籽用美洲南瓜CpMLO基因家族鑒定及響應(yīng)白粉病脅迫的功能初探

MLO基因家族是植物特異性基因家族，根據(jù)物種的不同，其成員數(shù)量為 7～39 個(gè)[]。其蛋白的特征是存在7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域[2]，而另一個(gè)特征是在C端區(qū)域存在鈣調(diào)素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域可能與感知鈣信號(hào)和介導(dǎo)各種信號(hào)級(jí)聯(lián)有關(guān)[3]。MLO蛋白序列也具有幾種高度保守的氨基酸，其中一些氨基酸被認(rèn)為對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能和穩(wěn)定性至關(guān)重要[4-6]。MLO蛋白通常被分為7個(gè)明確的分支（ I～I(xiàn)I ），其中分支V和V分別在單子葉和雙子葉的MLO蛋白中與白粉?。≒owderymildew，PM）易感性相關(guān)[1，7]。在許多物種中，如大麥、番茄和蘋果，來(lái)自這兩個(gè)分支的MLO基因（分別在單子葉和雙子葉中為N和V）在PM感染時(shí)上調(diào)[8-10]。也有研究表明，這些基因的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致對(duì)病原體的易感性增強(qiáng)[9]。此外，許多物種通過(guò)基因沉默或基因編輯使這些基因失去功能，導(dǎo)致對(duì)PM的抗性增加或完全免疫[11-14]

白粉病又稱“白毛病”，是籽用美洲南瓜生產(chǎn)中的重要病害之一，影響籽用美洲南瓜的正常生長(zhǎng)，發(fā)病后期使葉片無(wú)法正常進(jìn)行光合作用以提供營(yíng)養(yǎng)，導(dǎo)致收獲時(shí)籽粒不飽滿、果實(shí)產(chǎn)量及品質(zhì)下降，嚴(yán)重影響到籽用美洲南瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前，對(duì)甜瓜、黃瓜白粉病相關(guān)基因MLO的研究報(bào)道較多，但在南瓜屬植物上研究較少。隨著南瓜屬基因組的公布，為全面分析籽用美洲南瓜中的MLO基因家族提供了機(jī)會(huì)。本試驗(yàn)以南瓜屬公布的基因組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，對(duì)籽用美洲南瓜MLO基因家族成員進(jìn)行鑒定，并對(duì)篩選出的MLO基因進(jìn)行白粉病脅迫下表達(dá)模式分析。從中選擇表達(dá)最顯著的MLO15過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化煙草進(jìn)行功能驗(yàn)證，對(duì)其響應(yīng)白粉病功能進(jìn)行初步鑒定。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)材料為籽用美洲南瓜（CucurbitapepoL.）感病品系（M3）、煙草K326，來(lái)源于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)王萍教授課題組。煙草白粉病菌由河南科技學(xué)院郭衛(wèi)麗老師提供。籽用美洲南瓜和煙草幼苗在人工氣候室中培養(yǎng)，溫度保持在 ，光周期為 18h/6h （白天和黑夜）。籽用美洲南瓜幼苗長(zhǎng)至2葉1心時(shí)接種白粉病菌，煙草長(zhǎng)至6葉1心時(shí)接種白粉病菌，在 6h，12h，24h 后采集葉片。以未接種白粉病菌的葉片作為對(duì)照（CK）。所有樣品立即在液氮中冷凍，并保存在-80^°C ，備用，所有樣品均3個(gè)重復(fù)。

1.2方法

1.2.1籽用美洲南瓜MLO基因家族鑒定從擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//arabidopsis.org）中獲取15條擬南芥MLO成員為模板，對(duì)籽用美洲南瓜基因組進(jìn)行本地BLASTp比對(duì)，設(shè)置E-value為（204號(hào) 1×10^-20 。利用在線程序PFAM（http：//pfam.xfam.org/search） 和 CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）對(duì)候選MLO 基因驗(yàn)證保守結(jié)構(gòu)域[15]。使用在線Ex-Pasy程序（http：//www.expasy.org/tools/）預(yù)測(cè)MLO成員的生物物理性質(zhì)，如長(zhǎng)度、分子質(zhì)量（MW）、等電點(diǎn)（pI）[16]。

1.2.2多序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析為了研究C_PMLO 家族的進(jìn)化關(guān)系和分類，首先使用ClustalW工具對(duì)所有 C_PMLO 及擬南芥、水稻等雙子葉和單子葉植物MLO的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)。根據(jù)比對(duì)結(jié)果，利用MEGAX軟件使用最大似然法（ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[17]

1.2.3基因結(jié)構(gòu)分析和保守基序檢測(cè)使用在線程序 GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/），通過(guò)比較內(nèi)含子一外顯子與其對(duì)應(yīng)的基因組序列，繪制內(nèi)含子一外顯子結(jié)構(gòu)示意圖。CpMLOs的保守基序通過(guò)在線工具M(jìn)EME（http：//meme.ebi.edu.au/）檢測(cè)。參數(shù)設(shè)置如下：每個(gè)序列出現(xiàn)0次或1次；最大motifs數(shù)量為10個(gè)；其他可選參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值[18]

1.2.4染色體定位、基因重復(fù)和共線性分析為了進(jìn)一步研究CpMLO的進(jìn)化，首先繪制籽用美洲南瓜中MLO成員的分布圖。從GFF3注釋文件中檢索所有MLO基因在染色體上的位置，并使用 TBTOOLS可視化染色體位置[19]。為了鑒定CpMLO家族的串聯(lián)重復(fù)和片段重復(fù)，所有CpMLO 氨基酸序列用BLASTp比對(duì)，e值為 1× 10^-10 。位于同一染色體上的兩個(gè)或多個(gè)基因以200kb 的距離排列，并且BLASTp分析的同源性超過(guò) 70% ，可以定義為串聯(lián)復(fù)制事件[15]。使用

MCScanX程序識(shí)別片段重復(fù)事件，參數(shù)默認(rèn)[20]。

利用Circos程序繪制共線性圖。

1.2.5 RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR） 使用試劑盒（RNAsimpleTotalRNAKit，北京天根生化科技有限公司，北京）提取籽用美洲南瓜葉片總RNA。使用TransScriptOne-Step gDNA Removal and cDNA synthesis Super-Mix（北京全式金生物技術(shù)有限公司，北京）反轉(zhuǎn)錄cDNA。采用TBGreenPremixExTaq II（TaKaRa北京寶生物公司，北京）在FTC-3000P（FunglynBiotech，加拿大）上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR（RT-qPCR），反應(yīng)體系及反應(yīng)程序參照說(shuō)明書，所有處理均采用3個(gè)重復(fù)。引物如表1所示。用2^-ΔΔcT 法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量[21]。內(nèi)參基因?yàn)?CAC基因[22]

1.2.6籽用美洲南瓜CpMLO15功能的初步驗(yàn)證在前期研究基礎(chǔ)上，采用無(wú)縫克隆的方式進(jìn)行過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建，并轉(zhuǎn)化煙草，將CpMLO15基因過(guò)表達(dá)植株移栽到穴盤中，待植株長(zhǎng)到六葉一心時(shí)噴白粉病病菌，觀察白粉病發(fā)病情況并取樣。在接種后 0.6，12，24，48h ，取其同一葉位葉片測(cè)定其生理指標(biāo)，CAT、SOD、POD活性以及MDA含量的測(cè)定均參照李合生[23]的方法。在白粉病脅迫第3天后，測(cè)過(guò)表達(dá)植株及野生型植株抗病基因（NPR1、PDF1.2、PAL、PR5、PR1a）的相對(duì)表達(dá)量（以NtEF1-a為內(nèi)參基因）。

1.2.7 亞細(xì)胞定位 參考賀傲兵[24]亞細(xì)胞定位的方法。

1.2.8數(shù)據(jù)處理與分析利用Excel2019進(jìn)行圖表繪制，SPSS18.0進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1CpMLOs鑒定及理化性質(zhì)分析

經(jīng)過(guò)人工篩選，并對(duì)搜索結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，在南瓜基因組內(nèi)共鑒定出18個(gè)MLO基因，根據(jù)其在染色體上的物理位置，將其命名為 CpMLOI～ CpMLO18 。各基因的特征，包括基因數(shù)量、序列長(zhǎng)度、蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量和pI如表2所示。隨后對(duì)這18個(gè)CpMLO的序列分析表明， CpMLO 蛋白序列氨基酸數(shù)量從 412（CpMLO15）～614 （CpMLO18）不等，大多數(shù)MLO蛋白至少含有500個(gè)氨基酸。這些蛋白的分子質(zhì)量和等電點(diǎn)分別在 48.68ku（CpMLO15）～70. 09ku（CpMLO18） 和6.44（CpMLO18） ～9 .64（CpMLO8）。該基因家族含有 4～10 個(gè)不等的跨膜區(qū)。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示CpMLO均定位到細(xì)胞膜中。

2.2CpMLOs系統(tǒng)發(fā)育、保守基序及基因結(jié)構(gòu)分析

為了研究籽用美洲南瓜MLO家族的進(jìn)化關(guān)系和分類，利用18個(gè)CpMLO蛋白和已知的擬南芥Arabidopsisthaliana（15）、蘋果Malusdom-estica（1）、桃Prunuspersica（1）、水稻Oryza sa-tiva（1）、大麥Hordeumvulgare（1）和小麥Triticumaestiuum（3）MLO蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。根據(jù)前人研究將這些蛋白質(zhì)分為7個(gè)分支（ I～ VI），其中I、Ⅲ和V組數(shù)量最多有4個(gè) CpMLO 蛋白，Ⅱ組有3個(gè)蛋白，Ⅲ組有6個(gè)蛋白，V組有2個(gè)蛋白質(zhì)，VI組有1個(gè)蛋白（圖1）。

采用在線MEME軟件對(duì)18個(gè) C_PMLO 基因的氨基酸序列進(jìn)行分析，獲得10個(gè)保守基序（圖2-A）。結(jié)果表明，大部分基因均存在8個(gè)以上的保守基序，而在不同的進(jìn)化中的一些基因失去了保守的基序；其中，CpMLO2、CpMLO3、CpMLO8 和 CpMLO15 缺乏Motif7，CpMLO10基因和CpMLO14缺乏Motifl。此外，只有5個(gè)CpMLO（CpMLO6、CpMLO7、CpMLO9、CpM-

LO12、CpMLO17）基因含有所有的基序。結(jié)果表明，這些保守基序相對(duì)保守，并且其具有相似的位置分布。

基因結(jié)構(gòu)分析表明，MLO基因家族結(jié)構(gòu)復(fù)雜（圖2-B），并且每個(gè)基因中都存在12個(gè)以上的內(nèi)含子。發(fā)現(xiàn)CpMLO5和CpMLO10兩端沒(méi)有UTR區(qū)域，3個(gè)基因（CpMLO2、CpMLO3和C_PMLOI8 ）在一端缺乏UTR區(qū)域?；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明，同一分支中的基因具有相似的內(nèi)含子和外顯子分布模式（圖2-C）。

2.3 CpMLOs 基因的染色體定位及共線性分析

18個(gè)MLO基因被定位到各個(gè)染色體上（圖3），其中除了染色體Chr3、 Chr4 、 Chr7 、Chr15和Chrl8外，其他染色體均分布 1～2 個(gè) C_PMLO 基因；而在3條染色體Chr1、 Chr10 和 Chrl6上各發(fā)現(xiàn)2個(gè)MLO基因并未發(fā)現(xiàn)串聯(lián)重復(fù)。共有5對(duì) C_PMLO 基因（CpMLO3和CpMLO18、CpM-LO2和 CpMLO7，CpMLO4 和CpMLO15、CpM-LO11和 CpMLO16，CpMLO9 和 CpMLOI7. 參與片段重復(fù)（圖4）。為了探究籽用美洲南瓜與不同物種（擬南芥、水稻、黃瓜和甜瓜）MLO基因的進(jìn)化關(guān)系，對(duì)5種物種進(jìn)行共線性分析（圖5），在5個(gè)物種中發(fā)現(xiàn)了50對(duì)同源基因?qū)Γ婕?7個(gè)基因。其中黃瓜、甜瓜與籽用美洲南瓜MLO基因共線性最多，而與水稻中僅存在1對(duì)。

2.4 CpMLOs 基因順式作用元件分析

為了了解籽用美洲南瓜MLO基因家族啟動(dòng)子區(qū)域的順式元件，選取基因上游 2kb 序列進(jìn)行分析。結(jié)果如圖6所示， C_PMLO 基因家族的順式元件可分為兩類：一類與生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)，包括WRKY轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件（W-box）和4個(gè)光響應(yīng)元件（Spl、G-box、Box4和GT1-motif）；另一類與脅迫反應(yīng)有關(guān)，包括脫落酸響應(yīng)元件（ABRE）、茉莉酸響應(yīng)元件（CGTCA-motif和TGACG-mo-tif）、干旱脅迫響應(yīng)元件（MBS）、防御和脅迫響應(yīng)元件（TC-richrepeats）、低溫脅迫響應(yīng)元件（LTR）、厭氧元件（ARE）和與生物脅迫相關(guān)的元件（MYB和MYC）。所有的 C_PMLO 基因啟動(dòng)子都含有光響應(yīng)元件和生物脅迫相關(guān)元件；有12個(gè)C_PMLO 基因含有茉莉酸響應(yīng)元件；13 個(gè) C?M- LO基因含有脫落酸響應(yīng)元件；8個(gè) C_PMLO 基因含有干旱脅迫響應(yīng)元件；11個(gè) C_PMLO 基因含有低溫響應(yīng)元件。

2.5 CpMLOs 基因表達(dá)模式分析

為了了解MLO第V家族中 C_PMLO 在籽用美洲南瓜白粉病脅迫下的表達(dá)模式，對(duì)其進(jìn)行qPCR分析。

如圖7所示，與對(duì)照相比，白粉病脅迫下CpMLO2 、CpMLO4、CpMLO7和 CpMLOI54 個(gè)基因在 ^12h 和 24h 時(shí)都上調(diào)表達(dá)，尤其以CpMLO15在 ^12h 時(shí)表達(dá)量就達(dá)到極顯著差異1 （Plt;0. 01） 。因此，本試驗(yàn)選擇 CpMLOI5 基因進(jìn)行后續(xù)功能驗(yàn)證。

2.6T0代轉(zhuǎn)基因煙草株系感病性表現(xiàn)及生理生化指標(biāo)分析

在前期的研究基礎(chǔ)上，通過(guò)無(wú)縫克隆構(gòu)建了煙草轉(zhuǎn)基因載體，通過(guò)過(guò)表達(dá)MLO15轉(zhuǎn)基因煙草株系，研究對(duì)白粉病的敏感性，分別對(duì)野生型煙草和過(guò)表達(dá)煙草進(jìn)行白粉病菌處理，觀察接菌后的煙草表型。由圖8可知，在接種白粉病菌7d后，野生型煙草只有一片葉出現(xiàn)少量的白斑，而轉(zhuǎn)基因煙草幾乎所有葉片都出現(xiàn)白斑且有一兩片葉有大面積白斑。

2.7 亞細(xì)胞定位

為驗(yàn)證CpMLO15的亞細(xì)胞定位，以空載為對(duì)照，將含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草后進(jìn)行

熒光觀察，結(jié)果見(jiàn)圖9。對(duì)照的信號(hào)散布于細(xì)胞的不同區(qū)域，而試驗(yàn)組的熒光信號(hào)僅限于細(xì)胞膜，這與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

2.8抗氧化酶活性及丙二醛含量

由圖10可知，處理 ^0h 時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系OE植株葉片的超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫（CAT）活性均低于野生型煙草，其間差異不顯著；隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，野生型煙草葉片和轉(zhuǎn)基因煙草葉片SOD、POD活性均呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，在 ^12h 出現(xiàn)顯著差異（ Plt; 0.05），轉(zhuǎn)基因植株株系中CAT活性相比于野生型植株株系在 24h 達(dá)到顯著差異；轉(zhuǎn)基因株系中丙二醛（MDA）含量較野生型株系中的含量高，在⁶h 和 12h 達(dá)到顯著，在 ⁶h 轉(zhuǎn)基因煙草是野生型煙草的2倍。以上結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)CpM-LO15增加了煙草對(duì)白粉病的易感性。

2.9T0代轉(zhuǎn)基因煙草株系抗病相關(guān)基因表達(dá)量分析

在接種白粉病菌處理后，轉(zhuǎn)基因株系中激素通路的關(guān)鍵基因（NPR1）、防御酶類相關(guān)基因（ PAL ）的相對(duì)表達(dá)量相對(duì)于野生型煙草都有不同程度的降低，且均達(dá)到極顯著差異（ Plt;0.01） 。與野生型相比，轉(zhuǎn)基因野草PAL下調(diào)表達(dá)了7.3倍，PR5下調(diào)表達(dá)1.9倍， PRla 下調(diào)表達(dá)3倍（圖11）。

3討論

MLO被認(rèn)為是一個(gè)高度保守的基因家族，廣泛存在于各種植物中。其中一些MLO基因已被廣泛認(rèn)為在植物病害中起關(guān)鍵作用，特別是在白粉病菌脅迫中[25]。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MLO基因參與各種發(fā)育、生物和非生物脅迫的響應(yīng)[26]。然而，不同物種間基因的生物學(xué)功能特征存在差異。到目前為止，甜瓜[27]、黃瓜[28]、南瓜[29]等植物對(duì)MLO基因家族進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定和分析。隨著美洲南瓜基因組的發(fā)布，本研究系統(tǒng)地分析了籽用美洲南瓜中的MLO基因家族及在白粉病菌脅迫下的表達(dá)變化。本研究結(jié)果為更深人的研究C_PMLO 基因功能提供了理論依據(jù)。

本研究構(gòu)建了籽用美洲南瓜與其他6個(gè)物種間的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，參考前人對(duì)其的分類命名[1]，共確定了7個(gè)不同的分支，其中 C_PMLO 基因均勻地分布于其中6個(gè)分支中，而第V分支均為單子葉植物。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明，在第V分支中，4個(gè)CpMLO基因 ∵CpMLO2 、CpMLO4、CpMLO7、CpML015）與 AtMLOQ?AtMLO6 和AtMLO12聚類在一起，而研究表明，擬南芥中這些基因與白粉病菌敏感性相關(guān)[30]，表明與之聚類的 C_PMLO 基因可能含有同樣的功能。有研究motif1和motif2存在于具有白粉病菌敏感性的第V分支中[9，31]，但在其他分支也發(fā)現(xiàn)了相同的保守基序。保守基序分析發(fā)現(xiàn)，10個(gè)motif并不存在于所有CpMLO中，與前人研究相似[32-3]

基因組復(fù)制事件在基因組大小和基因功能多樣化方面起著重要作用，因?yàn)閺?fù)制事件可以產(chǎn)生具有新功能的基因[34]。在高等植物中，串聯(lián)重復(fù)事件和片段復(fù)制事件是導(dǎo)致基因家族擴(kuò)增的主要過(guò)程[35]。在本研究中，18個(gè)CpMLO 家族成員中，共有10個(gè)成員參與片段復(fù)制，并未發(fā)現(xiàn)串聯(lián)重復(fù)，表明該家族的擴(kuò)增是由于基因的片段復(fù)制?；虻钠螐?fù)制可以產(chǎn)生其功能冗余，可能具有不同的表達(dá)模式[15]。本研究中，第V分支的C_PMLO 基因存在片段復(fù)制事件，其在白粉病菌的脅迫下均上調(diào)表達(dá)，但表達(dá)趨勢(shì)并不相同。同源基因通常被認(rèn)為在不同的生物體中保留相同的功能[36]。在黃瓜[37-38]、甜瓜[39]和擬南芥[40]中發(fā)現(xiàn)大量與籽用美洲南瓜MLO同源的基因，表明其可能存在相同功能。

有研究表明，mlo突變體植株可以抑制病原菌吸器的形成或調(diào)節(jié)乳突反應(yīng)增加細(xì)胞壁厚度[41]，從而抵抗病原菌的侵染。此外，MLO基因家族第V分支是雙子葉植物特有的分支，被證明與白粉病菌相關(guān)[42]。在本研究中， CpMLO2 、CpMLO4 和 CpML15 的表達(dá)量在白粉病菌侵染感病品系時(shí)顯著提高。在中國(guó)南瓜中也有類似的結(jié)果[43]，推測(cè)不同品系的基因型對(duì)白粉病菌的敏感程度不同。

MLO基因在其他作物上對(duì)白粉病的敏感性也有相關(guān)報(bào)道，如甜瓜 CmMLO2 在受到白粉病菌脅迫時(shí)表達(dá)顯著上調(diào)，構(gòu)建沉默載體轉(zhuǎn)化甜瓜后，接種白粉病菌發(fā)現(xiàn)其植株對(duì)白粉病菌有一定的抗性，結(jié)果表明甜瓜 CmMLO2 是一個(gè)易感基因[39]；黃瓜CsMLO1基因的缺失，使用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的誘變 CsaMLOamp; 基因?qū)е轮仓陮?duì)白粉病的抗性增強(qiáng)[37-38]；辣椒 CaMLO2^[44] 在擬南芥中過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了對(duì)丁香假單胞菌的敏感性，侵染病后其活性氧含量及電導(dǎo)率相較于野生型植株高；HbMLO-12在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的過(guò)表達(dá)可以提高植物白粉病的易感性，反之，HbMLO-12基因沉默的擬南芥對(duì)白粉病的抗性增強(qiáng)[45]，與本試驗(yàn)的研究結(jié)果相似。

綜上所述，本研究從籽用美洲南瓜中鑒定出18個(gè)MLO基因并進(jìn)行具體分析，并明確其第V家族基因在白粉病菌脅迫下的表達(dá)模式，推測(cè)CpMLO2，CpMLO4 和 CpMLOI5 可能是感病基因，前期克隆了 CpMLOI5 ，本研究通過(guò)將CpM-LO15遺傳轉(zhuǎn)化煙草，成功獲得轉(zhuǎn)基因株系，在接種白粉病菌后，在煙草中過(guò)表達(dá)CpMLO15導(dǎo)致相較于野生型更易感染白粉病菌，其SOD、POD、CAT活性相比于野生型的低，而MDA含量相對(duì)較高，抗病基因的表達(dá)量降低。過(guò)表達(dá)CpM-LO15增加了煙草對(duì)白粉病的易感性。

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Identification and Functional Characterization of CpMLO Gene Family in Cucubita pepo L. and Its Role in Response to Powdery Mildew Stress

LIU Xian，WANG Ping and XU Ke （College of Horticulture and Plant Protection，Inner Mongolia Agricultural University，HohhotOloooo，China）

Abstract Investigating the MLO gene family in Cucurbita pepo （seed pumpkin） provides theoretical reference to support disease-resistant breeding and marker-assisted selection in this species. In this study，the C_PMLO gene family was identified from the Cucubita pepo genome，and the subcellular localization of the CpMLO15 protein was analyzed using bioinformatics analysis. The function of CpM- 1 LO15 was verified by tobacco transformation experiments. The results showed that 18MLO genes were identified from the Cucubita pepo genome. Phylogenetic analysis revealed that these MLOs clustered into seven clades，and gene structure analysis showed that genes within the same clade shared similar intron一exon structures. Analysis indicated that the MLO gene promoters contain numerous cis-acting elements related to growth，development，and stress responses. Moreover，expression pattern analysis suggested that CpMLO2，CpMLO4 and CpMLOI5 may be involved in the susceptibility of Cucubita pepo to powdery mildew infection. Subcellular localization analysis confirmed that CpMLO15 was localized to the cell membrane. Overexpression of CpMLOI5 in transgenic tobacco plants increased susceptibility of powdery mildew.

Key WordsCucubita pepo; MLO gene family; Expression analysis; Powdery mildew; Functional analysis

Received 2024-03-21 Returned 2024-05-30

Foundation item Natural Science Foundation of Inner Mongolia Autonomous Region （No. 2021MS0305o）； Science and Technology Program of Inner Mongolia Autonomous Region（No. 2021GG0l48，No.2Ol20212）； Special Plan for Plant and Animal Breeding of Inner Mongolia Agricultural University（No.YZGC2017018）.

First authorLIU Xian，female，master student. Research area： vegetable cultivation physiology and molecular biology.E-mail：2388382536@qq. com

Corresponding authorWANG Ping，female，Ph. D，professor，doctoral supervisor. Research area：vegetable cultivation physiology and molecular biology.E-mail：wangping@imau. edu. cn

（責(zé)任編輯：成敏Responsible editor：CHENG Min）