(shí)別序列及花青苷調(diào)控特征基序，歸類(lèi)于正調(diào)控花青苷合成的AN2亞組。LcMYB113基因的表達(dá)與紅花木葉子中的花青苷物質(zhì)積累正相關(guān)，在煙草中異源表達(dá)LcMYB113基因促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植株中花青苷含量積累及花青苷合成結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。因此，LcMYB113是紅花木中促進(jìn)花青昔合成調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子。

致謝感謝中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)朱元娣教授惠贈(zèng)野生型煙草種子。

參考文獻(xiàn)：

ANJP，WANGXF，ZHANGXW，etal.，202O.AnappleMYB transcription factor regulates cold tolerance and anthocyanin accumulation and undergoes MIEL1-mediated degradation [J].PlantBiotechnology Journal，18（2）：337-353.

CHAVES-SILVA S， SANTOS ALD，CHALFUN-JUNIOR A，et al.，2O18.Understandingthegeneticregulationof anthocyanin biosynthesisinplants-tools for breeding purple varieties of fruitsand vegetables[J].Phytochemistry，153： 11-27.

CHENQR，CAI WQ，ZHANG X， et al.，2021.The comparative studies on phytochemicals of leaf coloration of Loropetalumchinensevar.rubrum[J].Acta Horticulturae Sinica，48（10）：1969-1982.［陳倩如，蔡文淇，張霞， 等，2021.木不同葉色形成的化學(xué)成分比較研究 ［J].園藝學(xué)報(bào)，48（10）：1969-1982.]

DONG SL，MAJM，MO YH，et al.，2022.Review of research ongermplasm resources and application of Loropetalum chinense var.rubrum[J].Guangxi Forestry Science，51 （2）：290-297.［董淑龍，馬姜明，莫燕華，等， 2022.紅花木種質(zhì)資源與應(yīng)用研究綜述［J].廣西林 業(yè)科學(xué)，51（2）：290-297.]

FELLER A，MACHEMER K，BRAUN EL，et al.，2011. Evolutionary and comparative analysis of MYB and bHLH plant transcription factors[J]. The Plant Journal，66（1）： 94-116.

GALLOIS P，MARINHO P，1995. Leaf disk transformation using Agrobacterium tumefaciens-expression of heterologous genes in tobacco[J].Methodsin Molecular Biology，49：39-48.

JINH，COMINELLIE，BAILEYP，et al.，2000. Transcriptional repression by AtMYB4 controls production of UV-protecting sunscreens in Arabidopsis [J].The EMBO Journal，19（22）：6150-6161.

KHUSNUTDINOV E，SUKHAREVA A，PANFILOVA M，et al.，2021.Anthocyanin biosynthesis genesas model genes for genome editing in plants ［J].International Journal of Molecular Sciences， 22（16） ： 8752.

LI CH，2O21. Cloning and genetic transformation of LcCHSs and LcDFRsgenes from Loropetalum chinense var. rubrum [D].Zhuzhou：Hunan University of Technology：31.[李彩 虹，2021.紅花檐木LcCHSs與LcDFRs基因的克隆及遺 傳轉(zhuǎn)化［D].株洲：湖南工業(yè)大學(xué)：31.]

LI CH，YANG GS， ZHANG ZQ，et al.，2021. A novel R2R3- MYBtranscription factorgene AaMYB6 involvedin anthocyanin biosynthesisin Anthurium andraeanum[J]. Acta Horticulturae Sinica，48（10）：1859-1872.[李崇暉， 楊光穗，張志群，等，2021.紅掌R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子基 1859-1872.]

LI CJ，2018. Study on the role of JEM in regulating jasmonate signaling-mediated anthocyanin biosynthesis[D]. Beijing： China Agricultural University：48.［李長(zhǎng)江，2018.擬南芥 JEM調(diào)控JA信號(hào)誘導(dǎo)的花青素合成機(jī)制研究［D].北 京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)：48.]

LI J，WU KL，LI L，et al.，2022.AcMYB1 interacts with AcbHLH1to regulate anthocyaninbiosynthesis in Aglaonema commutatum[J].Frontiers in Plant Science，13：886313.

LIMF，YANGY，WANG H，et al.，2O22.Analysis the function of R2R3 MYB transcription factor RhMYB113c on regulating anthocyanin synthesis in Rosa hybrida [J].Acta Horticulturae Sinica，49（9）：1957-1966.[李茂福，楊媛， 王華，等，2022.月季中R2R3-MYB基因RhMYB113c調(diào) 控花青素苷合成[J].園藝學(xué)報(bào)，49（9）：1957-1966.]

LI ST，2014. Transcriptional control of flavonoid biosynthesis ： fine-tuning of the MYB-bHLH-WD40（MBW） complex [J].Plant Signalingamp; Behavior，9（1）：e27522.

LIU XK，DUAN JJ，HUO D，et al.，2022.The Paeonia qiui R2R3-MYB transcription factor PqMYB113positively regulates anthocyanin accumulation in Arabidopsis thaliana and tobacco [J].Frontiers in Plant Science，12：810990.

MATSUI K，UMEMURA Y，OHME-TAKAGI M，et al.， 2008.AtMYBL2，a protein with a single MYB domain，acts asanegative regulator ofanthocyanin biosynthesisin Arabidopsis [J]. The Plant Journal，55（6）： 954-967.

PENG RM，YU XY，2012. Investigation and analysis of the landscape application present situation of Loropetalum in Hunan Province ［J].Tianjin Agricultural Sciences，18 （6）：152-155.［彭閏珉，于曉英，2012.湖南木屬植 物的園林應(yīng)用現(xiàn)狀調(diào)查與分析［J]．天津農(nóng)業(yè)科學(xué)， 18（6） ： 152-155.]

REN YS，ZHANG SY，ZHAO QY，et al.，2023.The CsMYB123 and CsbHLH111 are involved in drought stressinduced anthocyanin biosynthesis in Chaenomeles speciosa [J].Molecular Horticulture，3（1）：25.

RONG DY，ZHANG X，PAN T，et al.，2019.Cloning， expressionandtransformationofLcFLS1genefrom Loropetalum chinense var.rubrum [J]. Acta Botanica BorealiOccidentalia Sinica，39（3）：404-412.［榮朵艷，張翔，潘 婷，等，2019.紅花機(jī)木LcFLS1基因的克隆及其表達(dá)與轉(zhuǎn) 化研究［J].西北植物學(xué)報(bào)，39（3）：404-412.]

SHI QQ，YUAN M，WANG S，et al.，2022. PrMYB5 activates anthocyanin biosynthetic PrDFR to promote the distinct pigmentation pattern in the petal of Paeonia rockii[J]. Frontiers in Plant Science，13：955590.

SUN SJ，ZHANG Q，YU YF，et al.，2022. Leaf coloration in Acerpalmatum is associated with a positive regulator ApMYB1 with potential for breeding color-leafed plants [J].Plants，11（6）：759.

WANG BH，LUO Q，LI YP，et al.，2020. Structural insights into target DNA recognition by R2R3-MYB transcription factors「J]. Nucleic Acids Research，48（1）： 460-471. Jsigit into partner selection for MYB and bHLH transcription factor complexes[J].Nature Plants，8（9）：1108-1117.

WANG YG，ZHOU LJ，WANG YX，et al.， 2022. CmMYB9a activatesfloralcolorationbypositivelyregulating anthocyanin biosynthesis in chrysanthemum [J].Plant Molecular Biology，108：51-63.

WU Y，WEN J，XIA YP，et al.，2022.Evolution and functional diversification ofR2R3-MYB transcription factors in plants[J].Horticulture Research，9：uhac058.

YAMAGISHI M， SHIMOYAMADA Y，NAKATSUKA T， et al.， 2010.Two R2R3-MYB genes，homologs of petunia AN2， regulate anthocyanin biosyntheses in flower tepals，tepal spots and leaves of Asiatic hybrid lily[J].Plant and Cell Physiology，51（3）：463-474.

YANHL，PEI XN，ZHANGH，et al.，2O21.MYB-mediated regulation of anthocyanin biosynthesis ［J].International Journal of Molecular Sciences，22（6）：3103.

YIN XJ， ZHANG YB，ZHANG L，et al.， 2O21. Regulation of MYB transcription factors of anthocyanin synthesis in lily flowers[J]. Frontiers inPlant Science，12：761668.

ZHANG L，YU XY，F(xiàn)U HY，et al.，2013.Reference genes selection for real-time fluorescence quantitative PCR in Lorpetalum chinensevar.rubrum[J].Chinese Agricultural Science Bulletin，29（10）：11-17.［張力，于曉英，符紅 艷，等，2013.紅花木實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析內(nèi)參基 因的選擇［J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，29（10）：11-17.]

ZHANG X，2020. Cloning，expression and transformation of LcCHI and LcANS genes from Loropetalum chinense var. rubrum[D]. Zhuzhou：Hunan University of Technology ： 32.［張翔，2020.紅花木 基因的克隆、表 達(dá)分析及轉(zhuǎn)化的研究［D].株洲：湖南工業(yè)大學(xué)：32.]

ZHANG X， ZHANG L， ZHANG DM， et al.， 2023. Comprehensive analysisof metabolome and transcriptome reveals the mechanism of color formation in different leave of Loropetalum chinense var. rubrum [J]. BMC Plant Biology， 23： 133.

ZHANG YF，WANG H，HUO WW，et al.， 2022.Analysis of seasonalmosaicleafphenotypeandphotosynthetic physicological response of Loropetalum chinense var.rubrum [J].Acta Agriculturae Boreali-Occidentalis Sinica，31 （12）：1579-1588.[張藝帆，王慧，霍雯雯，等，2022.紅 花木季節(jié)性花葉表型及其光合生理響應(yīng)分析［J].西 北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，31（12）：1579-1588.]

ZHANGYZ，XU SZ，MA HP，etal.，2021.The R2R3-MYB gene PsMYB58 positively regulates anthocyanin biosynthesis intreepeonyflowers[J].PlantPhysiologyand Biochemistry，164：279-288.

ZIMMERMANN IM，HEIM MA，WEISSHAAR B，et al.， 2004.Comprehensive identification of Arabidopsis thaliana MYBtranscription factors interactingwith R/B-like BHLH proteins[J].The Plant Journal，40（1）：22-34.

（責(zé)任編輯 鄧斯麗）