醋栗番茄抗灰霉病的基因定位和抗性生理研究

中圖分類號：S641.2 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-2871（2025）06-026-09

Gene mapping and physiological study of resistance to Botrytis cinerea in gooseberry tomato

JIANG Jianing， XUE Dongqi， LOU Xueyuan， JIANG Liwei， GUO Xin （CollegeofHorticulture，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou45o46，Henan，Cina）

Abstract：Graymold，causedbyBotrytiscinerea，posesserious threats toboth tomatoproductionandpost-harvestpreservation. This study utilized gooseberry tomato（LA2076），cultivated tomato（LA1246），and their F₂ populations as experimental materials toanalyze thephenotypicand physiological differences between thesetwo typesof tomato varieties.By integrating the initial localization interval obtained through segregationpopulationgrouping analysis，22 InDelmarkers weredeveloped forfine mappingof tomatoresistance genesagainstgraymold.Theresults indicated thatat thesame time pointafterinvitro leaf inoculation with B .cinerea，the lesionareainLA2o76waslargerthanthatobserved inLA1246. TheMDAcontent exhibitedaninitialincreasefolowedbystabilization，withLA2O76displayingafasterrateofincrease thanLA1246.The activities of POD（peroxidase），CAT（catalase），and SOD（superoxide dismutase）allexhibited initial increasefollwedbydecrease，withLA2O76reaching higherpeak antioxidant enzymeactivitiesatearlier time points than LA1246. Genetic mapping revealed that the gene conferring resistance to gray mold was localized to a 4.29Mb interval flankedbyInDel-1.2andInDel-4.1onchromosome9，whichcontained38genes.Thisresearch providesatheoretical foundationfor guiding genetic breeding efforts aimedat enhancing tomato resistanceto graymold as wellas for furtherinvestigations into the genetic mappingand molecular mechanisms underlying this resistance.

Key Words： Tomato; Gray mold; Gene mapping; Resistance physiology

番茄是全球范圍內(nèi)大面積栽培的重要經(jīng)濟作物，果實具有較高的營養(yǎng)價值。但病害導(dǎo)致的番茄腐爛變質(zhì)是造成嚴(yán)重經(jīng)濟損失的主要原因。灰霉病作為一種危害極大的真菌病害，是番茄生產(chǎn)和采后的主要病害。番茄灰霉病是由灰葡萄孢菌（Botrytiscinerea）引起的病害，屬半知菌亞門葡萄孢屬真菌，危害蔬菜、果樹及花卉等多種植物，對保護地番茄危害尤為突出，作物從生長到開花、結(jié)果，均能感染，一般導(dǎo)致番茄減產(chǎn) 20%～30% ，嚴(yán)重的高達 50% ，甚至絕產(chǎn)[2]。目前主要防治方法是化學(xué)防治，常用殺菌劑主要包括苯并咪唑類、二甲酰亞胺類、N-苯基氨基甲酸酯類、苯胺基嘧啶類和保護性殺菌劑等3-4。但化學(xué)防治不僅污染環(huán)境，而且易使病菌產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致防效降低5。目前，灰霉病在我國范圍內(nèi)廣泛發(fā)生，并有逐年增加的趨勢，是制約我國番茄生產(chǎn)的重要因素。

對番茄灰霉病的抗病資源研究表明，對番茄灰霉病的抗病性屬于多基因控制的數(shù)量性狀，然而，番茄抗灰霉病資源匱乏，制約著抗性品種的選育[]。利用莖部接種法進行QTL定位后發(fā)現(xiàn)Rbe-ql、Rbcq2、Rbcq4a等3個QTL位點與灰霉病抗病性相關(guān)[]。Guimaraes等[]研究表明，番茄品種LA2951對番茄灰霉病有較高的抗性。徐明等從26份番茄材料中篩選出對灰霉病抗性較高的多毛番茄T2-07-316，其莖部離體接種6d后相對莖侵染率和相對莖腐擴展速率均為0；除此之外，還有7份轉(zhuǎn)基因番茄對灰霉病也表現(xiàn)出較高的抗性，相對莖侵染率 15.00%～38.33% ，相對莖腐擴展速率 10.22% ～23.57% ，其中，T2-07-337材料的抗性最高。結(jié)合分子育種方法可以有效聚合抗病基因，創(chuàng)新育種材料，但進展緩慢。且由于單個基因?qū)共⌒缘呢暙I并不突出，而且番茄灰霉病的抗病基因主要存在于野生番茄中，野生番茄存在經(jīng)濟性狀較差、與普通番茄雜交親和性低等問題，采用常規(guī)育種方法很難將多個抗性基因有效聚合到一個材料中，因此選育經(jīng)濟性狀優(yōu)良、抗灰霉病的優(yōu)秀自交系需要相當(dāng)長的育種周期。

本試驗于2024年1一10月在茄科課題組完成，利用分離群體分組分析法探究與番茄抗灰霉病這一性狀緊密連鎖的InDel分子標(biāo)記，利用篩選出的InDe1分子標(biāo)記實現(xiàn)對番茄抗灰霉病基因的精細定位，為進一步研究番茄抗灰霉病的分子機制和抗病育種提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

醋栗番茄（Solanumpimpinelifoulium）LA1246、栽培番茄（Solanum lycopersicum）LA2076和灰霉菌標(biāo)準(zhǔn)菌株B05.10由茄科課題組保存，其中LA1246材料為較耐灰霉病材料，LA2076材料為感灰霉病材料，LA1246和LA2076反交產(chǎn)生 F₁，F(xiàn)₁ 自交產(chǎn)生 F₂ 群體。在 28^°C/18^°C （晝/夜） 75% 相對濕度、 16h 光照 /8h 黑夜光周期的溫室中培養(yǎng)。

1.2 灰霉菌的離體葉片接種

在托盤里鋪平2層濾紙、浸濕，選取定植后5＼～6葉齡植株中部葉片，擺放時正面朝上，背面朝下。接種孢子時，將孢子懸浮液搖勻，使用血球計數(shù)板統(tǒng)計孢子濃度，使用PDB液體培養(yǎng)基進行稀釋以制備濃度為 1×10⁶ 個 ?mL^-1 的灰霉菌孢子懸浮液，用于植株的接種試驗，每片葉子接種4個病斑，各點3μL 懸浮液，接種后放置在 16h 光照 /8h 黑夜光周期、恒溫 23^°C，100% 濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 灰霉病發(fā)病程度的分級

在定植后5周，選擇第5＼～第6片葉完全展開、生長狀態(tài)良好、大小均勻一致且無明顯病蟲害的葉片進行接種。使用游標(biāo)卡尺測量病斑直徑并計算病斑面積，每個數(shù)據(jù)的測量設(shè)置3次重復(fù)。以病斑面積占葉面積的百分比作為分級的主要依據(jù)，對番茄葉片離體接種灰霉菌后的發(fā)病情況進行了分級，該分級標(biāo)準(zhǔn)參考了楊改娣的方法并結(jié)合本試驗進行了適量修改，番茄葉片離體接種灰霉菌的發(fā)病分級標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.4酶活性及葉綠素?zé)晒獾壬碇笜?biāo)的測定

采用光合儀（Li6400）對接種灰霉菌不同時間后的番茄葉片葉綠素?zé)晒獬上袂闆r進行觀察。采用劉晗[13]的方法測定丙二醛（MDA）含量；采用NBT光化還原法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性[4；采用愈傷木酚氧化法測定過氧化物酶（POD）活性[15]；采用陳建勛等的方法測定過氧化氫酶（CAT）活性，以上4項生理指標(biāo)的測定各設(shè)置四種不同的處理：LA1246和LA2076分別接種于灰霉菌孢子懸浮液和PDB液體培養(yǎng)基中，各個生理指標(biāo)的測定均設(shè)置3次重復(fù)。

1.5番茄抗灰霉病基因的精細定位及遺傳連鎖圖 譜的構(gòu)建

基于本課題組前期研究，并且結(jié)合群體分離分析法獲得了初定位區(qū)間，該區(qū)間位于9號染色體上。在初定位區(qū)間內(nèi)繼續(xù)設(shè)計22對InDel分子標(biāo)記（表2）進行精細定位。將每1對標(biāo)記與 F₂ 群體所有的單株，通過聚丙烯凝膠電泳試驗判讀條帶，與親本LA2076條帶相同的判讀為“a”，與親本LA1246條帶相同的判讀為“b”，LA2076和LA1246條帶兼有的雜帶判讀為“h”，缺失條帶判讀為“-”。同時結(jié)合病情分級結(jié)果與親本表型結(jié)果，將 F₂ 群體內(nèi)病情等級為 ⁶⁶0⁹ 和“1”的單株統(tǒng)計為與親本LA1246相同的“b”，將 F₂ 群體內(nèi)病情等級為“4\"和“5\"的單株統(tǒng)計為與親本LA2076相同的\"a，\"將 F₂ 群體內(nèi)病情等級為“2\"和“3\"的單株統(tǒng)計為與雜帶相同的“h”，以此來對 F₂ 群體內(nèi)不同病級的單株與抗病性有差異的親本間形成對應(yīng)。

使用Joinmap4.0和IciMapping4.2軟件對所有表現(xiàn)出穩(wěn)定多態(tài)性的InDel分子標(biāo)記進行遺傳連鎖分析并繪制遺傳連鎖圖譜，將遺傳連鎖分析結(jié)果結(jié)合表型數(shù)據(jù)，計算各個標(biāo)記以及兩標(biāo)記間的加性效應(yīng)值并繪制加性效應(yīng)變化圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 LA1246和LA2076離體葉片的發(fā)病情況

LA1246和LA2076葉片離體接種灰霉菌后統(tǒng)計發(fā)病面積如圖1所示，接灰霉菌后相同時間內(nèi)LA2076病斑面積要明顯大于LA1246，LA2076病程相較于LA1246快12＼～24hpi（hourspost infec-tion），這表明LA1246相較于LA2076對灰霉病耐受性更強，發(fā)病病程減緩；而在接灰霉菌 120hpi 后，LA1246和LA2076的發(fā)病面積都不再增加。

2.2LA1246和LA2076離體接灰霉菌后葉綠素?zé)晒獬上袂闆r分析

由圖2可知，離體接灰霉菌后2個材料上病斑面積均不斷擴大，而在相同時間點上，LA2076病斑面積要大于LA1246；在 24hpi 時，LA2076已經(jīng)出現(xiàn)病斑，而此時LA1246幾乎沒有出現(xiàn)病斑；在 時，LA2076已經(jīng)出現(xiàn)了較為明顯的病斑，此時LA1246剛剛出現(xiàn)病斑；在 時，LA2076病斑已經(jīng)非常明顯，幾乎占葉面積一半，此時LA1246病斑剛剛擴大，病斑面積與LA2076在 24hpi 時的病斑面積幾乎持平；在96hpi時，LA2076已經(jīng)幾乎完全壞死，此時LA1246病斑面積與LA2076在48hpi時的病斑面積幾乎持平，這表明LA1246相較于LA2076對灰霉病耐受性更強，發(fā)病病程減緩。

2.3LA1246和LA2076接種灰霉菌后抗氧化物酶活性及MDA含量

2.3.1 LA1246和LA2076的MDA含量 LA1246和LA2076接種灰霉菌處理相較于不接種灰霉菌處理，MDA含量都呈現(xiàn)先增加后持平的趨勢，且LA2076的MDA含量增加速度比LA1246快，這表明隨著灰霉病菌的侵染，葉片內(nèi)MDA含量迅速累積，葉片受脅迫程度逐漸嚴(yán)重，在 120hpi 后，葉片侵染完全，MDA含量不再增加，此時葉片受脅迫程度也不再增加，保持較高位水準(zhǔn)，而未接種灰霉菌處理的LA1246和LA2076的MDA含量無明顯變化（圖3）。

2.3.2 LA1246和LA2076的POD活性 LA1246和LA2076接種灰霉菌處理相較于不接種灰霉菌處理，POD活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，其中LA2076的POD 活性峰值更高且出現(xiàn)的時間更快，該峰值在 60hpi 時出現(xiàn)；LA1246的POD活性峰值較低且出現(xiàn)的時間較慢，該峰值在 72hpi 時出現(xiàn)，最終LA1246和LA2076在接種灰霉菌 144hpi 后POD活性降低到未接種灰霉菌的水平，而未接種灰霉菌處理的LA1246和LA2076的POD活性無明顯變化（圖4）。

2.3.3 LA1246和LA2076的CAT活性 LA1246和

LA2076接種灰霉菌處理相較于不接種灰霉菌處理，CAT活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，其中LA2076的CAT活性峰值更高且出現(xiàn)的時間更快，該峰值在""時出現(xiàn)；LA1246的CAT活性峰值較低且出現(xiàn)的時間較慢，該峰值在 72hpi 時出現(xiàn)，最終LA1246和LA2076在接種灰霉菌 144hpi 后CAT活性降低到未接種灰霉菌的水平，而未接種灰霉菌處理的LA1246和LA2076的CAT活性無明顯變化（圖5）。

2.3.4 LA1246和LA2076的SOD活性 LA1246和LA2076接種灰霉菌處理相較于不接種灰霉菌處理，SOD活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，其中LA2076的SOD活性峰值更高且出現(xiàn)的時間更快，該峰值在 時出現(xiàn)；LA1246的SOD活性峰值較低且出現(xiàn)的時間較慢，該峰值在60hpi時出現(xiàn)，最終LA1246和LA2076在接種灰霉菌144hpi后SOD活性降低到未接種灰霉菌的水平，而未接種灰霉菌處理的LA1246和LA2076的SOD活性無明顯變化（圖6。

2.4番茄抗灰霉病基因的精細定位

對F臨時分離群體采用與親本相同的栽培管理技術(shù)與接病方法，依照前文擬定好的番茄葉片離體接種灰霉菌的發(fā)病分級標(biāo)準(zhǔn)對 F₂ 臨時分離群體進行病情分級，共得到432個 F₂ 單株，其病情等級匯總情況見表3，各個病情等級示例見圖7。

使用InDel分子標(biāo)記檢測雙親本材料以及每一個 F₂ 單株，統(tǒng)計 F₂ 群體單株P(guān)CR擴增和電泳檢測結(jié)果，按照前文所列方法進行分析，共發(fā)現(xiàn)了5對InDe1分子標(biāo)記與表型緊密連鎖，其中InDel-1.2和InDel-4.1之間的加性效應(yīng)值最高，且明顯高于其他標(biāo)記之間，說明這2個標(biāo)記與表型關(guān)聯(lián)程度最高，因此將目的基因定位在InDel-1.2和InDel-4.1之間的區(qū)間，通過比對番茄參考基因組可知，該區(qū)間長度為 4.29Mb ，內(nèi)有38個基因（圖8）。

3 討論與結(jié)論

植物體在面對病原菌入侵的過程中，最早發(fā)生的反應(yīng)之一是氧化物的產(chǎn)生，而活性氧的積累可以作為防御反應(yīng)的信號，導(dǎo)致抗性相關(guān)基因的上調(diào)或與其他信號分子相互作用參與植物的抗病過程。Patykoowski等[發(fā)現(xiàn)，在灰霉病病菌侵染番茄葉片后，過氧化氫的含量明顯增加，且在較為感病的番茄材料中過氧化氫含量變化更早，增加速度更快，推測可能是非原生質(zhì)體NADH過氧化氫酶和SOD產(chǎn)生的過氧化氫及超氧化氫早期刺激所導(dǎo)致。在植物體內(nèi)天然擁有活性氧清除機制，在植物體中存在能夠分解活性氧的酶以及多種生物抗氧化劑，這些酶以及抗氧化劑共同組成了一個抵御活性氧的動態(tài)防御體系[18]，植物體內(nèi)能分解活性氧的酶主要有超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）等[9]，這些抗氧化酶在參與植物抵御活性氧侵染的生物過程中發(fā)揮著重要作用。

在番茄灰霉病的防治措施中，選用抗病品種是最經(jīng)濟有效的方法。但是，由于抗原缺乏，限制了抗病品種的選育。番茄灰霉病抗源材料很缺乏，主要存在于野生番茄中。國內(nèi)外在篩選抗番茄灰霉病的種質(zhì)資源方面已做了較多且較長時間的研究，但一直未篩選到理想的抗源材料，抗病育種進展緩慢。利用InDel、SSR、SNP等分子標(biāo)記參與篩選抗病基因，為選育抗性材料提供了材料基礎(chǔ)。Finkers等[20利用3個野生型材料進行了QTL檢測，鑒定出3個與抗灰霉病相關(guān)的QTL位點。Bali等研究表明，秘魯番茄LA2745、多毛番茄LA2314及醋栗番茄LA1246在葉部和莖部均表現(xiàn)出較高的抗性。Nicot等[22通過葉部和莖部接種證明，一些野生資源尤其是多毛番茄對灰霉病表現(xiàn)部分抗性。李君明[23]對多毛番茄LA1777進行了QTL定位，鑒定出3個與抗灰霉病相關(guān)的QTL位點，其在9號染色體上定位到的QTL位點與本試驗所定位到的區(qū)間在物理位置上有部分重合之處，這部分重合的區(qū)間可以作為后續(xù)研究的關(guān)鍵方向。在本試驗中，使用InDel分子標(biāo)記所進行的基因定位結(jié)果已經(jīng)比較完善，下一步可以結(jié)合SSR、dCAPS等其他標(biāo)記進行定位，以使結(jié)果更加細化，以希望獲得更加精細的定位區(qū)間。本試驗結(jié)果實現(xiàn)了對番茄抗灰霉病基因更精細化的基因定位，為進一步研究番茄抗灰霉病的分子機制并應(yīng)用于番茄抗病育種提供了科學(xué)依據(jù)。

筆者利用LA1246和LA2076及其 F₂ 群體，研究番茄抗灰霉病的遺傳規(guī)律，并利用群體分離分析法（BSA）探索與番茄抗灰霉病性狀緊密連鎖的In-Del分子標(biāo)記。本試驗結(jié)果表明，LA1246相較于LA2076對灰霉病表現(xiàn)出抗病性；BSA分析結(jié)果顯示相關(guān)抗病基因初定位在9號染色體上；共篩選出5個與表型緊密連鎖的InDel分子標(biāo)記，最終在標(biāo)記InDel，1.2和InDel，4.1之間定位到長度為4.29Mb 的區(qū)間，該區(qū)間內(nèi)有38個基因。

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