淹水脅迫下甜瓜幼苗的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及生物信息學(xué)分析

中圖分類號(hào)：S652 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2025）06-014-12

Transcriptome sequencing and bioinformatics analysis of melon seedlings under waterlogging stress

WANG Yanan， JIANG Yanfang，LIU Zefa，DANG Jiancheng， ZHANG Honglei， ZHANG Zixia （HunanUveityHumities，iencedhnologyoudiooHunina）

Abstract：Waterlogging isoneof themost widespreadand frequent natural disasters worldwide.Asacucurbit crop，melon exhibits relatively poor waterlogging tolerance.When melon cultivation areas experience prolongedrainfallor flooding，severeyieldloses orevencompletecropfailureoftenoccur.Inthisstudyawaterlogging tolerant melonhighgeneration M13-06-3，wasused as experimental material. Transcriptome sequecing and quantitative real-time PCR（qRT-PCR） were employed to analyze diferentially expressed genes（DEGs）inroot tissues.The results revealed that 9037 DEGs were screned in M13-06-3 under waterlogging stress including 4529 upregulated and 4508 downregulated genes. qRT-PCR validationconfirmed that the expression patternsof five genes，MELO3Co03917，MELO3Co20588，MELO3C008314，MELO3C025360，and MELO3C021658，were largely consistent wiht the transcriptomedata，suggesting their potentialrole inmelon waterlogging tolerance.Thesefindings provideafoundationforfurther explorationof waterlogging resistant genes in melon.

Key words：Melon;Waterlogging stress;Real-time fluorescence quantitativePCR;RNA high-throughput sequencing; Differentially expressed gene

葫蘆科瓜類作物耐澇性較差，尤其是甜瓜，甜瓜屬一年生草本葫蘆科植物，喜溫?zé)釟夂?，生長(zhǎng)環(huán)境偏愛(ài)干燥排水良好的土壤，對(duì)澇濕環(huán)境耐受能力較弱，是我國(guó)重要經(jīng)濟(jì)作物。因此，甜瓜種植區(qū)域遭受持續(xù)多雨或者澇災(zāi)的影響，可能會(huì)導(dǎo)致減產(chǎn)甚至絕收。我國(guó)栽培甜瓜的重要產(chǎn)區(qū)是黃淮平原和長(zhǎng)江中下游地區(qū)，該區(qū)域受梅雨季節(jié)的影響春夏兩季雨水過(guò)于豐沛，夏季更是常有暴雨，土壤中水分過(guò)多易形成澇漬危害，影響當(dāng)?shù)芈兜卦耘嗵鸸系恼７N植，制約甜瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)。淹水脅迫是全球植物生長(zhǎng)中普遍面臨的非生物逆境之一，也是影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一，它通過(guò)影響植物的生理和分子機(jī)制，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生重要影響[1。淹水脅迫會(huì)導(dǎo)致植物在體內(nèi)堆積過(guò)量活性氧，損傷細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。植物為了維持細(xì)胞內(nèi)的水分平衡，會(huì)增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累，如脯氨酸、甜菜堿、可溶性糖和多胺等。

RNA高通量測(cè)序技術(shù)（RNA-seq）可以在轉(zhuǎn)錄組水平解析基因的表達(dá)特點(diǎn)，目前已被廣泛應(yīng)用于功能基因組研究，例如油菜2]、梔子[]、黃瓜中，但關(guān)于甜瓜耐澇性轉(zhuǎn)錄組方面的研究少有報(bào)道。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)是定量檢測(cè)基因表達(dá)的重要手段之一，已有學(xué)者將其應(yīng)用在了茶樹(shù)[中來(lái)檢測(cè)其與耐澇相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量。為探究甜瓜幼苗響應(yīng)淹水脅迫的分子調(diào)控機(jī)制，筆者通過(guò)對(duì)淹水脅迫9d后的甜瓜幼苗（M13-06-3）及未淹水脅迫的甜瓜幼苗（M13-06-3）根系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（transcriptome sequencing），并對(duì)獲得的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析、篩選甜瓜響應(yīng)淹水脅迫的差異基因，然后對(duì)差異基因進(jìn)行GO功能注釋、KOG注釋和KEGG富集分析，并挑選主要差異表達(dá)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，以期為研究甜瓜響應(yīng)澇害機(jī)制提供理論支持。

1 材料與方法

1.1材料

參與試驗(yàn)的種子材料為園藝教研室瓜類課題組選育的甜瓜耐澇種間雜交高代種M13-06-3，由薄皮甜瓜與厚皮甜瓜雜交而成，性狀更偏向于薄皮甜瓜。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)在園藝實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，2023年3月15—17日先挑選出飽滿且大小一致的36粒甜瓜M13-06-3種子進(jìn)行浸種催芽，隨后將其置于大小一致的裝有栽培基質(zhì)土的塑料營(yíng)養(yǎng)缽中，每盆播種2粒種子。待甜瓜幼苗長(zhǎng)至2葉1心后移栽至上口直徑為 30cm 、下口直徑為 21.5cm 、高為 20.5cm 的塑料不帶漏水孔的圓盆里，每盆3株。2023年5月1日，甜瓜幼苗普遍長(zhǎng)到3葉1心后，選取生長(zhǎng)勢(shì)大致相同的幼苗來(lái)進(jìn)行淹水處理。淹水處理的高度統(tǒng)一設(shè)定為超過(guò)植株根部基質(zhì)表面 3cm 。這樣的高度設(shè)置能夠確保淹水的程度相對(duì)一致，從而更好地觀察和研究淹水對(duì)甜瓜幼苗的影響。對(duì)照組采用正常的澆水方式，在表層土壤沒(méi)有干的時(shí)候不進(jìn)行澆水操作，在需要澆水的時(shí)候，要確保土壤被澆透，使甜瓜幼苗充分吸收水分。

試驗(yàn)共設(shè)置了2個(gè)處理組，即不淹水處理（NW）、淹水處理9d（TW）。淹水處理時(shí)采取分區(qū)管理的方式，每個(gè)處理均為6盆即18株，共計(jì)36株。每天及時(shí)為各處理補(bǔ)充流失的水分，有效保證處理組的淹水高度大致相同，對(duì)照組NW則進(jìn)行正常的水分管理。淹水處理后，分別對(duì)處理組NW、TW的形態(tài)、光合特性進(jìn)行測(cè)定和分析，再分別采集其根系組織放入液氮速凍，后轉(zhuǎn)入 -80^°C 超低溫冰箱中儲(chǔ)存，通過(guò)液氮研磨提取根系RNA用于轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，每個(gè)指標(biāo)進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)定，共計(jì)6個(gè)樣品。

1.3 方法

1.3.1甜瓜幼苗的生長(zhǎng)及光合特性測(cè)定2023年5月8一9日分別對(duì)甜瓜幼苗的2個(gè)處理組進(jìn)行株高、根長(zhǎng)、葉面積、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、光合參數(shù)測(cè)定，每個(gè)指標(biāo)進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)定，再取平均值。將取得的數(shù)據(jù)使用軟件GraphpadPism9.5、Excel進(jìn)行處理和作圖，使用SPSS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

株高：使用直尺從甜瓜幼苗子葉結(jié)點(diǎn)測(cè)量至生長(zhǎng)點(diǎn)。

葉面積：參照王加蓬等對(duì)甜瓜葉面積的測(cè)定方法，即葉面積 °leddash 葉長(zhǎng) × 最大葉寬 ×0.66 。

對(duì)處理后的甜瓜幼苗用干凈的水沖洗根部泥土，洗凈后使用紙巾先吸干根部水分，用剪刀將地上、地下部分離，再分別測(cè)量地上、地下鮮質(zhì)量。

光合參數(shù)測(cè)定使用iFLYaxin-1161型便攜式光合作用測(cè)定儀，測(cè)定不同淹水脅迫處理下的長(zhǎng)勢(shì)一致的甜瓜相同部位，選取晴朗天氣下09：00一11：00對(duì)4組甜瓜幼苗淹水處理進(jìn)行光合特性（凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度、胞間 CO₂ 濃度）比較試驗(yàn)。取樣時(shí)間分別為各處理組在淹水脅迫0、9d時(shí)取樣，測(cè)定其根系生長(zhǎng)指標(biāo)。

1.3.2文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序本試驗(yàn)委托南京集思慧遠(yuǎn)生物科技有限公司對(duì)M13-06-3進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。首先用Trizol試劑盒分別提取出M13-06-3中2個(gè)處理組的RNA，依次通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳與凝膠成像、Nanodrop、Agilent2100 檢測(cè)其RNA的完整性、純度（ ΔOD_260/280 ）、濃度、核酸吸收峰、RIN值、28S/18S、圖譜基線、5S峰等指標(biāo)，然后通過(guò)PCR富集構(gòu)建出cDNA文庫(kù)，用Qubit2.0初步定量、用Agilent210o檢測(cè)insertsize，insertsize符合預(yù)期后用 q -PCR準(zhǔn)確定量（文庫(kù)有效濃度 gt;2nmol?L^-1. ，完成庫(kù)檢再經(jīng)Agilent2100質(zhì)檢合格后，使用Illumi-naNovaSeq6000對(duì)其進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3.3差異基因的篩選使用Illumina NovaSeq6000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，經(jīng)堿基識(shí)別分析得到RawData，過(guò)濾后得高質(zhì)量CleanData（ Q30≥ 90.99% ，F(xiàn)ASTQ格式存儲(chǔ)）。使用軟件HISAT2以甜瓜基因組為參考進(jìn)行比對(duì)和轉(zhuǎn)錄本重構(gòu)（比對(duì)效率 96.01% 以上），再用StringTie進(jìn)行基因重建和序列拼接組裝。將得到的CleanData與參考基因組比對(duì)，對(duì)比對(duì)結(jié)果和原有注釋信息進(jìn)行分析，包括文庫(kù)質(zhì)量評(píng)估等高級(jí)分析。用Blast將拼接基因與7個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，以FPKM為衡量表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)。檢測(cè)差異表達(dá)基因時(shí)，用差異表達(dá)分析軟件DESeq2對(duì)甜瓜幼苗根部組織樣品進(jìn)行差異篩選。差異倍數(shù)是兩樣品（組）表達(dá)量比值， p value是差異表達(dá)顯著性，校正 p 值得到FDR值，控制FDR小于一定閾值可降低假陽(yáng)性率。以 Log₂ （Fold Change）絕對(duì)值丨FoldChange 且FDR lt;0.05 為標(biāo)準(zhǔn)篩選出顯著差異表達(dá)基因。

1.3.4差異表達(dá)基因功能注釋和富集分析對(duì)上一步篩選得到的DEGs使用Blast與7個(gè)公共數(shù)據(jù)庫(kù)（Swiss-Prot、COG、GO、NR、KEGG、Pfam、KOG）進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行差異表達(dá)基因功能注釋，并將其進(jìn)行GO、KOG、COG和KEGG富集分析。

1.3.5差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果篩選基因，使用DANMAN6.0軟件進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)（詳見(jiàn)表1），引物合成在南京集思慧遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行。在CFXCon-nect（BIO-RAD）儀器中進(jìn)行qRT-PCR，通過(guò)qRT-PCR分析可證實(shí)RNA-seq獲得的淹水脅迫響應(yīng)基因在甜瓜幼苗根中的表達(dá)結(jié)果。提取甜瓜幼苗（M13-06-3）淹水脅迫后0、9d時(shí)根系樣品的總RNA。使用前期提取的M13-06-3根部濃度、質(zhì)量良好的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA，然后進(jìn)行RealtimePCR反應(yīng)。通過(guò)分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從中找到M13-06-3根部在淹水脅迫下表達(dá)有所上調(diào)或下調(diào)的序列，隨機(jī)選取13個(gè)基因進(jìn)行熒光定量分析，每個(gè)樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Exce12020軟件計(jì)算試驗(yàn)結(jié)果和平均值，用SPSS計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差并進(jìn)行差異顯著性分析以及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1淹水脅迫后甜瓜幼苗的生長(zhǎng)特性

通過(guò)對(duì)甜瓜幼苗進(jìn)行不同程度淹水處理研究發(fā)現(xiàn)（圖1、表2），未進(jìn)行淹水處理的NW組葉片呈深綠色，根系茂密，長(zhǎng)勢(shì)較好，而經(jīng)淹水處理9d的TW組葉片呈黃綠色，長(zhǎng)勢(shì)差且萎蔫多，根系不定根叢生，可見(jiàn)淹水脅迫會(huì)明顯抑制葉片的生長(zhǎng)發(fā)育、光合作用以及葉綠素的合成。經(jīng)淹水處理后，甜瓜幼苗2個(gè)處理組的株高、根長(zhǎng)、地上鮮質(zhì)量、地下鮮質(zhì)量均受到不同程度影響。與對(duì)照組NW相比，TW的株高沒(méi)有受到顯著影響，但根長(zhǎng)、地上鮮質(zhì)量、地下鮮質(zhì)量均呈下降趨勢(shì)。NW、TW的根長(zhǎng)分別為 26.45.14.35cm ，同對(duì)照組相比，TW組的根長(zhǎng)下降 54.3% ，可見(jiàn)淹水脅迫對(duì)甜瓜幼苗根長(zhǎng)的影響較大，會(huì)在一定程度上抑制甜瓜幼苗根系的生長(zhǎng)和發(fā)育。

注：A、a分別為處理組NW的葉片、根系；B、b分別為處理組TW的葉片、根系。

2.2淹水脅迫后甜瓜幼苗的光合特性

經(jīng)方差分析（表3），甜瓜幼苗的2個(gè)處理組（NW、TW）在不同淹水處理下均有顯著性差異。在凈光合速率方面，NW遠(yuǎn)高于TW，結(jié)合表2、圖1發(fā)現(xiàn)，淹水脅迫嚴(yán)重影響甜瓜的生長(zhǎng)發(fā)育以及光合作用；在氣孔導(dǎo)度方面，NW與TW差異顯著，TW的氣孔導(dǎo)度遠(yuǎn)高于NW；在胞間 CO₂ 濃度、蒸騰速率方面，TW都遠(yuǎn)高于NW，且有顯著性差異。

2.3淹水脅迫后甜瓜幼苗的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

對(duì)M13-06-3根部的3個(gè)對(duì)照組樣品（NW1、NW2、NW3）和3個(gè)處理組樣品（TW1、TW2、TW3）共6個(gè)樣品進(jìn)行高通量測(cè)序，共獲得有效數(shù)據(jù)43.11Gb，所有樣品的CleanData都在 6.58Gb 以上，平均GC含量為 43.25% ，且Q30堿基百分比在90.99%～92.45% （表4），數(shù)據(jù)表明測(cè)序結(jié)果較為準(zhǔn)確。受淹水脅迫處理的TW根部篩選出的差異表達(dá)基因共有9037個(gè)，其中包含4529個(gè)差異表達(dá)基因顯著上調(diào)，4508個(gè)差異表達(dá)基因顯著下調(diào)（圖2）。將得到的基因組數(shù)據(jù)比對(duì)到甜瓜參考基因組上，獲得各個(gè)樣本的基因組比對(duì)情況，比對(duì)率為96.01%～97.25% （表5）。

2.4表達(dá)基因功能注釋

將M13-06-3中通過(guò)篩選得到的差異表達(dá)基因（DEGs）使用Blast與7個(gè)公共數(shù)據(jù)庫(kù)，包括Swiss-Prot、GO、KEGG、COG、KOG、Pfam、NR進(jìn)行比對(duì)，并進(jìn)行功能注釋。結(jié)果顯示（表6、圖3），通過(guò)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共注釋差異表達(dá)基因（DEGs）8904個(gè)。其中，注釋到Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)的有7031個(gè)，占比 78.96% ；注釋到GO數(shù)據(jù)庫(kù)的有6543個(gè)，占比 73.48% ；注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的有3455個(gè)，占比 38.80% ；注釋到COG數(shù)據(jù)庫(kù)的有2814個(gè)，占比 31.60% ；注釋到KOG數(shù)據(jù)庫(kù)的有4195個(gè)，占比47.11% ；注釋到Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)的有7223個(gè)，占比81.12% ；注釋到NR數(shù)據(jù)庫(kù)的有8895個(gè)，占比99.89% 。

Note：GC （%） .CleanData GC content;N （%） .N bases in Clean Data;Q20 （%） .Percentage ofbaseswith CleanData mass value greater than or equal to 20; .Percentage ofbaseswith CleanData massvalue greater than or equal to 30.

注：橫坐標(biāo)表示某一個(gè)基因在兩樣品中表達(dá)量差異倍數(shù)的對(duì)數(shù)值;縱坐標(biāo)表示FDR的負(fù)對(duì)數(shù)值。圖中綠色的點(diǎn)代表顯著下調(diào)的基因，紅色的點(diǎn)代表顯著上調(diào)的基因，黑色的點(diǎn)代表表達(dá)差異不顯著的基因。Down：上調(diào)的差異表達(dá)基因;Not：未比對(duì)上的基因;Up：下調(diào)的差異表達(dá)基因。

Note：Theorzotaloodinaterepresentsthlogvaleofteexpresiodifereofgneintetwomples;teodnateeptste negativelouofeotsinureepressiatlowegatdgedpentsiantlla genesndacisolt aligned; Up： downregulated diferentially expressed genes.

2.5差異表達(dá)基因的GO富集分析

差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞組分（cellularcomponent）、分子功能（molecularfunction）、生物學(xué)過(guò)程（biologicalprocess）這3個(gè)主要GO類別下。如圖3所示，淹水脅迫后甜瓜幼苗（M13-06-3）的差異表達(dá)基因富集到細(xì)胞組分（CC）類別下最多的是細(xì)胞（cell）和細(xì)胞部分（cellpart），分別富集了2846個(gè)和2842個(gè)DEGs；淹水脅迫后甜瓜幼苗（M13-06-3）的差異表達(dá)基因富集到分子功能（MF）類別下最多的是結(jié)合功能（binding）和催化活性（catalyticactivity），分別富集了1861個(gè)和1820個(gè)DEGs；淹水脅迫后甜瓜幼苗（M13-06-3）的差異表達(dá)基因富集到生物學(xué)過(guò)程（BP）類別下最多的是細(xì)胞過(guò)程（cellular process）和代謝過(guò)程（metabolic pro-cess），分別富集了2328個(gè)和2217個(gè)DEGs。

2.6差異表達(dá)基因KEGG通路注釋與分析

2.6.1 KEGG注釋和KEGG富集分析 進(jìn)一步了解甜瓜幼苗（M13-06-3）受淹水脅迫后的差異表達(dá)基因所參與的代謝途徑，將M13-06-3淹水脅迫后的DEGs同KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)有3455個(gè)DEGs在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中被注釋，得到KEEG功能注釋分類圖（圖4）。結(jié)果表明，M13-06-3中的3455個(gè)DEGs被分別注釋到細(xì)胞過(guò)程（cellularprocesses）、環(huán)境信息過(guò)程（environmental informationprocess-ing）、遺傳信息過(guò)程（geneticinformationprocess-ing）、人類疾?。╤umandiseases）、新陳代謝（metabo-lism）和生物體系統(tǒng)（organismalsystems）這6個(gè)KEGG一級(jí)代謝通路中。其中，6個(gè)KEGG一級(jí)代謝通路中又下分為19個(gè)二級(jí)通路，這19個(gè)二級(jí)通路中DEGs注釋最多的是一級(jí)代謝通路新陳代謝（Metabolism）下的二級(jí)通路碳水化合物代謝（carbo-hydratemetabolism），注釋了385個(gè)DEGs；其次是一級(jí)代謝通路遺傳信息過(guò)程（geneticinformationprocessing）下的二級(jí)通路翻譯（translation），注釋了284個(gè)DEGs。

進(jìn)一步與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析甜瓜幼苗淹水脅迫后可能參與的路徑，共有2903條差異表達(dá)基因富集到KEGGpathway中，共涉及了128個(gè)代謝通路。結(jié)果顯示（圖5），KEGGpathway中有176個(gè)DEGs在核糖體（ribosome）通路上富集，有83個(gè)DEGs在苯丙烷類生物合成（phenylpropanoidbiosynthesis）通路上富集，有77個(gè)DEGs在淀粉和蔗糖代謝（starchand sucrosemetabolism）通路上富集，有72個(gè)DEGs在糖酵解/糖異生（glycolysis/gluconeogenesis）通路上富集，有72個(gè)DEGs在MAPK植物信號(hào)（MAPKsignalingpathway-plant）通路上富集，有69個(gè)DEGs在氨基糖和核苷酸糖的代謝（amino sugar and nucleotide sugar metabolism）通路上富集。

2.6.2對(duì)淹水脅迫響應(yīng)的候選基因進(jìn)行篩選為進(jìn)一步篩選甜瓜幼苗淹水脅迫后響應(yīng)的相關(guān)基因，將通過(guò)篩選得到的差異表達(dá)基因（DEGs）與NR、COG、KOG、Swiss-Prot、Pfam、KEGG、GO等7個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)注釋。當(dāng)植物受到淹水脅迫時(shí)，體內(nèi)會(huì)啟動(dòng)一系列復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，以調(diào)控抗性相關(guān)基因的表達(dá)并發(fā)揮其功能，從而最大程度地適應(yīng)脅迫環(huán)境，其中轉(zhuǎn)錄因子作為轉(zhuǎn)錄起始的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器起著至關(guān)重要的作用。通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)和活性，植物能夠啟動(dòng)特定的生物化學(xué)途徑和基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，以增強(qiáng)對(duì)淹水脅迫的抵抗能力。結(jié)合前人研究成果，發(fā)現(xiàn)與淹水脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子有ERF、WRKY、MYB、NAC、bZIP2等[10-12]。再結(jié)合GO、KEEG、KOG等數(shù)據(jù)庫(kù)注釋的差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)以及FPKM數(shù)據(jù)，推測(cè)MELO3C003917、ME-LO3C020588、MELO3C008314、MELO3C025360、MELO3C021658這5個(gè)基因可能響應(yīng)甜瓜幼苗淹水脅迫。

淹水脅迫下，甜瓜幼苗2個(gè)處理組與光合作用相關(guān)的蛋白合成會(huì)減少，導(dǎo)致光合作用效率下降，甜瓜幼苗的生長(zhǎng)指標(biāo)如株高和生物量的增長(zhǎng)會(huì)受到抑制。但一些與抗逆相關(guān)的蛋白質(zhì)，如熱休克蛋白、病程相關(guān)蛋白等可能會(huì)增加，這些蛋白質(zhì)有助于保護(hù)細(xì)胞免受脅迫，這一點(diǎn)在表7中有所體現(xiàn)。本試驗(yàn)篩選出的5個(gè)基因有2個(gè)（MELO3C003917、MEL03C021658）都包含熱休克蛋白并參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工通路，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞中負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)折疊和修飾的重要細(xì)胞器，在應(yīng)對(duì)外界壓力和環(huán)境變化時(shí)，70kDa 熱休克蛋白會(huì)參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的折疊、修復(fù)和降解，從而幫助細(xì)胞應(yīng)對(duì)應(yīng)激情況，基因ME-LO3C003917、MELO3C021658描述中都包含了MreB/Mb1蛋白和翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、伴侶蛋白。MELO3C020588的基因結(jié)構(gòu)包含了一種小型熱休克蛋白— 熱休克蛋白。ME-LO3C008314的基因結(jié)構(gòu)中則包含脫落酸受體PYL4蛋白并參與了MAPK信號(hào)通路。結(jié)合基因功能描述，發(fā)現(xiàn) 熱休克蛋白、 熱休克蛋白、MreB/Mbl蛋白、脫落酸受體PYL4蛋白、乳?；入赘孰牧呀饷?、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工通路、MAPK信號(hào)通路、氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝通路、碳水化合物的運(yùn)輸和代謝通路在甜瓜對(duì)淹水脅迫的反應(yīng)中起著重要作用。

2.7qRT-PCR驗(yàn)證

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)是定量檢測(cè)基因表達(dá)的重要手段之一。為驗(yàn)證甜瓜幼苗M13-06-3在淹水脅迫下響應(yīng)的候選基因，挑選了5個(gè)候選基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證。通過(guò)對(duì)淹水脅迫下甜瓜幼苗M13-06-3根系樣品在qRT-PCR測(cè)試下的表達(dá)趨勢(shì)和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中的變化趨勢(shì)分析，發(fā)現(xiàn)5個(gè)差異表達(dá)基因在qRT-PCR和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中的變化趨勢(shì)基本一致，表明轉(zhuǎn)錄組分析的結(jié)果具有可靠性，也驗(yàn)證了2.6.2中推斷的可能響應(yīng)甜瓜幼苗M13-06-3淹水脅迫的基因。MELO3C003917、MELO3C020588、MELO3C008314、MELO3C025360、MELO3C021658這5個(gè)基因的表達(dá)量在2個(gè)處理中差異均極顯著（圖6），初步驗(yàn)證了這5個(gè)基因可能是甜瓜耐澇基因。

3 討論與結(jié)論

甜瓜是全球十大水果之一，富含各種維生素、可溶性糖、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)元素，受到了各地消費(fèi)者的喜愛(ài)，是中國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物。近幾年，有學(xué)者公開(kāi)發(fā)表了一些甜瓜品種在淹水脅迫下的生理生化影響[13-15]，發(fā)現(xiàn)澇害對(duì)甜瓜影響較大，且經(jīng)淹水脅迫后會(huì)導(dǎo)致一些植物進(jìn)化出了形態(tài)和結(jié)構(gòu)適應(yīng)機(jī)制，如芽伸長(zhǎng)、不定根發(fā)育及形成通氣組織，這些都有助于植物逃離缺氧環(huán)境或改善缺氧器官的氧氣供應(yīng)狀況。結(jié)合本試驗(yàn)研究數(shù)據(jù)，從形態(tài)上看，過(guò)量水分使甜瓜葉片出現(xiàn)萎蔫、發(fā)黃等現(xiàn)象，且經(jīng)淹水脅迫后甜瓜幼苗根系不定根叢生。在光合特性上，對(duì)照組NW與處理組TW的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率、細(xì)胞間隙 CO₂ 濃度差異顯著。結(jié)合前人研究，推測(cè)甜瓜幼苗受淹水脅迫后不定根的生長(zhǎng)促使蒸騰速率和細(xì)胞間隙 CO₂ 濃度升高?？梢?jiàn)淹水脅迫在一定程度上影響了甜瓜幼苗的光合特性，但不定根生長(zhǎng)等情況表明其對(duì)淹水脅迫具備一定適應(yīng)性，這為后續(xù)研究提供了依據(jù)和方向。

淹水脅迫是重要逆境脅迫之一，會(huì)引發(fā)一系列基因的表達(dá)變化，特別是與氧氣供應(yīng)、抗氧化反應(yīng)、離子平衡和逆境適應(yīng)等相關(guān)的基因。這些基因的表達(dá)變化會(huì)影響幼苗的生理和生化代謝過(guò)程，進(jìn)而影響其對(duì)淹水脅迫的適應(yīng)能力。RNA高通量測(cè)序技術(shù)（RNA-seq）可以在轉(zhuǎn)錄組水平解析基因的表達(dá)特征，目前已被廣泛應(yīng)用于功能基因組研究，但關(guān)于甜瓜耐澇性轉(zhuǎn)錄組方面的研究報(bào)道較少[5]。筆者對(duì)M13-06-3根部的3個(gè)對(duì)照組樣品（NW1、NW2、NW3）和3個(gè)處理組樣品（TW1、TW2、TW3）進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和生物信息學(xué)分析。將通過(guò)篩選得到的差異表達(dá)基因（DEGs）與Swiss-Prot、COG、GO、NR、KEGG、Pfam、KOG這7個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，各樣品的比對(duì)率為 96.01%～ 97.25% ，并篩選到差異表達(dá)基因9037個(gè)，其中4529個(gè)DEGs上調(diào)，4508個(gè)DEGs下調(diào)。同時(shí)，對(duì)這些差異基因進(jìn)行差異比較火山圖分析、差異基因聚類熱圖分析、相關(guān)性分析、GO富集分析、KOG注釋分析、KEGG代謝通路富集分析以及實(shí)時(shí)熒光定量驗(yàn)證。

受淹水脅迫后甜瓜幼苗（M13-06-3）的差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞組分、分子功能、生物學(xué)過(guò)程這3個(gè)主要GO類別下。通過(guò)KEEG代謝通路富集分析發(fā)現(xiàn)，差異基因主要參與核糖體、苯丙烷類生物合成、淀粉和蔗糖代謝、糖酵解/糖合成、MAPK植物信號(hào)、氨基糖和核苷酸糖等多種代謝通路。研究表明，淹水脅迫會(huì)誘導(dǎo)甜瓜體內(nèi)多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑及代謝過(guò)程發(fā)生改變，例如激活某些特定的轉(zhuǎn)錄因子或調(diào)節(jié)蛋白，從而促進(jìn)抗氧化酶活性增強(qiáng)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累等有利于提高植物耐受性的反應(yīng)。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序以及熒光定量檢測(cè)，結(jié)合GO、KOG、KEGG分析結(jié)果，對(duì)響應(yīng)淹水脅迫的候選基因進(jìn)行了分析，初步驗(yàn)證了MELO3C003917、MELO3C020588、MELO3C008314、MELO3C025360、MELO3C021658這5個(gè)基因響應(yīng)甜瓜幼苗淹水脅迫。從基因結(jié)構(gòu)層面來(lái)看，篩選出的這5個(gè)基因各自包含了與耐澇相關(guān)的關(guān)鍵蛋白或參與重要耐澇相關(guān)通路的基因，在甜瓜中這些基因所在的基因組區(qū)域可能是植物耐澇性狀的重要遺傳基礎(chǔ)，它們的表達(dá)調(diào)控以及相互作用共同決定了植物耐澇能力的強(qiáng)弱。MreB/Mb1蛋白調(diào)控耐澇基因表達(dá)，影響植物耐澇的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平[；熱休克蛋白從細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)維持角度保障細(xì)胞在水淹環(huán)境下能正常行使功能，為其他調(diào)控機(jī)制的有效運(yùn)行提供了細(xì)胞層面的基礎(chǔ)[；而脫落酸（ABA）受體PYL4蛋白所在的MAPK信號(hào)通路又與其他激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑相互溝通協(xié)作，對(duì)植物整體的耐澇生理反應(yīng)進(jìn)行精細(xì)調(diào)控[20-28]；同時(shí)，乳?；入赘孰牧呀饷赶嚓P(guān)的代謝通路參與到植物應(yīng)對(duì)脅迫的氧化還原平衡等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，與其他機(jī)制協(xié)同來(lái)減輕水淹造成的傷害，例如擬南芥中的AtGSTF2（Arabidopsis thaliana Glu-tathioneS-transferaseF2）[29]、水稻中的OsGSTU5（Oryza sativaGlutathioneS-transferaseU5）[30]、煙草中的 NtGSTF1 （Nicotiana tabacum GlutathioneS-transferase F1）[31、玉米中的 ZmGSTF2（Zea maysGlutathioneS-transferaseF2）[32]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，澇敏感型材料遭遇淹水脅迫后轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的變化更大[33]；Zhang等[34揭示了甜瓜耐澇過(guò)程中發(fā)揮重要作用的途徑和基因，其中對(duì)脫落酸、GO功能富集、代謝通路以及基因MELO3C008314的研究結(jié)果都與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

對(duì)篩選出的可能響應(yīng)耐澇的基因功能進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)脫落酸受體PYL4蛋白參與了MAPK信號(hào)通路且能與其他激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑相互溝通協(xié)作，共同調(diào)節(jié)基因表達(dá)、離子通道活性、滲透調(diào)節(jié)物積累和氣孔閉合等機(jī)制，對(duì)甜瓜的耐澇性產(chǎn)生重要影響；通過(guò)參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工通路， 18.5kDa 熱休克蛋白、 熱休克蛋白等熱休克蛋白可以增強(qiáng)植物對(duì)淹水脅迫的適應(yīng)能力，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和細(xì)胞功能，在甜瓜的耐澇適應(yīng)中發(fā)揮重要作用；乳?；入赘孰牧呀饷竿被岬霓D(zhuǎn)運(yùn)和代謝、碳水化合物的運(yùn)輸和代謝通路等相關(guān)基因在甜瓜的耐澇性中可能發(fā)揮重要作用，特別是通過(guò)調(diào)節(jié)與氧化還原平衡、植物抗氧化防御、解毒反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等相關(guān)的代謝途徑；MreB/Mbl蛋白與熱休克蛋白之間可能存在直接或間接的相互聯(lián)系。

MreB/Mbl蛋白、 18.5kDa 熱休克蛋白、 熱休克蛋白、脫落酸受體PYL4蛋白、乳?；入赘孰牧呀饷?、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工通路、MAPK信號(hào)通路、氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝通路、碳水化合物的運(yùn)輸和代謝通路在甜瓜對(duì)淹水脅迫的反應(yīng)中起著重要作用。通過(guò)對(duì)甜瓜幼苗（M13-06-3）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，將通過(guò)篩選得到的差異表達(dá)基因（DEGs）與Swiss-Prot、COG、GO、NR、KEGG、Pfam、KOG等7個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，并結(jié)合熒光定量表達(dá)檢測(cè)對(duì)響應(yīng)淹水脅迫的候選基因進(jìn)行了分析，結(jié)果標(biāo)明，MELO3C003917、ME-LO3C020588、MELO3C008314、MELO3C025360、MELO3C021658這5個(gè)基因定量檢測(cè)數(shù)據(jù)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的趨勢(shì)基本一致，表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量良好，并響應(yīng)了甜瓜幼苗淹水脅迫，初步推測(cè)這5個(gè)基因?yàn)樘鸸夏蜐诚嚓P(guān)基因。

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