杜仲葉和梔子提取物通過抑制自噬促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞褐變

【摘要】 目的 探究杜仲葉和梔子提取物對白色脂肪細(xì)胞褐變的促進(jìn)作用，并探究其可能的機(jī)制。方法 采用CCK8法、Western blotting法、qRT-PCR法、油紅O染色法、BODIPY染色法、線粒體熒光染料檢測杜仲葉和梔子提取物對成熟的3T3-L1細(xì)胞褐變的影響，采用自噬激活劑（雷帕霉素）探明其可能的作用機(jī)制。結(jié)果 研究顯示杜仲葉和梔子提取物能夠上調(diào)褐變相關(guān)蛋白及mRNA（PRDM16、PGC-1α、UCP-1）的表達(dá)（P均lt; 0.05），抑制自噬相關(guān)蛋白（Beclin-1、p62）和mRNA（LC3、Beclin-1、p62）及自噬小體的表達(dá)（P均lt; 0.05），抑制脂滴積累，增加線粒體豐度。采用自噬激活劑（雷帕霉素）恢復(fù)杜仲葉和梔子提取物對3T3-L1細(xì)胞自噬水平后（P均lt; 0.05），發(fā)現(xiàn)杜仲葉和梔子提取物對3T3-L1細(xì)胞的褐變作用也被自噬激活劑逆轉(zhuǎn)（P均lt; 0.05）。結(jié)論 杜仲葉和梔子提取物可能通過抑制自噬進(jìn)而促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞褐變，其在臨床防治肥胖及相關(guān)代謝性疾病方面具有潛在作用。

【關(guān)鍵詞】 杜仲葉提取物；梔子提取物；自噬；白色脂肪細(xì)胞褐變；肥胖；脂滴積累

Eucommia ulmoides leaves and Gardenia extracts promote white adipocyte browning by inhibiting autophagy

XIONG Shaofeng1， HU Zhi1， FANG Yang1， ZHAO Le1， ZHANG Jie1， GUO Muying2， WEI Li2， WANG Kun1

（1.Department of Pharmacy， the First Affiliated Hospital of Jiangxi Medical College， Nanchang University， Nanchang 330100， China；2.Department of Nursing， the First Affiliated Hospital of Jiangxi Medical College， Nanchang University， Nanchang 330100， China）

Corresponding author： WANG Kun， E-mail： 9612266597@qq.com

【Abstract】 Objective To investigate whether extracts of Eucommia ulmoides leaves and Gardenia have the effects on promoting white adipose browning， and to explore their possible mechanisms. Methods The effects of Eucommia ulmoides leaves and Gardenia extracts on mature 3T3-L1 cells were detected using CCK8 assay， Western blotting， qRT-PCR， Oil red O staining， BODIPY staining， and mitochondrial fluorescent dye. Subsequently， autophagy inhibitors （rapamycin） were used to explore their possible mechanisms of action. Results Eucommia ulmoides leaves and Gardenia extracts could upregulate browning-related proteins and mRNAs （PRDM16， PGC-1α and UCP-1） （all P lt; 0.05）， inhibited autophagy-related proteins （Beclin-1 and p62） and mRNAs （LC3， Beclin-1 and p62） and the expression of autophagosomes （all P lt; 0.05）， inhibited lipid droplet accumulation， and increased mitochondrial abundance. The use of autophagy activator （rapamycin） restored the autophagy effect of Eucommia ulmoides leaf and Gardenia extracts on 3T3-L1 cells （all P lt; 0.05）， and it was found that the browning effect of Eucommia ulmoides leaf and Gardenia extracts on 3T3-L1 cells was also reversed by autophagy activator （all P lt; 0.05）. Conclusion Extracts of Eucommia ulmoides leaves and Gardenia have the effects upon promoting the browning of white adipocytes by inhibiting autophagy， demonstrating potential clinical applications in the clinical prevention and treatment of obesity and related metabolic diseases.

【Key words】 Eucommia ulmoides leaf extract； Gardenia extract； Autophagy； Browning of white adipocyte； Obesity；

Lipid droplet accumulation

近年來，人們的物質(zhì)生活和精神生活均得到了極大豐富，肥胖問題也日益凸顯，并呈年輕化的趨勢［1］。肥胖與多種心腦血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)，如糖尿病、高血壓、脂肪性肝病、高血脂、動脈粥樣硬化等［2-8］。據(jù)報道，約70%的肥胖患者因心血管疾病或2型糖尿病而死亡，給家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)［9］。因此，肥胖已經(jīng)成為一個亟待解決的全球性公共衛(wèi)生問題。

脂肪細(xì)胞分白色、棕色、米色3種，均源自間充質(zhì)干細(xì)胞。白色脂肪主要功能為儲能、保護(hù)內(nèi)臟、保溫；棕色與米色通過非顫抖產(chǎn)熱燃燒脂肪維持能量平衡，預(yù)防肥胖及相關(guān)疾病［10］。寒冷、運動等條件下，白色脂肪可轉(zhuǎn)化為棕色或米色，稱為白色脂肪褐變，為肥胖潛在治療方法［11］。

自噬是一種適應(yīng)性生理機(jī)制，對促進(jìn)器官組織發(fā)育和維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。異常的自噬與多種疾?。ㄈ缢ダ?、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、癌癥、肥胖等）相關(guān)［12-20］。研究已證實，自噬不僅與肥胖的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，還參與了脂肪細(xì)胞的分化［21］。在肥胖模型中，脂肪組織顯示出過度自噬，Atg5和LC3的表達(dá)在mRNA和蛋白水平均顯著上升，自噬體數(shù)量增加，線粒體自噬的過度激活導(dǎo)致線粒減少，從而抑制白色脂肪褐變的過程，證實自噬在肥胖及其相關(guān)病理過程中的負(fù)性調(diào)控作用［18］。

杜仲和梔子都是江西的道地藥材，因其量多質(zhì)優(yōu)和豐富的藥理作用，受到廣泛關(guān)注。杜仲葉提取物具有調(diào)脂、調(diào)節(jié)腸道菌群、抑制細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激、保護(hù)血管內(nèi)皮等多種生物活性［22-24］。梔子提取物則可通過調(diào)節(jié)膽汁酸代謝來改善肝功能［25］。此外，二者還對糖尿病、肥胖癥等代謝性疾病具有潛在的治療作用。本研究聚焦于杜仲葉和梔子提取物對成熟3T3-L1細(xì)胞的影響，探究二者對脂肪褐變、自噬水平、線粒體活力等關(guān)鍵生物學(xué)過程的影響，揭示其潛在的作用機(jī)制，旨在更全面地了解杜仲葉和梔子提取物在防治肥胖癥方面的積極作用，為對抗肥胖癥的作用機(jī)理提供新的見解，為開發(fā)新型抗肥胖藥物提供思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、血清培養(yǎng)基及試劑

采用購自美國菌種保藏中心的3T3-L1前脂肪細(xì)胞（CRL-173）作為研究模型，胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司，DMEM培養(yǎng)基購自北京Solarbio，β-Actin鼠多克隆抗體（TA-09）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，PRDM16兔單克隆抗體（ab106410）、UCP-1兔單克隆抗體（ab234430）和PGC-1α兔單克隆抗體（ab106814）購自美國Abcam，SYBR Green（FP201）購自天根生化科技（北京）有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（22107）購自上海Tolobio，TRIzol試劑（15596026）購自美國Invitrogen，實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）引物購自上海吉凱生物有限公司，其他常規(guī)的實驗消耗試劑均從北京Solarbio采購。

1.2 實驗分組

1.2.1 杜仲葉和梔子提取物對3T3-L1細(xì)胞活力的影響

將誘導(dǎo)8 d后的3T3-L1細(xì)胞均勻接種于96孔培養(yǎng)皿中隨機(jī)分為6組：對照組、杜仲葉和梔子提取物不同質(zhì)量濃度組（1+1、10+10、100 +100、200+200、400+400，單位均為mg/mL），對照組采用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，杜仲葉和梔子提取物不同濃度組加入含對應(yīng)杜仲葉和梔子提取物質(zhì)量濃度的完全培養(yǎng)基，CCK8測定24、48、72 h后的細(xì)胞活力。

1.2.2 杜仲葉和梔子提取物對3T3-L1細(xì)胞褐變的影響

基于前期實驗的結(jié)果，選擇200 mg/mL杜仲葉提取物+200 mg/mL梔子提取物作為聯(lián)合實驗質(zhì)量濃度，并設(shè)定48 h作為處理時間。將誘導(dǎo)8 d后的3T3-L1均勻接種于培養(yǎng)皿，分為2組：對照組、杜仲葉和梔子提取物（200 mg/mL+200 mg/mL）組，處理細(xì)胞48 h后，采用Western blotting法檢測褐變相關(guān)蛋白表達(dá)情況；采用qRT-PCR測定褐變相關(guān)mRNA水平。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.2.3 杜仲葉和梔子提取物對3T3-L1細(xì)胞脂滴積累和線粒體豐度的影響

將誘導(dǎo)8 d后的3T3-L1均勻接種于培養(yǎng)皿，分為2組：對照組、杜仲葉和梔子提取物（200 mg/mL+

200 mg/mL）組，處理細(xì)胞48 h后，采用油紅O和BODIPY檢測脂滴積累情況；采用線粒體染料測定線粒體豐度。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.2.4 杜仲葉和梔子提取物對3T3-L1細(xì)胞自噬的影響

將誘導(dǎo)8 d后的3T3-L1均勻接種于培養(yǎng)皿，分為2組：對照組、杜仲葉和梔子提取物（200 mg/

mL+200 mg/mL）組，處理細(xì)胞48 h后，采用單丹磺酰尸胺（Monodansylcadaverine， MDC）檢測自噬小體情況，Western blotting法檢測自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況；采用qRT-PCR測定自噬相關(guān)mRNA水平。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.2.5 自噬激活劑逆轉(zhuǎn)杜仲葉和梔子提取物對3T3-L1細(xì)胞褐變的作用

將誘導(dǎo)8 d后的3T3-L1均勻接種于培養(yǎng)皿，分為4組：對照組（采用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)）、杜仲葉和梔子提取物（200 mg/mL+200 mg/mL）組、雷帕霉素（自噬激活劑）組、雷帕霉素+杜仲葉和梔子提取物（200 mg/mL+200 mg/mL）組，處理細(xì)胞48 h后，采用Western blotting法檢測褐變相關(guān)蛋白表達(dá)情況；采用qRT-PCR測定褐變相關(guān)mRNA水平。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.3 方 法

1.3.1 qRT-PCR檢測mRNA表達(dá)情況

PCR擴(kuò)增引物均由上海吉凱生物有限公司合成，引物序列見表1，逆轉(zhuǎn)錄與qRT-PCR操作參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.2 Western blotting法檢測相關(guān)蛋白表達(dá)情況

不同處理組的細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液［蛋白裂解液（radioImmunoprecipitation assay，RIPA）∶苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonylfluoride，PMSF）=100∶1］后置于冰上裂解15 min，測定蛋白濃度，根據(jù)定量結(jié)果進(jìn)行制樣，將上樣緩沖溶液加入細(xì)胞裂解液中并煮沸10 min，隨后采用12%的SDS-PAGE電泳分離，濕轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜材料（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，濕轉(zhuǎn)完成后使用8%脫脂牛奶封閉1.5 h，加一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜5遍，二抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜5遍后用ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測。

1.3.3 油紅O染色檢測脂滴積累情況

將處理好的細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）清洗2遍，加入10%多聚甲醛固定20 min，PBS清洗2遍，加入油紅O染料，37 ℃恒溫箱染色30 min；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）清洗2遍，置于倒置顯微鏡下觀察其染色情況，拍照記錄。此外，用無水異丙醇洗脫細(xì)胞內(nèi)的染料以進(jìn)行定量，通過紫外分光光度計測量510 nm處的吸光度值（A），記錄數(shù)據(jù)。

1.3.4 BODIPY熒光染料檢測脂滴積累情況

將處理好的細(xì)胞用PBS清洗2遍，加入BODIPY熒光染料染色10 min，置于激光共聚焦掃描顯微鏡觀察其染色情況，拍照記錄。

1.3.5 線粒體熒光染料檢測細(xì)胞線粒體豐度

將處理好的細(xì)胞用PBS清洗2遍，加入線粒體熒光染料染色15 min，置于激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察其染色情況，拍照記錄。

1.3.6 MDC染色檢測自噬小體

將處理好的細(xì)胞用PBS清洗2遍，加入MDC染料染色15 min，置于激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察其染色情況，拍照記錄。

1.3.7 雞尾酒誘導(dǎo)法

首先采用含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基進(jìn)行3T3-L1前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)，然后采用雞尾酒誘導(dǎo)法進(jìn)行誘導(dǎo)［16］。先用分化培養(yǎng)基Ⅰ（含50 nmol/L甲狀腺三碘原氨酸、1 μmol/L地塞米松、10 μg/mL胰島素和0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤的完全培養(yǎng)基）誘導(dǎo)2 d，然后用分化培養(yǎng)基Ⅱ（含

1 μmol/L羅格列酮、50 nmol/L甲狀腺三碘原氨酸和10 μg/mL胰島素的完全培養(yǎng)基）誘導(dǎo)細(xì)胞4 d，然后用分化培養(yǎng)基Ⅲ（含10 μmol/L羅格列酮的完全培養(yǎng)基）誘導(dǎo)2 d。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗重復(fù)3次，取均值。采用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以雙側(cè)P lt; 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 杜仲葉和梔子提取物對3T3-L1細(xì)胞活力的影響

CCK8結(jié)果顯示：無論是哪個加藥時間，隨著加藥濃度的上升，細(xì)胞存活率均呈下降趨勢。當(dāng)加藥時間為24 h和48 h時，杜仲葉和梔子提取物濃度為400 mg/mL+400 mg/mL時呈現(xiàn)明顯毒性，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P lt; 0.05）；當(dāng)加藥時間為72 h時，杜仲葉和梔子提取物濃度為100 mg/mL+100 mg/mL就呈現(xiàn)明顯毒性，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P lt; 0.05），見圖1A。最終選擇200 mg/mL+200 mg/mL、48 h作為后續(xù)的實驗濃度及時間。實驗工作模式如圖1B。

2.2 杜仲葉和梔子提取物對脂肪細(xì)胞褐變的影響

經(jīng)200 mg/mL杜仲葉+200 mg/mL梔子提取物處理成熟3T3-L1細(xì)胞48 h后，褐變相關(guān)蛋白和mRNA表達(dá)水平升高（均P lt; 0.05），見圖2。

2.3 杜仲葉和梔子提取物對脂肪細(xì)胞脂滴積累和線粒體豐度的影響

經(jīng)200 mg/mL杜仲葉+200 mg/mL梔子提取物處理成熟3T3-L1細(xì)胞48 h后，細(xì)胞脂滴減少，線粒體增多（均P lt; 0.05），見圖3。

2.4 杜仲葉和梔子提取物對脂肪細(xì)胞自噬的影響

經(jīng)200 mg/mL杜仲葉+200 mg/mL梔子提取物處理成熟3T3-L1細(xì)胞48 h后，自噬水平降低，自噬小體減少（均P lt; 0.05），見圖4。

2.5 自噬激活劑逆轉(zhuǎn)杜仲葉和梔子提取物對脂肪細(xì)胞褐變的作用

自噬激活劑會逆轉(zhuǎn)杜仲葉和梔子提取物對脂肪細(xì)胞褐變的作用，見圖5。

3 討 論

隨著現(xiàn)代社會生活方式的轉(zhuǎn)變，長期能量攝入超過消耗已成為肥胖癥的主要誘因。近年來，肥胖人數(shù)的激增及其年輕化、兒童化的趨勢，已引起全球范圍的廣泛關(guān)注。更為嚴(yán)重的是，長期肥胖與多種代謝性疾病如糖尿病、高血壓、脂肪肝等密切相關(guān)，使其成為一個亟待解決的全球性公共衛(wèi)生問題［1］。鑒于肥胖主要由能量代謝失衡（即攝入量大于消耗量）引發(fā)，目前臨床上防治肥胖的主要策略集中在控制能量攝入和（或）增加能量消耗上。這些方法包括節(jié)食、增加運動量、肥胖外科手術(shù)以及藥物治療等。然而，這些方法均有一定的局限性，如生活質(zhì)量降低、難以長期堅持、肥胖反彈以及藥物不良反應(yīng)等［9］。近年來，研究者們對肥胖癥的防治機(jī)制進(jìn)行了深入的探索。有報道指出，相較于正常人群，肥胖患者的自噬水平異常升高，而機(jī)體白色脂肪細(xì)胞的褐變水平較低［26］。研究已證實，促進(jìn)脂肪細(xì)胞褐變在防治肥胖癥方面展現(xiàn)出積極有效的潛力。因此，與細(xì)胞褐變相關(guān)的靶點已成為當(dāng)前防治肥胖癥研究的熱點之一。通過深入研究這些靶點，有望為肥胖癥的防治提供新的思路和方法［18］。

本研究著重探討了杜仲葉和梔子提取物在促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞褐變、防治肥胖及其相關(guān)代謝綜合征方面的潛在作用。實驗結(jié)果顯示，隨著杜仲葉和梔子提取物濃度的增加，褐變標(biāo)志性蛋白PRDM16表達(dá)水平均呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，這表明這2種提取物具有促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞棕色化的能力，且杜仲葉和梔子提取物的聯(lián)合使用比單劑量使用杜仲葉或梔子提取物時棕色化標(biāo)志蛋白PRDM16表達(dá)量要多，提示杜仲葉和梔子提取物聯(lián)合給藥會產(chǎn)生協(xié)同效果。油紅O染色和BODIPY熒光染色實驗顯示，杜仲葉和梔子提取物能夠有效抑制白色脂肪細(xì)胞中脂滴的積累。同時，線粒體熒光染色結(jié)果表明，2種提取物能夠顯著增加線粒體的豐度，進(jìn)一步支持了它們促進(jìn)脂肪細(xì)胞褐變的作用。

在探討杜仲葉和梔子提取物對細(xì)胞自噬的影響時，本研究顯示自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ

的mRNA表達(dá)量降低，而p62蛋白和mRNA表達(dá)量明顯升高，這表明2種提取物能夠抑制細(xì)胞自噬的發(fā)生。此外，MDC染色結(jié)果也進(jìn)一步證實了杜仲葉和梔子提取物能夠抑制自噬小體的生成。為了更深入地探究自噬在杜仲葉和梔子提取物促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞褐變過程中的作用，采用自噬激活劑來逆轉(zhuǎn)這2種提取物的自噬抑制作用。結(jié)果顯示，當(dāng)自噬被激活后，杜仲葉和梔子提取物的促褐變作用也隨之被逆轉(zhuǎn)。這一發(fā)現(xiàn)表明，杜仲葉和梔子提取物的促褐變作用與其抑制自噬的能力密切相關(guān)。

綜上所述，本研究不僅揭示了杜仲葉和梔子提取物在促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞褐變、防治肥胖及其相關(guān)代謝綜合征方面的潛在作用，還深入探討了其背后的作用機(jī)制，尤其是與細(xì)胞自噬的關(guān)系。雖然本研究僅限于細(xì)胞水平，但這些發(fā)現(xiàn)仍為進(jìn)一步開發(fā)基于杜仲葉和梔子提取物的抗肥胖藥物提供了新的思路和實驗基礎(chǔ)。未來在動物模型中的研究將有助于進(jìn)一步驗證其效果，并為臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

利益沖突聲明：本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突。

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（責(zé)任編輯：鄭巧蘭）