蘋果屬垂絲海棠鉀轉(zhuǎn)運基因MhHAK5的克隆及耐低鉀功能鑒定

中圖分類號：S661.1：Q781 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2025）06-0028-09

AbstractPotassium （K）is one of the essential mineral elements for plant growth and development， which is very important for yield and quality formation. HAK5 is an important high-affinity K transporter gene， which mainly mediates K uptake under low K conditions.However，litle is known about the functional role of HAK5 in Malus. In this study，Malus haliana was used as experimental material，and its HAK5 （MhHAK5） gene was cloned and analyzed.The physicochemical properties and tissue expression specificity were analyzed by bioinformatics analysis，and the response to low K was studied through overexpressing MhHAK5 in Arabidopsis thaliana by genetic transformation.The results showed that the full length of MhHAK5 gene was 1 830 bp with the open reading frame （ORF）as 1695bp ，and it encoded 518 amino acids. The MhHAK5 protein had the molecular weight of 60.05kDa and the isoelectric point of 7.45， had four transmembrane structures， was an unstable hydrophilic transmembrane protein，and was located in nucleus.Phylogenetic analysis showed that MhHAK5 had the highest similarity with AtHAK5，AtHAK1O in Arabidopsis thaliana and OsHAK5 in rice.Furthermore，it had Ser-Gly-Gly-Gly amino acid sequence.The results of tissue expresson specificity analysis showed that MhHAK5 had the highest expression level in roots of M. halliana，and was induced by low potassium. Compared with wild type （WT），overexpression of MhHAK5 could effctively improve K⁺ absorption and growth-promoting plant hormone synthesis of Arabidopsis plants under low K conditions，thus ensuring root development.In summary，MhHAK5 played an important role in response to K deficiency stress.The results ofthis study could provide theoretical bases for gene improvement and breeding of K deficiency tolerant apple rootstocks.

KeywordsMalus haliana ; MhHAK5 gene； Bioinformatics analysis; Potassium deficiency stress ； Geneexpression

鉀（K）是植物必需的礦質(zhì)養(yǎng)分之一，與氮、磷的利用方式不同，K在植物體中不會被同化為有機物，主要以鉀離子（ K⁺ ）形態(tài)存在并發(fā)揮作用[1]。 K⁺ 參與許多植物生理過程，例如調(diào)節(jié)滲透壓、維持細胞膨壓、促進蛋白質(zhì)生物合成、調(diào)控膜極化以及同化產(chǎn)物的運輸?shù)萚2]，影響著植物產(chǎn)量和品質(zhì)的形成。全球鉀資源分布極不均勻，當植物生長在K有效含量較低的土壤中時，生長發(fā)育和生理代謝都會受到消極影響[3]。我國土壤鉀主要以礦物態(tài)存在，造成土壤有效鉀含量偏低，再加上鉀肥資源短缺及植物鉀利用效率較低，使得植物體內(nèi)鉀含量不足，已成為目前導致其產(chǎn)品質(zhì)量欠佳的重要原因[4] 。

研究表明，植物具有復雜的信號通路以應對根圍 K⁺ 濃度的變化，當根圍 K⁺ 濃度低于 2mmolL 時，高親和力轉(zhuǎn)運系統(tǒng)（HATs）被誘導通過 H⁺/K⁺ 質(zhì)子泵方式發(fā)揮主要作用，而當 K⁺ 濃度高于 2mmol/L 時，低親和力轉(zhuǎn)運系統(tǒng)（LATs）則起主要作用[1，5-6]。高親和力鉀轉(zhuǎn)運蛋白（HAK）是鉀離子轉(zhuǎn)運體KT/KUP/HAK超家族的重要組成部分，具有單價陽離子轉(zhuǎn)運特性[]。HAK家族蛋白具有4＼～12個跨膜區(qū)域[8，通常在第2個與第3個跨膜區(qū)域之間存在著1個帶電荷的中央親水環(huán)[7]，第3個與第4個跨膜區(qū)域之間存在著首個PA環(huán)保守位點的氨基酸序列[9]。該家族蛋白不僅是 K⁺-Na⁺ 協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白，也是 ΔNa⁺，K⁺ 的單向轉(zhuǎn)運蛋白[10]。研究表明，HAK成員具有增強植物抗旱、耐鹽堿及抗病性的作用[7，11]，尤其在缺鉀情況下可誘導植物根系促生長激素的合成，促進根系生長，并且調(diào)節(jié)植物對 K⁺ 的吸收，目前已發(fā)現(xiàn) HAKI、HAK5、HAK7 基因參與低鉀脅迫下的鉀

離子吸收調(diào)節(jié)[8，12-13] 。

垂絲海棠（Malushalliana）是薔薇科蘋果屬（Malus）落葉喬木，根系健壯，韌皮部細胞代謝較快，常用作蘋果砧木[14]。目前我國對垂絲海棠的研究相對較少，且主要集中于探索其逆境耐受性，目前已知其具有優(yōu)異的耐貧瘠、耐鹽堿及耐干旱等性能[15]。由于蘋果栽培過程中的不合理施肥管理，果園土壤質(zhì)量退化日益嚴重，低鉀脅迫已成為制約蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素[16]。采用基因改良方式改善植物對低鉀脅迫的耐性以及提高鉀利用效率，相比于傳統(tǒng)的增施鉀肥方法，具有省時、高效、遺傳穩(wěn)定等優(yōu)點[17]?；诖?，本研究以垂絲海棠為試材，克隆低鉀脅迫下高親和力鉀轉(zhuǎn)運蛋白基因MhHAK5，對其進行生物信息學分析，同時采用農(nóng)桿菌介導法將其在擬南芥中過表達，研究其在植株響應低鉀脅迫中的功能，以期為耐低鉀蘋果砧木的基因改良與選育提供理論基礎(chǔ)

1 材料與方法

1.1 供試材料及試驗處理

1.1.1植物材料試驗于2022年5—9月在省市的理工學院植物人工氣候室中進行。垂絲海棠幼苗來自中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹研究所；供試野生型（WT）擬南芥（Arabidopsisthaliana）為哥倫比亞生態(tài)型，供試煙草（Nicotianatabacum）品種為紅花煙草，均購自上海唯地生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 菌株和載體大腸桿菌 DH5α 感受態(tài)，購自上海唯地生物技術(shù)有限公司；農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)、pCAMBIA1300改造載體（Super1300超表達載體），皆購自上海唯地生物技術(shù)有限公司

1.1.3植物材料的培養(yǎng)及試驗處理 將垂絲海棠幼苗栽種于裝有 3L Han's營養(yǎng)液的培養(yǎng)桶中，置于人工氣候室中預培養(yǎng)7d，培養(yǎng)條件為光周期16h 光 ^′8h 暗、光照強度 5800lx 、晝/夜溫度26^°C/18^°C [18]。預培養(yǎng)結(jié)束后分別采用正常供鉀（ 2mmol/L ，CK）和低鉀（ 0.5mmol/L， LK）的全量改良Han's營養(yǎng)液進行不同濃度鉀處理培養(yǎng)，處理7d后采集根系樣品并迅速用液氮冷凍，于-80°C 保存。所用鉀源為 K₂SO₄ （分析純），每個處理3次重復。

紅花煙草培養(yǎng)的外部環(huán)境條件同垂絲海棠幼苗，固體培養(yǎng)基配方為 MS+30g/L 蔗糖 +6g/L 瓊脂（ pH 值6.5），每兩周繼代1次。

1.2 垂絲海棠MhHAK5基因的克隆及生物信息學分析

1.2.1MhHAK5基因的克隆稱取 200.00mg 冷凍的垂絲海棠根系樣品，按照Trizol總RNA提取試劑盒相關(guān)說明提取總RNA，采用PrimeScriptRTMasterMix試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，合成第一條cD-NA。在蘋果屬基因組數(shù)據(jù)庫GDR（https：//www.rosaceae.org/）中檢索出MhHAK5的編碼區(qū)序列，用Primer6.0軟件設(shè)計特異性引物（表1），以cD-NA為模板進行PCR擴增，PCR反應體系和反應程序參照張瑞等[18]的方法。將擴增的片段與pCAMBIA1300克隆載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌并挑選陽性克隆進行測序。

1.2.2MhHAK5基因的生物信息學分析擬南芥AtHAK5、水稻OsHAK5、煙草NtHAK3、鹽角草Se-HAK5等蛋白的氨基酸序列從TAIR9.0（http：//www.arabidopsis.org/index.jsp）和植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫（http：//planttfdb.cbi.pku.edu. cn/ ）下載，使用DNAman軟件的ClustalW程序?qū)Λ@得的各物種的氨基酸序列進行比對，并基于MEGA7.0軟件采用鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。采用SWISS - MODEL （http：//swissmodel. expasy. org/）分析MhHAK5蛋白的分子模型。采用ExPASy工具（https：//web.expasy.org/protparam/）分析推定的MhHAK5蛋白的序列長度、分子量及等電點（pI）等[19] O

MhHAK5的亞細胞定位：將設(shè)計好的Mh-HAK5引物（表1）用于PCR擴增基因，采用 β- 雌二醇誘導型啟動子驅(qū)動，將MhHAK5編碼序列克隆到SUPERR：sXVE：GFP：Bar載體中;使用Bio-RadGenePulser通過電穿孔將含有GFP、Mh-HAK5-GFP和HAK5-mCherry的載體轉(zhuǎn)移至農(nóng)桿菌（GV3101）細胞中，然后將農(nóng)桿菌細胞轉(zhuǎn)染至紅花煙草葉片中[20]，共培養(yǎng) 24h 后，采用100mmol/L β -雌二醇溶液注射葉片以誘導靶基因表達；將注射成功的紅花煙草在 25°C 、弱光條件下培養(yǎng) ^72h ，之后通過共聚焦激光掃描顯微鏡（ZEISS710，卡爾蔡司，德國）觀察GFP（綠色熒光蛋白）熒光。

1.3 MhHAK5過表達擬南芥的獲得

參照朱飛雪等[21]的方法進行擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化，得到 T₀ 代擬南芥種子；將 T₀ 代種子用 75% 酒精處理 3min?3% NaClO處理 10min ，流動無菌水沖洗5次，然后播到含有 1/2Han 's營養(yǎng)液的MS 培養(yǎng)基上，采用 50mg/L 潮霉素篩選，獲得 T₁ 代MhHAK5過表達的陽性轉(zhuǎn)基因擬南芥；經(jīng)過連續(xù)3代的篩選，最終獲得純合的 T₃ 代轉(zhuǎn)基因植株，用于后續(xù)基因功能研究

1.4MhHAK5在垂絲海棠不同組織中的表達分析

按照上述基因克隆方法中的提取方式從垂絲海棠根、莖、葉中提取RNA，并采用超微量核酸蛋白測定儀（NanoDrop2000，北京芯起點基因科技有限公司）檢測RNA 濃度。采用TransStartTMGreenqPCRSuperMix試劑盒合成首條cDNA，并采用無菌水將cDNA稀釋100倍用作實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）的模板。采用Primer6.0軟件設(shè)計引物，引物序列見表1，以GAPDH作為內(nèi)參基因，利用LightCycler？96熒光定量PCR儀進行PCR分析。PCR擴增體系及程序參照Zhang等[22]所述，基因表達量采用斷層掃描法（2 （2^-ΔΔCt ）計算。

1.5野生型和MhHAK5過表達擬南芥根系 K⁺ 通量、植株K含量及生長激素測定

采用非侵入性微測試技術(shù)（NMT）和自動掃描電極技術(shù)（ASET2.0，美國）測量凈 K⁺ 通量[23]。采用正常供鉀（2mmol/L）與低鉀（ 0.5mmol/L） 改良Han's營養(yǎng)液培養(yǎng) 96h 后，用蒸餾水小心沖洗野生型擬南芥和MhHAK5過表達株系的根系，分別收集具有 3cm 的不定根（AR）和發(fā)根農(nóng)桿菌誘導的轉(zhuǎn)基因根（TR）的細根。使用 K⁺ 的能斯特斜率大于 52mV 的離子微電極測定缺鉀處理的K⁺ 通量；對于正常供鉀處理，則先采用鉀溶液（0.1mmol/LKCl，0.1mmol/L MES 緩沖液）平衡10min ，再測定根系伸長區(qū)和分生區(qū)的離子通量，每個根區(qū)的每個測量點連續(xù)記錄 6min 。采用JCal系統(tǒng)（http：//youngerusa.com/jcal）計算 K⁺ 通量。

以水培方式進行低鉀脅迫處理 7d 后，取WT和MhHAK5過表達株系的植株，在烘箱中 70^°C 干燥至恒重；根長采用數(shù)字尺進行測量。將干燥的樣品研磨后用 H₂SO₄-H₂O₂ 消化，然后基于火焰光度計FP640（上海忻一精密儀器有限公司）采用火焰光度法[24]測定鉀含量。吲哚丁酸（IBA）與吲哚乙酸（IAA）采用上海通蔚生物科技有限公司生產(chǎn)的Elisa試劑盒測定，試劑盒型號分別為s980T，s960T

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用MicrosoftExcel2019、SPSS23.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行整理與統(tǒng)計分析，采用Origin2022軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 垂絲海棠MhHAK5基因克隆及蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

利用多個HAK序列推導的簡并引物和反轉(zhuǎn)錄方法，克隆了垂絲海棠HAK的cDNA同源物，擴增的cDNA片段長度為 1830bp 。通過cDNA末端快速擴增獲得MhHAK5基因全長cDNA，其開放閱讀框（ORF）全長 1 695bp （圖1A），編碼518個氨基酸。MhHAK5蛋白分子量 60.05kDa ，理論等電點（pI）為7.45，脂肪系數(shù)為88.69，不穩(wěn)定指數(shù)47.92，疏水指數(shù)-0.34，為不穩(wěn)定的親水蛋白。二級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)（圖1B）的分析發(fā)現(xiàn)，MhHAK5具有復雜的螺旋折疊結(jié)構(gòu)，由 49.62% 的α- 螺旋 .17.76% 延伸鏈 ，5.23% （204號 β -轉(zhuǎn)角和 27.39% 的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)組成。跨膜結(jié)構(gòu)預測結(jié)果顯示，MhHAK5中存在4個跨膜結(jié)構(gòu)域（圖1C）。

圖1 垂絲海棠MhHAK5基因克隆及其編碼蛋白結(jié)構(gòu)分析2.2 垂絲海棠MhHAK5的系統(tǒng)發(fā)育分析

由圖2A可知，MhHAK5蛋白序列的4個P環(huán)保守位點的氨基酸為 Ser-Gly-Gly-Gly，3 個甘氨酸殘基分別為Gly244、Gly378和Gly480，還含有1個絲氨酸殘基（Ser119），表明MhHAK5屬于I型亞家族， P_A，P_B，P_C，P_D 環(huán)分別位于第 86～ 115.244～273.378～399.468～497 氨基酸之間，與AtHAK5類似，MhHAK5在氨基酸242與273對應位置的第2個孔環(huán)結(jié)構(gòu)域中均含有天冬酰胺殘基（D）。系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2B）顯示，MhHAK5與AtHAK5、AtHAK10、OsHAK5聚在同一分支，且與AtHAK5同源性最高，相似度為 98.97% ;與鹽角草（Salicornia europaea）的 SeHAK1-1、SeHAK1-2同源性最低，相似度僅分別為 71.00% ） 65.38% 。

2.3 MhHAK5蛋白的亞細胞定位

為了對MhHAK5進行精確的亞細胞定位，將綠色熒光（GFP）、紅色熒光（RFP）構(gòu)建MhHAK5-GFP融合體，并將其轉(zhuǎn)化到紅花煙草葉片表皮的目的細胞中。結(jié)果（圖3）顯示，對照組（GFP）中來自GFP的熒光較深且分布于細胞核和細胞質(zhì)中，而在表達MhHAK5：GFP的細胞中僅觀察到細胞核明亮熒光，且瞬時表達分析表明疊加場中定位于細胞核內(nèi)。

圖A中 P_A-P_D 表示在P環(huán)預測的氨基酸殘基的A—D位點。MhHAK、SsHAK、SbHAK、NtHAK、SiHAK、VvHAK、MdHAK、TaHAK、HvHAK、OsHAK、AtHAK、IbHAK及SeHAK分別表示垂絲海棠、甘蔗、高梁、煙草、谷子、葡萄、野生蘋果、小麥、大麥、水稻、擬南芥、甘薯及鹽角草的相關(guān)鉀轉(zhuǎn)運基因家族成員。

2.4MhHAK5在不同鉀處理垂絲海棠不同組織中的表達分析

由圖4可知，MhHAK5基因在垂絲海棠不同組織中的相對表達量表現(xiàn)為根中最高，葉中次之，莖中最低。在正常供K（CK）條件下，與根相比，MhHAK5基因在葉、莖中的相對表達量分別降低16.70% ） 67.32% ，在莖中的表達量顯著低于根中而在低鉀脅迫（LK）條件下，MhHAK5在根、莖、葉中的表達量差異顯著，在葉、莖中的表達量分別低于根中 24.24% ） 46.09% 。不同鉀處理間比較，LK條件下的MhHAK5表達量高于CK，表明低K可明顯誘導MhHAK5基因上調(diào)表達。

柱上不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。

2.5 過表達MhHAK5的擬南芥早期株系對低K的耐受性分析

為了研究MhHAK5基因的功能，從15個過表達該基因的擬南芥株系中隨機篩選出1個純合轉(zhuǎn)基因株系進行進一步的低K耐受性試驗。將萌發(fā)后的WT和MhHAK5轉(zhuǎn)基因株系種子轉(zhuǎn)人分別含有 0.5mmol/L 和2mmol/L K⁺ 的Han's營養(yǎng)液中進行培養(yǎng)。結(jié)果（圖5）顯示，在2mmol/L K⁺ （CK）條件下，WT和轉(zhuǎn)基因株系均表現(xiàn)出良好的生長狀態(tài)，形態(tài)上沒有明顯差異；然而，在0.5mmol/L K⁺（LK） 處理下，野生型和轉(zhuǎn)基因株系的根發(fā)育均受到抑制。與CK相比，LK脅迫顯著降低WT和MhHAK5轉(zhuǎn)基因株系的根長和根質(zhì)量。

2.6 過表達MhHAK5的擬南芥株系 K⁺ 吸收與生長激素含量分析

通過NMT技術(shù)測定缺鉀對過表達MhHAK5和野生型（WT）擬南芥根系分生區(qū)和伸長區(qū) K⁺ 通量的影響，由圖6A結(jié)果可知，無論施鉀水平如何，轉(zhuǎn)基因株系的根尖分生區(qū)和伸長區(qū) K⁺ 通量皆顯著高于 WT 。CK條件下，分生區(qū)的平均 K⁺ 通量為 -9.82μmol/（cm²?s） ，伸長區(qū)的通量較其顯著提高 9.04% ;而LK條件下，分生區(qū) K⁺ 通量更高，較伸長區(qū)顯著提高 299.60% 。可見，CK條件下，過表達MhHAK5株系和WT株系根尖均表現(xiàn)出明顯的 K⁺ 外排趨勢，且轉(zhuǎn)基因根尖的 K⁺ 流出幅度顯著高于WT。

由圖6B可知，CK處理植株的鉀含量高于LK處理。CK條件下，過表達MhHAK5植株和WT植株的鉀含量無顯著差異；而LK處理下，過表達MhHAK5植株的鉀含量為 1.66% ，顯著高出WT植株0.37個百分點

由圖6C、D可知，低鉀處理降低野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中的IBA和IAA含量，但過表達MhHAK5植株的含量高于野生型，且在LK條件下差異顯著。

3 討論

鉀（K）是垂絲海棠等砧木必需的礦質(zhì)養(yǎng)分，K⁺ 可調(diào)節(jié)滲透壓、蛋白質(zhì)生物合成及根系發(fā)育，且可有效促進果實品質(zhì)形成[25]。 K⁺ 的吸收與轉(zhuǎn)運受高親和力鉀轉(zhuǎn)運蛋白（HAK）調(diào)控，大量研究表明，HAK在植物生長發(fā)育、鉀離子轉(zhuǎn)運和脅迫應答過程中發(fā)揮重要作用[10]。然而關(guān)于蘋果屬HAK的生理特性及功能分析鮮有涉及。蘋果屬作為長壽的自然物種，在其生命周期中經(jīng)常遭受反復的非生物脅迫，有效調(diào)控養(yǎng)分運輸（例如鉀轉(zhuǎn)運）對于其緩解脅迫損傷尤為重要[14，18]。本研究從蘋果屬垂絲海棠中克隆得到MhHAK5基因，系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示其與擬南芥的AtHAK5、AtHAK10及水稻的OsHAK7關(guān)系最為密切；氨基酸序列分析結(jié)果顯示，其4個P環(huán)保守位點的氨基酸為Ser-Gly-Gly-Gly。P環(huán)保守位點氨基酸為Ser-Gly-Gly-Gly（I型）或Gly-Gly-Gly-Gly（Ⅱ型），是另一高親和力鉀轉(zhuǎn)運蛋白HKT家族的典型標志[26]。前人研究表明，多數(shù)植物所含高親和力鉀轉(zhuǎn)運蛋白系統(tǒng)主要分為KT/KUP/HAK超家族（以HAK為主）與HKT家族[27]，但薔薇科植物在進化過程中HKT基因發(fā)生重大丟失，導致HKT家族成員數(shù)量極少[28]，如薔薇科蘋果屬蘋果種中只有1個HKT蛋白（MdHKT1）[29]。而蘋果屬海棠種在進化過程中HAK、HKT家族經(jīng)歷著相似的基因的復制與轉(zhuǎn)移，使得這兩個家族成員的功能結(jié)構(gòu)與進化高度一致[30]，這也是本研究中MhHAK5蛋白P環(huán)保守位點的氨基酸為Ser-Gly-Gly-Gly的原因。此外，在氨基酸242、273的孔環(huán)結(jié)構(gòu)域位置檢測到天冬酰胺殘基，表明甘氨酸、絲氨酸可能并不是唯一的鉀轉(zhuǎn)運作用元件

HAK5是KT/KUP/HAK家族的明星基因，目前的研究表明該基因具有良好的鉀運輸及調(diào)節(jié)活性氧分解功能[31]。本研究結(jié)果表明，MhHAK5基因全長 1830bp ，ORF長 1695bp ，編碼518個氨基酸。MhHAK5蛋白的分子量為 60.05kDa ，等電點為7.45，脂肪系數(shù)為88.69，疏水指數(shù)-0.34，不穩(wěn)定指數(shù)為47.92，是一種不穩(wěn)定的堿性親水蛋白，定位于細胞核；其二級結(jié)構(gòu)由 $＼textbf { ＼alpha - }$ 螺旋（49.62% ）、無規(guī)則卷曲（ （27.39% ）、延伸鏈（17.76%） 和 β- 轉(zhuǎn)角（ （5.23%） 組成，存在4個跨膜結(jié)構(gòu)，這與Guo等[8]研究得出的HAK家族具有4＼～12個跨膜結(jié)構(gòu)的結(jié)論基本一致。

表達模式是反映基因功能強弱的重要表征先前的報道表明， K⁺ 轉(zhuǎn)運蛋白的轉(zhuǎn)錄與翻譯水平是響應植物低 K⁺ 脅迫的兩個主要機制[32]；同時翻譯后調(diào)控，尤其是磷酸化調(diào)控，在調(diào)節(jié) K⁺ 轉(zhuǎn)運蛋白活性方面發(fā)揮著重要作用。本研究結(jié)果表明，MhHAK5在垂絲海棠根中的相對表達量較高，且低K脅迫可誘導MhHAK5上調(diào)表達，這表明在生長發(fā)育過程中，植株根系對鉀動態(tài)變化較敏感，低鉀可有效誘導MhHAK5表達。提高K轉(zhuǎn)運蛋白的翻譯與后續(xù)的轉(zhuǎn)錄表達水平是提高植物鉀素利用率的有效方法[33]。本研究將MhHAK5在擬南芥中過表達，發(fā)現(xiàn)過表達MhHAK5可提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對低K環(huán)境的耐受性。這與丁寶娟等[33]研究得出的過表達ZmHAK5可保障低鉀條件下玉米植株正常生長的結(jié)果基本一致。

鉀離子的吸收與外排是影響?zhàn)B分離子生理平衡及改善低K脅迫的重要前提。前人研究顯示在水稻中過表達OsHAK5可增加 K⁺ 吸收以及鉀限制條件下的 K⁺/Na⁺ 比率，從而影響 K⁺ 外排[34]。本研究結(jié)果表明，在正常鉀水平和低鉀條件下，過表達MhHAK5擬南芥株系根尖 K⁺ 通量均顯著高于野生型（WT）植株;但正常施鉀處理條件下， K⁺ 表現(xiàn)為外排，而在低鉀條件下則表現(xiàn)為吸收，這可能有助于細胞維持離子平衡。植株鉀含量測定表明，低鉀條件下轉(zhuǎn)基因植株的鉀含量顯著高于WT，這證實了在缺K條件下，MhHAK5基因過表達能促進植株對 K⁺ 的吸收。這與Ding等[5]在煙草中的研究結(jié)果一致，即與WT品系相比，NtHTK1.3轉(zhuǎn)基因煙草品系具有更高的K含量。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，低鉀脅迫可顯著提高過表達MhHAK5擬南芥植株的IAA、IBA含量。前人研究表明，KT/KUP/HAK家族成員的啟動子順式元件中包含植物激素響應模塊，在應對非生物脅迫時可誘導內(nèi)源激素的合成[19，27]。因此，我們推測過表達MhHAK5對植物體內(nèi)的鉀轉(zhuǎn)運及生長激素分泌具有雙重作用

4結(jié)論

本研究結(jié)果表明，蘋果屬垂絲海棠MhHAK5基因全長 1830bp ，ORF長 1695bp ，編碼518個氨基酸。其編碼蛋白主要由 ∝ -螺旋和無規(guī)則卷曲組成，存在4個跨膜結(jié)構(gòu)，是一種不穩(wěn)定的疏水蛋白，定位于細胞核內(nèi)。MhHAK5與AtHAK5、AtHAK10、OsHAK5相似性高，均屬于KT/KUP/HAK家族的I型亞家族。MhHAK5在垂絲海棠葉、莖、根中均有表達，以根中表達量最高，且受低鉀脅迫誘導。低鉀條件下過表達MhHAK5可顯著提高擬南芥的鉀離子通量及植株K含量，促進生長激素IAA和IBA分泌，從而保障根系發(fā)育。本研究結(jié)果可為耐低鉀蘋果砧木的基因改良與選育提供理論依據(jù)。

參考文獻：

［1］武兆云，薛剛，孫聚濤，等.擬南芥鉀離子吸收、轉(zhuǎn)運及低鉀 脅迫的分子機理研究進展［J].植物科學學報，2022，40 （3） ：426-436.

[2］楊曉燕，趙錯源，鄭洪健，等.植物鉀營養(yǎng)利用及性狀遺傳 研究進展[J].華北農(nóng)學報，2022，37（增刊）：275-282.

[3］張麗紅，劉英杰，張宏，等.根際微生態(tài)系統(tǒng)中鉀素轉(zhuǎn)化與 循環(huán)研究進展[J].山東農(nóng)業(yè)科學，2023，55（3）：166-172.

[4]Sun T T，Zhang J K，Zhang Q，et al. Transcriptional and metabolic responses of apple to different potassium environments [J].Frontiers in Plant Science，2023，14：1131708.

[5］陳光，高振宇，徐國華.植物響應缺鉀脅迫的機制及提高鉀 利用效率的策略[J].植物學報，2021，52（1）：89-101.

[6]Zhu H，Guo JY，Ma T，et al. The sweet potato K⁺ transporter IbHAK11 regulates K⁺ deficiency and high salinity stress tolerance by maintaining positive ion homeostasis[J].Plants，2023， 12（13） ：2422.

[7］蘇文，劉敬，王冰，等.植物高親和鉀離子轉(zhuǎn)運蛋白HAK功 能研究進展[J].生物技術(shù)通報，2020，36（8）：144-152.

[8]Guo Q，Meng S，Tao S C，et al. Overexpression of a samphire high-afinity potassium transporter gene SbHKTl enhances salt tolerance in transgenic cotton[J]. Acta Physiologiae Plantarum，2020，42：36.

[9]Santamaria G E，Oliferuk S，Moriconi JI. KT-HAK-KUP transporters in major terrestrial photosynthetic organisms：a twenty years tale[J]. Journal of Plant Physiology，2018，226：77-90.

[10］金雨濛，楊晗，申長衛(wèi)，等.杜梨響應低鉀和鹽脅迫基因 Pb 1 HAKI7的克隆及功能分析［J].植物營養(yǎng)與肥料學報， 2023，29（11） ：2120-2131.

[11]Riedelsberger J，Miller JK，Valdebenito M B，et al. Plant HKT chanels ： an updated view on structure， function and gene regulation[J]. International Journal of Molecular Sciences，2021， 22（4） ：1892.

[12］李鴿子，劉金，張丹丹，等.TaHIPP32與TaHAKl表達及小 麥缺鉀脅迫耐性的關(guān)系「I].麥類作物學報.2023.43（2）. 131-140.

[13]Rubio F，Gassmann W，Schroeder JI. High-affinity potassium uptake in plants-response[J]. Science，1996，273（5277）： 978-979.

[14］楊倩，趙京.AM真菌與印度梨形孢對干旱脅迫下垂絲海棠 生長發(fā)育和水分利用的影響[J].中國果樹，2023（4）：42- 48，55.

[15］賈旭梅，朱燕芳，王海，等.垂絲海棠應對鹽堿復合脅迫的 生理響應[J].生態(tài)學報，2019，39（17）：6349-6361.

[16］徐新翔，侯昕，賈志航，等.供鉀水平對蘋果砧木M9T337幼 苗生長、光合特性與 ¹⁵N，¹³C 吸收利用的影響[J].應用生 態(tài)學報，2019，30（6）：1861-1868.

[17］蔣金金，蘇漢東，洪登峰，等.植物生物技術(shù)研究進展[J]. 植物生理學報，2023，59（8）：1436-1462.

[18］張瑞，張仲興，張夏燚，等.蘋果屬垂絲海棠MhPPOX1基因 克隆及抗缺鐵性功能鑒定［J]．西北植物學報，2020，40 （10）：1627-1637.

[19]Yang Y L，Cheng JJ，Han HR，et al. Genome-wide identification of the HKT transcription factor family and their response to salt stress in foxtail millet （Setaria italica）[J].Plant Growth Regulation，2023，99（1） ：113-123.

[20]張仲興，程麗，王雙成，等.垂絲海棠MhMYB114-Like的克 隆及其在蘋果愈傷組織中的抗缺鐵功能鑒定[J]．園藝學 報，2021，48（1） ：127-136.

[21］朱飛雪，程玉江，郭麗.蝴蝶蘭WRKY57基因的克隆、亞細胞 定位及響應脫落酸功能分析［J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2023，51 （18） ：54-62.

[22] Zhang Z X，Cheng J，Wang S C，et al. Molecular cloning and functional characterization of MhHEC2-like genes in Malus halliana reveals it enhances Fe（iron）deficiency tolerance[J]. Functional and Integrative Genomics，2022，22（6） ：1283-1295.

[23]Yu Y C，Kou M，Gao Z H，et al. Involvement of phosphatidylserine and triacylglycerol in the response of sweet potato leaves to salt stress[J]. Frontiers in Plant Science，2019，10：1086.

[24］鮑士旦.土壤農(nóng)化分析［M].第三版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版 杠，2000：32-33.

[25]Jin R，Zhang AJ，Sun J，et al. Identification of Shaker K⁺ channel family members in sweetpotato and functional exploration of IbAKTI[J]. Gene，2021，768：145311.

[26］蔣薇.甘薯鉀離子轉(zhuǎn)運體IbHKT-like基因的克隆及功能初 步驗證[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學院，2021：3-4.

[27］代書桃，朱燦燦，馬小倩，等.谷子HAK/KUP/KT鉀轉(zhuǎn)運蛋 白家族全基因組鑒定及其對低鉀和高鹽脅迫的響應［J]. 作物學報，2023，49（8）：2105-2121.

[28]Zhang SC，Tong Y X，LiYJ，et al.Genome-wide identification of the HKT genes in five Rosaceae species and expression analysis of HKT genes in response to salt-stress in Fragaria vesca [J].Genesamp;Genomics，2019，41（3）：325-336.

［29］楊琳.蘋果鉀轉(zhuǎn)運蛋白基因家族表達及干旱條件下根系鉀 吸收轉(zhuǎn)運特性分析[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學，2016.

[30]Tahir M M，Tong L，Xie L L，et al. Identification of the HAK gene family reveals their critical response to potassium regulation during adventitious root formation in apple rootstock[J]. Horticultural Plant Journal，2023，9（1） ：45-59.

[31］柴薇薇，王文穎，崔彥農(nóng)，等.植物鉀轉(zhuǎn)運蛋白KUP/HAK/ KT家族研究進展[J].植物生理學報，2019，55（12）：1747- 1761.

[32］段慧榮，周學輝，胡靜，等.高等植物 K⁺ 吸收及轉(zhuǎn)運的分子 機制研究進展[J].草業(yè)學報，2019，28（9）：174-191.

［33］丁寶娟，安利佳，蘇喬.過表達鉀轉(zhuǎn)運蛋白基因 trkH 提高玉 米的鉀營養(yǎng)[J].植物研究，2020，40（1）：141-147.

[34]Chen G，HuQ D，Luo L，et al. Rice potassium transporter Os HAK1 is essential for maintaining potassium-mediated growth and functions in salt tolerance over low and high potassium concentration ranges[J]. Plant，Cell and Environment，2015，38 （12） ：2747-2765.

[35]Ding B J，Zhang X Y，Xu Y S，et al. The bacterial potassium transporter gene MbtrkH improves K⁺ uptake in yeast and tobacco[J]. PLoS ONE，2020，15（8） ：e0236246.