光譜流式細(xì)胞儀在生物材料檢測(cè)中的應(yīng)用研究

中圖分類號(hào)：Q631 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2025.03.004

Abstract：Asadetection instrument developed rapidlyinrecent years，the spectral flowcytometer primarilycomplemented traditionalflowcytometry.Thisarticledemonstratedtheperformanceof threespectralflowcytometers inthedetectionof fluorescent materials，demonstratingtheirpotentialapplications inthefieldofbiological materials.Studies showedthatthe spectral flowcytometercouldnotonlyexplorefluorescencefromnon-primarybandsofknown fluorescent dyes，but also decompose overlapping spectrabetween fluorescentmaterials，andreagentkitdetectionchannels，esulting inmoreaccurate analyticalresultsdditioallyituldtecttesctralsiftsoffuorestomaterialsiinell.Ialltstral flowcytometercouldrecordthespectralcharacteristicsoffluorescentmaterialsenteringcels，analyethespectralbehaviorof fluorophores within cells，and spectrallyresolve fluorescence signals that overlapped with detection channels，thus providing objective fluorescence data.These capabilities opened up new paths for the research offluorescent materials，providing theoreticalfoundationsaswellaspracticalreferencesforthewidespreaduseofspectralflowcyometryinbiomaterialsscience

Key words： spectral flow cytometry; biological materials; fluorescent materials; fluorescence spectrum shift;spectral separation

（ActaLaser BiologySinica，2025，34（3）：221-228）

近年來，流式細(xì)胞儀及流式細(xì)胞術(shù)發(fā)展迅猛，研究人員創(chuàng)新研究了多種類型的流式細(xì)胞儀，包括光譜流式細(xì)胞儀（spectrumflowcytometry）、質(zhì)譜流式細(xì)胞儀（masscytometry）、成像流式細(xì)胞儀（imagingcytometry）以及組織成像質(zhì)譜流式細(xì)胞儀（imagingmasscytometry）等。這些新儀器及相應(yīng)檢測(cè)技術(shù)的出現(xiàn)，不僅擴(kuò)展了流式細(xì)胞技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域，還提高了研究的維度和精度。本文將通過光譜流式細(xì)胞儀在生物材料檢測(cè)中的應(yīng)用研究，探討如何將光譜流式細(xì)胞儀的應(yīng)用從傳統(tǒng)領(lǐng)域擴(kuò)展至醫(yī)工交叉、生工交叉等新興領(lǐng)域，為科學(xué)研究和技術(shù)開發(fā)提供新的思路和方法。

傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)與光譜流式細(xì)胞術(shù)的核心區(qū)別在于光檢測(cè)方法。傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)采用雙色鏡和帶通濾光片選擇特定波長(zhǎng)范圍的光信號(hào)，并通過光電倍增管（photomultiplier，PMT）進(jìn)行檢測(cè)；而光譜流式細(xì)胞術(shù)則利用光柵或棱鏡將光色散至檢測(cè)器陣列上。這樣，在相同的激發(fā)波長(zhǎng)下，傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)只能檢測(cè)有限的幾個(gè)發(fā)射波長(zhǎng)，如 488nm 波長(zhǎng)激光激發(fā)下的異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）、藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）、多甲藻黃素-葉綠素-蛋白質(zhì)復(fù)合物（peridininchlorophyll-proteincomplex，PerCP）等通道，而光譜流式細(xì)胞術(shù)可以檢測(cè)10多個(gè)發(fā)射波長(zhǎng)，即接收該激發(fā)光所激發(fā)的熒光基團(tuán)的完整發(fā)射光譜。

基于光譜流式細(xì)胞儀的特征及特性，其與熒光分光光度計(jì)的功能有一定程度上的重合，即熒光分光光度計(jì)是用于掃描液相熒光標(biāo)記物所發(fā)出的熒光光譜的一種儀器，激發(fā)波長(zhǎng)掃描范圍一般是200～900nm ，發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍是 200～900nm ，可用于液體、凝膠條等樣品的光譜掃描。然而，光譜流式細(xì)胞儀則能夠記錄熒光材料在細(xì)胞中不同激發(fā)光下的發(fā)射光譜，提供更為精細(xì)和全面的分析結(jié)果。

本文將應(yīng)用光譜流式細(xì)胞儀對(duì)生物材料進(jìn)行檢測(cè)研究，并重點(diǎn)探討其在以下三個(gè)方面的應(yīng)用：對(duì)已知熒光染料的非主要波段熒光的探索；熒光材料與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒的熒光染料和熒光探針發(fā)射光重疊后的光譜拆分試驗(yàn)；熒光納米材料在細(xì)胞內(nèi)的光譜移動(dòng)。通過上述研究工作，本文旨在拓展光譜流式細(xì)胞儀在生物材料領(lǐng)域檢測(cè)中的應(yīng)用。

1材料與方法

1.1材料

I.1.1探索熒光染料的非主要熒光波段所需材料

人乳腺癌細(xì)胞系MCF7購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞培養(yǎng)在添加了 10% 胎牛血清、 1% 青霉素和鏈霉素（penicillin-streptomycin，SolarbioScienceamp;Technology）的DMEM（Dulbecco’smodified Eaglemedium，ThermoFisherScientificGibco）培養(yǎng)基中?；钚匝鯔z測(cè)試劑盒購(gòu)于上海翌圣生物科技股份有限公司，貨號(hào)為50101 ES01。

1.1.2熒光材料與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒的熒光 染料和熒光探針發(fā)射光重疊后的光譜拆分試驗(yàn)所 需材料

人前列腺癌細(xì)胞系CL-1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞培養(yǎng)在 10% 胎牛血清、 1% 青霉素和鏈霉素的F12K（Ham'sF-12Kmedium，ThermoFisherScientificGibco）培養(yǎng)基中。三個(gè)藥物載體分別為二氫氯化巴諾沙安（banoxantronedihydrochloride，AQ4N）、7-乙基-10-羥基喜樹堿（7-ethyl-10-hydroxycamptothecin，SN38）、吲哚菁綠（indocyaninegreen，ICG）。凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)為BA00102。

1.1.3檢測(cè)熒光納米材料在細(xì)胞內(nèi)光譜移動(dòng)所需材料

人宮頸癌細(xì)胞系HeLa購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞培養(yǎng)在添加了 10% 胎牛血清、 1% 青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中。材料為具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光特性的熒光探針二乙烯三胺五乙酸-2，5-雙（噻吩）-磷酰胺（DTPA-2，5-BT-P）兩親性聚合物二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000）。

1.2 方法

1.2.1 已知熒光染料的非主要波段的熒光探索

1.2.1.1 原位裝載探針

1）細(xì)胞準(zhǔn)備：檢測(cè)前一天進(jìn)行細(xì)胞鋪板，確保檢測(cè)時(shí)細(xì)胞匯合度達(dá)到 50%～70% 。

2）藥物誘導(dǎo)：去除細(xì)胞培養(yǎng)基，加入適量經(jīng)合適的緩沖液或無血清培養(yǎng)基稀釋到工作濃度的藥物，于 37^°C 細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育。具體誘導(dǎo)時(shí)間根據(jù)藥物本身特性，以及細(xì)胞類型來決定。

3）探針準(zhǔn)備：探針裝載前按照 1：1 000 的體積 比用無血清培養(yǎng)基稀釋 2^′，7^′. 二氯二氫熒光素二乙 酸酯（DCFH-DA），使其終濃度為 10μmol/L 。

4）探針裝載：吸除誘導(dǎo)用藥物，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA工作液，加入的體積以能充分覆蓋細(xì)胞為宜。例如，對(duì)于6孔板通常不少于1000μL ，對(duì)于96孔板通常不少于 100μL 。 37% 細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育 30min ，孵育時(shí)間長(zhǎng)短與細(xì)胞類型、刺激條件以及DCFH-DA濃度有關(guān)，根據(jù)試驗(yàn)情況自行摸索。

5）細(xì)胞清洗：用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1＼～2次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。

1.2.1.2 收集細(xì)胞后裝載探針

1）細(xì)胞準(zhǔn)備：按照標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)細(xì)胞，必須保證檢測(cè)用細(xì)胞狀態(tài)良好。按照適當(dāng)方法，清洗并收集足量的細(xì)胞。

2）藥物誘導(dǎo)：將收集好的細(xì)胞懸浮于適量稀釋好的藥物中，于 37% 細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育，具體誘導(dǎo)時(shí)間根據(jù)藥物本身特性以及細(xì)胞類型來決定。

3）探針準(zhǔn)備：探針裝載前，按照 1：1000 的體積 比用無血清培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA，使其終濃度為 10μmolL 。

4）探針裝載：去除細(xì)胞內(nèi)藥物，離心收集細(xì)胞，加入適當(dāng)稀釋好的探針，使其細(xì)胞密度為每孔1×10⁶～2×10⁷ 個(gè)細(xì)胞。

5）細(xì)胞清洗：用無血清細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1＼～2次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。

6）上機(jī)檢測(cè)。

1.2.2熒光材料與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒中熒光染料及熒光探針的發(fā)射光譜重疊區(qū)域的拆分試驗(yàn)

將人前列腺癌細(xì)胞系CL-1以每毫升 1×10⁵ 個(gè)的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)。接著，分別加入AQ4N、SN38、ICG對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，處理時(shí)間為 6n 。處理完成后，使用不含乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetra-aceticacid，EDTA）的胰蛋白酶將細(xì)胞進(jìn)行消化， 4^°C，300g 離心 5min ，收集細(xì)胞;隨后，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖鹽水（phosphate-bufferedsaline，PBS）洗滌細(xì)胞兩次， 4°C，300g 離心 5min 吸棄PBS，加入 100μL 結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞；向混勻后的細(xì)胞中加入AnnexinV-AF488和碘化丙啶（propidiumiodide，PI）染液各 5μL ；室溫避光孵育15min ；加入 400μL 結(jié)合緩沖液，混勻后放置于冰上，樣品在1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.3熒光納米材料在細(xì)胞內(nèi)的光譜移動(dòng)檢測(cè)

1.2.3.1 DTPA-2，5-BT-P納米粒子的制備

采用納米沉降法制備DTPA-2，5-BT-P的納米粒子時(shí)，首先將 1mg 化合物和 2mg DSPE-PEG2000溶于 1mL 四氫呋喃（tetrahydrofuran，THF）中，隨后取100μL 溶液加入到快速攪拌的 5mL 超純水中攪拌30s ，放置于通風(fēng)櫥中靜置2h以除去體系中殘留的THF，得到相應(yīng)的納米材料待用。

1.2.3.2 單細(xì)胞懸液的制備

1）將 1×10⁵ 個(gè)HeLa細(xì)胞接種于 3.5cm 培養(yǎng)皿內(nèi)，孵育 24h ，待細(xì)胞完全貼壁后，加人含濃度為2μmol/L 的DTPA-2，5-BT-P納米粒子的培養(yǎng)基， 3h 后，除去培養(yǎng)基，加入 2mL PBS，潤(rùn)洗培養(yǎng)血內(nèi)細(xì)胞，重復(fù)3次。

2）培養(yǎng)皿內(nèi)加入 1mL 胰蛋白酶消化液， 37% 消化 2min ，加入 1mL DMEM高糖培養(yǎng)基終止消化。

3）加入 2mL PBS洗滌細(xì)胞，離心，重懸細(xì)胞，用于流式上機(jī)檢測(cè)。

1.3 主要儀器

光譜流式細(xì)胞儀由杭州譜康醫(yī)學(xué)科技有限公司生產(chǎn)。型號(hào)：SFLO；配置：三激光三十九通道（三種激光激發(fā)波長(zhǎng)分別為4 105、488、635nm ；分析軟件：CytoPysual，版本號(hào)為3.4。

熒光分光光度計(jì)由PerkinElmer公司生產(chǎn)，型號(hào)為L(zhǎng)S-55。

2 結(jié)果與分析

2.1已知熒光染料的非主要波段熒光探索

傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀只能檢測(cè)熒光染料在主激發(fā)波段下的熒光，而光譜流式細(xì)胞儀可以檢測(cè)非主波段的熒光，這使我們能夠獲得更全面的熒光特性信息。進(jìn)一步的探索可以幫助我們理解不同熒光染料的多重激發(fā)響應(yīng)及其在復(fù)雜細(xì)胞環(huán)境中的表現(xiàn)。

檢測(cè)基于熒光染料DCFH-DA的熒光強(qiáng)度的變化是定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的最常用方法。DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成2'，7'-二氯二氫熒光素（DCFH），而DCFH不會(huì)通過細(xì)胞膜，因此探針很容易被積聚在細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的活性氧能夠氧化無熒光的DCFH生成有熒光的 2^′，7^′. 二氯熒光素（DCF）。綠色熒光強(qiáng)度與活性氧的水平成正比，可以通過熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀或激光共聚焦顯微鏡，檢測(cè)在最大激發(fā)波長(zhǎng) 480nm 和最大發(fā)射波長(zhǎng) 525nm 處的熒光信號(hào)。

按照試劑盒說明書提供的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)設(shè)置進(jìn)行DCF熒光檢測(cè)，此染料的熒光檢測(cè)通道為FITC通道。而使用光譜流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)與人乳腺癌細(xì)胞系MCF7的背景光譜（圖1a）相比，DCF在 405nm 波長(zhǎng)的激光中也能激發(fā)出較強(qiáng)熒光，其檢測(cè)通道為V5-H（ 530nm/20nm ））（圖1b）。

光譜圖劃線部分指對(duì)應(yīng)熒光通道的熒光強(qiáng)度為 10³ 相對(duì)熒光強(qiáng)度（relative fluorescence intensity，RFI），橫軸 V1-H～V15-H 為激發(fā)波長(zhǎng)為 405nm 激光激發(fā)的熒光發(fā)射波長(zhǎng)檢測(cè)通道， B1-H～B15-H 為激發(fā)波長(zhǎng)為 488nm 激光激發(fā)的熒光發(fā)射波長(zhǎng)檢測(cè)通道， R1-H～R9-H 為激發(fā)波長(zhǎng)為 635nm 激光激發(fā)的熒光發(fā)射波長(zhǎng)檢測(cè)通道。

2.2熒光材料與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒中熒光染料 及熒光探針發(fā)射光譜重疊區(qū)域的光譜拆分

光譜流式細(xì)胞儀在記錄熒光素的發(fā)射光譜特征后，通過算法拆分能夠?qū)鹘y(tǒng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)通道無法區(qū)分開的熒光區(qū)分開，并記錄其各自真實(shí)的熒光強(qiáng)度，使用該設(shè)備可以解決傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀熒光檢測(cè)通道無法檢測(cè)的熒光材料與熒光材料之間、熒光材料與檢測(cè)試劑熒光之間單通道檢測(cè)重疊的熒光數(shù)據(jù)的問題。

使用光譜流式細(xì)胞儀分別記錄五種熒光素在三種激發(fā)波長(zhǎng)激光下的發(fā)射光譜特征，可以看到與細(xì)胞背景熒光（圖2a）相比，AF488的最佳信號(hào)是

（a）人乳腺癌細(xì)胞系MCF7的背景光譜；（b）DCF熒光光譜。 （a）Background spectrum of human breast cancer cell line MCF7; （b）The fluorescence spectrum of DCF.

在 488nm 激光激發(fā)下的B2-H通道（ 530nm/20nm ）（圖2b）；PI的最佳信號(hào)是在 488nm 激光激發(fā)下的B6-H通道（ 615nm/25nm ）（圖2c）；AQ4N的最佳信號(hào)是在 635nm 激光激發(fā)下的R3-H通道（ 700nm/ 20nm （圖2d）；ICG的最佳信號(hào)是在 635nm 激光激發(fā)下的R4-H通道（ 720nm/20nm （圖2e）;SN38的最佳信號(hào)是在 405nm 激光激發(fā)下的V7-H通道0 570nm/20nm （圖2f）。其中AQ4N和ICG的最佳信號(hào)通道非常接近，ICG在B6-H通道也有較強(qiáng)信號(hào)。這些熒光信號(hào)使用傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀很難區(qū)分開，并且AQ4N和ICG在B8-H至B15-H通道，也有明顯強(qiáng)于細(xì)胞背景熒光的信號(hào)；B8-H與B6-H通道接近，在傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀上會(huì)影響PI通道的信號(hào)，但使用光譜流式細(xì)胞儀通過光譜拆分的方法，可以得到相對(duì)客觀的熒光信號(hào)和試驗(yàn)結(jié)果（圖2g）。

2.3熒光納米材料在細(xì)胞內(nèi)的光譜移動(dòng)

在以往的醫(yī)工交叉、生工交叉等學(xué)科交叉的材料學(xué)研究中，通常使用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)得到材料的熒光激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)，作為材料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的檢測(cè)依據(jù)。而通過光譜流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，一些材料的熒光在進(jìn)入細(xì)胞后會(huì)發(fā)生移動(dòng)，本文中所舉實(shí)例為熒光發(fā)生藍(lán)移。

使用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DTPA-2，5-BT-P納米粒子在 460，405nm 激發(fā)光激發(fā)下的最佳發(fā)射光波長(zhǎng)分別為 680nm 和 690nm （圖3a、3b）。而使用光譜流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與人宮頸癌細(xì)胞系HeLa的背景光譜（圖3c）相比，納米粒子進(jìn)入細(xì)胞后，在 488nm 和 405nm 激光激發(fā)下，最佳發(fā)射光波長(zhǎng)分別藍(lán)移至B6-H通道（ 615nm/25nm ）和V7-H通道 （570nm/20nm （圖3d）。

3 討論

2004年，Robinson[在國(guó)際分析細(xì)胞學(xué)學(xué)會(huì)（現(xiàn)為細(xì)胞學(xué)進(jìn)展學(xué)會(huì)）首次提出了功能性光譜流式細(xì)胞術(shù)，同年光譜流式技術(shù)在光子學(xué)領(lǐng)域的出版物中被首次報(bào)道，隨后普渡大學(xué)在2007年獲得了該技術(shù)的專利。2011年，索尼公司從普渡大學(xué)獲得光譜流式技術(shù)的專利許可，并開始致力于開發(fā)光譜流式細(xì)胞儀。經(jīng)過近20年的發(fā)展，光譜流式技術(shù)從理論走向了推廣應(yīng)用，然而，在整體應(yīng)用方向上還是對(duì)傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀的拓展和延伸[2]。

在這二十年間，光譜流式技術(shù)憑借其獨(dú)特的檢測(cè)原理，在扣除細(xì)胞自發(fā)熒光和支持多色標(biāo)記分析方面有著出色的表現(xiàn)[3-4]。陳家歡等[5]研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀在分析自發(fā)熒光樣本時(shí)，使用FITC-AnnexinV/PI染色相對(duì)困難，而光譜流式細(xì)胞儀在

分析自發(fā)熒光樣本時(shí)，使用FITC或APC標(biāo)記的AnnexinV/PI染色表現(xiàn)良好，這進(jìn)一步驗(yàn)證了光譜流式技術(shù)在分析細(xì)胞自發(fā)熒光上的優(yōu)勢(shì)。光譜流式技術(shù)在多色應(yīng)用上的優(yōu)勢(shì)更為明顯，特別是在20色以上。例如：利用43色光譜流式細(xì)胞術(shù)可以表征常規(guī)和非常規(guī)T細(xì)胞亞群、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和先天淋巴樣細(xì)胞；利用31色光譜流式細(xì)胞術(shù)可以研究人T細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)表型[7]；利用41色光譜流式細(xì)胞術(shù)能夠表征小鼠淋巴和骨髓中的各種共抑制分子及其配體等[8]。

在近些年較熱的腫瘤免疫領(lǐng)域，光譜流式細(xì)胞術(shù)的以上優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)得更為明顯。以CD38細(xì)胞亞群研究為例， Ng 等9的研究結(jié)果表明，CD38是肝細(xì)胞癌患者接受免疫檢查點(diǎn)治療（抗PD-1/PD-L1）時(shí)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的陽性預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物。該研究通過光譜流式細(xì)胞技術(shù)驗(yàn)證了CD38在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)，并使用CD14、CD16、CD11c、CD68、CD11b和HLA-DR等進(jìn)行髓系譜系和細(xì)胞亞群定義。Bauman等[10]在西妥昔單抗耐藥的復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移性鱗狀細(xì)胞癌患者中，研究了抗HGF抗體和抗EGFR抗體聯(lián)合治療的免疫特征變化，發(fā)現(xiàn)外周 cos8⁺T 細(xì)胞的增加與治療反應(yīng)相關(guān)。在免疫治療研究的應(yīng)用中，Mukherjee等[]發(fā)現(xiàn)，在接受抗PD-1治療的晚期胰腺癌患者中，CCL5是一種預(yù)后不良的血液生物標(biāo)志物，與較低的總生存率相關(guān)，作者提出CCL5與抗PD-1聯(lián)合使用有望克服腫瘤治療中的耐藥性問題。Johnson等[2的研究表明，MHCII類調(diào)節(jié)肺腺癌中浸潤(rùn)的T細(xì)胞以及隨后對(duì)抗PD-1治療的反應(yīng)，CIITA的過表達(dá)增加了T細(xì)胞浸潤(rùn)和腫瘤對(duì)抗PD-1治療的反應(yīng)。Yang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、 CD4⁺ 和 CD8^+? T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中抑制檢查點(diǎn)Tim-3上調(diào)，Tim-3、PD-1和Lag3抗體的聯(lián)合使用則增強(qiáng)了MC38荷瘤小鼠中CD8⁺ T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，促進(jìn)了腫瘤消退并提高了生存率。在探索新的癌癥治療靶點(diǎn)時(shí)，光譜流式細(xì)胞儀已成為免疫學(xué)評(píng)估的有力工具，被廣泛應(yīng)用于評(píng)估骨髓中的T細(xì)胞、B細(xì)胞、造血祖細(xì)胞和造血干細(xì)胞等[1416]。此外，光譜流式細(xì)胞儀也在腫瘤疫苗的開發(fā)與研究中起到了重要作用，通過量化多種轉(zhuǎn)錄因子（T-bet、Gata3、RORγt、Bcl6、Foxp3）的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)免疫細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能表征，從而用于疫苗研究[17]。

隨著科學(xué)研究正在向著學(xué)科交叉融合的方向推進(jìn)，科學(xué)儀器的應(yīng)用范圍也在不斷擴(kuò)展，它們不僅繼續(xù)在最初的研發(fā)領(lǐng)域中發(fā)揮作用，同時(shí)也滲透到其他相關(guān)領(lǐng)域，創(chuàng)造出新的應(yīng)用方向和方法。本文上述應(yīng)用檢測(cè)技術(shù)的研究，針對(duì)試驗(yàn)過程中的實(shí)際問題和現(xiàn)象，通過光譜流式細(xì)胞儀得到了解決，并闡明了其解決問題的技術(shù)特點(diǎn)。

從已知熒光染料的非主要波段熒光探索試驗(yàn)中得到的提示表明，已知的熒光材料和熒光基團(tuán)在非主激發(fā)光激發(fā)下，可能會(huì)產(chǎn)生接近主激發(fā)光激發(fā)下發(fā)射光強(qiáng)度的發(fā)射光。這為在試驗(yàn)中遇到主激光故障或主激光激發(fā)下的發(fā)射光與其他熒光重疊時(shí)提供了備選方案。特別是在傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀細(xì)胞檢測(cè)中，非主激光激發(fā)所產(chǎn)生的較強(qiáng)發(fā)射光可以在一定程度上替代主激光激發(fā)的作用。

從熒光材料與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒中熒光染料及熒光探針的發(fā)射光譜重疊區(qū)域的拆分試驗(yàn)中得到提示，盡管光譜的拆分是光譜流式細(xì)胞儀的主要特征和應(yīng)用，其在新熒光材料上的應(yīng)用尤為突出，然而新熒光材料進(jìn)入細(xì)胞后的光譜特性尚不明確。通過熒光納米材料在細(xì)胞內(nèi)的光譜變化這一例子可以看出，熒光材料在細(xì)胞中的光譜表現(xiàn)與在細(xì)胞外的檢測(cè)結(jié)果可能有所差異。因此，采用光譜流式細(xì)胞儀檢測(cè)多種熒光材料，或熒光材料與已知熒光探針的混合樣品，更能展現(xiàn)其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

從熒光納米材料在細(xì)胞內(nèi)的光譜移動(dòng)試驗(yàn)可以得到提示，熒光材料和熒光探針等在細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)的光譜特征存在差異。本試驗(yàn)中，熒光材料的光譜在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了明顯的藍(lán)移，這為推測(cè)某些熒光材料在進(jìn)入細(xì)胞后可能會(huì)發(fā)生光譜紅移提供了依據(jù)。我們初步推測(cè)，熒光材料的藍(lán)移可能與細(xì)胞質(zhì)的低極性有關(guān)，因?yàn)樵囼?yàn)中使用的偏極性熒光材料在低極性環(huán)境中容易發(fā)生藍(lán)移現(xiàn)象。藍(lán)移的具體機(jī)制也將是未來研究的重點(diǎn)之一。根據(jù)試驗(yàn)現(xiàn)象及初步分析，我們發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境更為復(fù)雜，細(xì)胞內(nèi)的酸堿度、極性以及其他因素都會(huì)影響材料的光譜特性。因此，探討熒光材料進(jìn)入細(xì)胞后的光譜變化及其原因，對(duì)載藥熒光材料的研究，尤其是激光激發(fā)釋放藥物方面的應(yīng)用研究，具有重要的實(shí)際意義。通過光譜流式細(xì)胞儀檢測(cè)確定熒光材料在細(xì)胞內(nèi)的最佳激發(fā)光，不僅能夠提高藥物釋放效率，還能增強(qiáng)疾病的治療效果。

本文使用的光譜流式細(xì)胞儀僅配備了三種激光器，其光譜分析僅限于這些激光波長(zhǎng)激發(fā)的發(fā)射光譜特征。因此，本文中研究的光譜數(shù)據(jù)都基于這三種波長(zhǎng)的激發(fā)結(jié)果。但作為熒光材料方面的研究?jī)H有這三種激光是不夠的，為獲得更為客觀、完整的熒光光譜特征，需要使用更廣泛的激發(fā)波長(zhǎng)，要配備更多的激光器。比如配備六種激光器（355、405，488，561，635，808nm ，甚至可以使用類似于共聚焦顯微鏡上的白激光技術(shù)實(shí)現(xiàn)激發(fā)光波長(zhǎng)的自主選擇。白激光是基于激光來產(chǎn)生高亮度白光的一種照明光源技術(shù)[18-19]，可以在很大的波段范圍內(nèi)同時(shí)發(fā)射，而且在聚焦性能方面仍保持著激光的特性[20]，這種特性可以使得光譜流式細(xì)胞儀在材料學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用更為靈活。綜上所述，本文探討了光譜流式細(xì)胞儀在不同領(lǐng)域的潛在應(yīng)用，并為交叉學(xué)科研究方法以及光譜流式細(xì)胞儀的未來發(fā)展方向提供了新的思路。

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