柴胡皂苷誘導人卵巢癌SKOV3細胞凋亡的作用機制

劉煉++張麗芳++方志南+++王曦燁

[摘要] 目的 探討柴胡皂苷對卵巢癌SKOV3細胞增殖、自噬及凋亡的影響。 方法 將SKOV3細胞分為對照組（正常培養(yǎng)SKOV3細胞）、低劑量組（SKOV3細胞+10 μmol/L柴胡皂苷）和高劑量組（SKOV3細胞+20 μmol/L柴胡皂苷）進行培養(yǎng)。采用四甲基偶氮唑藍（MTT）法檢測各組細胞24、48、72 h細胞增殖情況；采用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況；采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測各組細胞中Bcl-2、Bax和Caspase-3表達情況；采用Western blot技術(shù)檢測各組細胞LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ及Beclin-l表達情況。 結(jié)果 與對照組比較，低劑量組和高劑量組可抑制SKOV3細胞生長并促進凋亡（P < 0.05）；柴胡皂苷干預(yù)治療SKOV3細胞后，細胞中Bax/Bcl-2比值升高，Caspase-3表達增多（P < 0.05）；柴胡皂苷可使SKOV3細胞中LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值降低，Beclin-l表達升高，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。 結(jié)論 柴胡皂苷可通過增強卵巢癌細胞自噬強度，導致細胞凋亡，從而達到抑制人卵巢癌SKOV3細胞生長的作用。

[關(guān)鍵詞] 柴胡皂苷；卵巢癌；SKOV3細胞；自噬；凋亡

[中圖分類號] R329 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）01（b）-0025-04

Study on the apoptosis of ovarian cancer SKOV3 cells induced by saikosaponin

LIU Lian1 ZHANG Lifang1 FANG Zhinan1 WANG Xiye2

1.Department of Obstetrics and Gynecology， Hubei Space Hospital， Hubei Province， Xiaogan 432100， China； 2.Key Laboratory of Natural Product Chemistry and Functional Molecular Synthetic Autonomous Region， Inner Mongolia University for the Nationalities， Inner Mongolia Autonomous Region， Tongliao 028000， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of saikosaponin on proliferation， autophagy and apoptosis in ovarian cancer SKOV3 cells. Methods The SKOV3 cells were divided into control group （normal cultured SKOV3 cells）， low dose group （SKOV3 cells+10 μmol/L saikosaponin） and high dose group （SKOV3 cells + 20 μmol/L saikosaponin） and cultured. The proliferation of cells in each group was detected by four methyl AZO （MTT） method at 24， 48， 72 h； the apoptosis of cells was measured by flow cytometry； the expression of Bcl-2， Bax and Caspase-3 were detected by ELISA method； the expression of LC3-Ⅰ， LC3-Ⅱ and Beclin-l were analyzed by Western blot method. Results Compared with the control group， the proliferation of SKOV3 cells were decreased and the apoptosis rate of SKOV3 cells were promoted in the low dose group and high dose group （P < 0.05）. After intervention of SKOV3 cells with saikosaponin， the Bax/Bcl-2 ratio were increased and the expression of Caspase-3 were also increased （P < 0.05）； the LC3-I/LC3-II ratio were decreased， the expression of Beclin-l were increased， with statistically significant difference （P < 0.05）. Conclusion Saikosaponin can inhibit the growth of SKOV3 cells， enhance the autophagy intensity of ovarian cancer cells and lead to cell apoptosis.

[Key words] Saikosaponin； Ovarian cancer； SKOV3 cells； Autophagy； Apoptosis

卵巢癌是婦科常見的惡性疾病，占婦科癌癥的20%，5年生存率僅為30%，死亡率較高[1]。卵巢癌臨床癥狀多表現(xiàn)為絕經(jīng)后陰道出血，目前多以手術(shù)、化療治療為主，但效果并不理想；因此，尋找治療卵巢癌的有效藥物是目前亟待解決的問題。有研究表明，中藥柴胡中的有效成分柴胡皂苷可干擾腫瘤細胞S期DNA合成及蛋白質(zhì)代謝的作用，明顯抑制腫瘤細胞增殖[2]。本團隊提出柴胡皂苷可能通過影響卵巢癌SKOV3細胞自噬相關(guān)蛋白，從打破卵巢癌細胞凋亡/抗凋亡平衡，進而影響卵巢癌細胞增殖的科學假說；并應(yīng)用不同濃度的柴胡皂苷干預(yù)卵巢癌SKOV3細胞后，觀察自噬標志物LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ及Beclin-l的表達及對凋亡的影響，為使用中藥提取物柴胡皂苷治療卵巢癌提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

①柴胡皂苷（內(nèi)蒙古民族大學天然產(chǎn)物化學及功能分子合成內(nèi)蒙古自治區(qū)重點實驗室）；②SKOV3細胞（ATCC公司，美國）；③光學顯微鏡（Olympus，日本）；④一氧化氮檢測儀（NO-501，IMN，日本）；⑤水平搖床（WD-9405B，六一公司，北京）；⑥anti-LC3-Ⅰ、anti-LC3-Ⅱ、anti-Beclin-l、GAPDH內(nèi)參抗體（ABCAM公司）；⑦Annexin V細胞凋亡試劑盒（SIGMA，美國）；⑧Bcl-2、Bax和Caspase-3 ELISA試劑盒（SIGMA，美國）；⑨RPMI 1640（GIBCO，美國）。

1.2 細胞培養(yǎng)與分組

將SKOV3細胞加入到10%滅活小牛血清的MEM培養(yǎng)液中，于37℃，5%體積分數(shù)CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中貼壁生長，每2～3天傳代1次，待細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，經(jīng)過0.25%胰酶消化后，過濾成單細胞懸濁液[3]。將細胞懸濁液以5×104/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL培養(yǎng)基，細胞數(shù)5×103個。將細胞分為對照組（正常培養(yǎng)SKOV3細胞）、低劑量組（SKOV3細胞+10 μmol/L柴胡皂苷培養(yǎng)30 min）和高劑量組（SKOV3細胞+20 μmol/L柴胡皂苷培養(yǎng)30 min）。

1.3 觀察指標

1.3.1 細胞增殖率

實驗前用臺盼藍拒染法確認SKOV3細胞拒染率在95%以上，調(diào)整細胞數(shù)為4×107/L，取200 μL接種于96孔板中（每組細胞5個復孔），設(shè)對照組、空白載體組、實驗組，培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入5 g/L四甲基偶氮唑藍（MTT）20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后去上清，逐一加入DMSO 100 μL后震蕩混勻，待藍色晶體完全溶解反應(yīng)后，應(yīng)用酶標儀測定570 nm 處的吸光度值（OD值）[4]。抑制率（%）=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。

1.3.2細胞凋亡率

分別收集72 h培養(yǎng)的SKOV3細胞培養(yǎng)液，經(jīng)消化、PBS沖洗、懸浮、300目尼龍網(wǎng)過濾細胞后加入300 μL Binding Buffer懸濁細胞，加入5 μL Annexin V-FITC混合，再加入10 μL Propidium Iodide并充分混勻；常溫下避光反應(yīng)20 min；采用流式細胞儀檢測并應(yīng)用軟件分析結(jié)果[5]。

1.3.3 Bcl-2、Bax及Caspase-3表達

采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測Bcl-2、Bax及Caspase-3的表達，嚴格按照說明書操作[6]，具體步驟如下：①配制標準品液；②計算標準曲線；③加樣；④洗板；⑤孵育；⑥洗板；⑦暗反應(yīng)；⑧計算OD值；⑨計算結(jié)果。

1.3.4 LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ及Beclin-l表達

Western blot檢測步驟：①蛋白質(zhì)抽提；②蛋白質(zhì)定量；③SDS-PAGE；④轉(zhuǎn)印至PVDF膜；⑤封閉；⑥孵育一抗；⑦孵育二抗；⑧ECL底物發(fā)光；⑨圖像保存。普通抗體的封閉液、一抗孵育液、二抗孵育液為5%脫脂奶粉溶液。檢測各組細胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ及Beclin-l的表達[7]。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩兩比較采用t檢驗，多組之間兩兩比較采用q檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組SKOV3細胞增殖情況

與對照組比較，低、高劑量組均對SKOV3細胞有抑制生長作用（P < 0.05）；與低劑量組相比較，高劑量組對SKOV3細胞生長抑制率更高（P < 0.05）。見表1。

2.2 各組SKOV3細胞凋亡情況

與對照組細胞凋亡率（2.98±0.31）%相比，低劑量組細胞凋亡率（5.21±0.31）%明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），而與低劑量組比較，高劑量組細胞凋亡率（29.74±3.21）%增加明顯（P < 0.05）。見圖1。

2.3 各組SKOV3細胞中Bax、Bcl-2及Caspase-3表達情況

與對照組比較，低、高劑量組Bax/Bcl-2值及Caspase-3表達水平均升高（P < 0.05）；與低劑量組相比，高劑量組Bax/Bcl-2值及Caspase-3表達水平更高（P < 0.05）。見表2。

2.4 各組SKOV3細胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ及Beclin-l表達情況

與對照組比較，應(yīng)用柴胡皂苷干預(yù)后，低、高劑量組LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值降低，且低劑量組比值較高劑量組更低，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；與對照組比較，低、高劑量組Beclin-1表達明顯增高，且高劑量組比低劑量組表達更高，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見圖2、表3。

3 討論

因卵巢癌發(fā)現(xiàn)時多為中晚期，預(yù)后極差，現(xiàn)階段手術(shù)治療效果欠佳，臨床治療多以化療為主[8]。但化療藥物毒副作用強、靶向性不明確、易產(chǎn)生耐藥性，在臨床應(yīng)用中受到諸多限制[9]。因此，尋找高效、靶向治療卵巢癌的方法不僅是目前的研究熱點，更是亟待解決的問題。柴胡皂苷是中藥柴胡的主要有效成分，研究證實柴胡皂苷具有抗病毒、抗過敏、抗炎、抗腫瘤和抑制細胞黏附等作用[10]?，F(xiàn)階段研究認為[11-12]，柴胡皂苷抗腫瘤作用可能是通過增強巨噬細胞游走、吞噬能力，抑制腫瘤細胞分裂、生長，并誘導凋亡等機制實現(xiàn)的。Lee等[13]通過實驗發(fā)現(xiàn)，柴胡皂苷對胃癌、乳腺癌、肝癌細胞均有較強的殺傷作用，其中對于胃癌細胞的殺傷作用最強。但在目前還沒有柴胡皂苷治療卵巢癌的深入研究。

自噬是細胞自身保護的方法之一，具有動態(tài)性和多面性等特征。對于腫瘤細胞而言，適度的自噬可通過降解細胞內(nèi)大分子為細胞的生存、生長提供能量；過度活化的自噬則導致細胞死亡的發(fā)生[14]。在細胞內(nèi)，LC3-Ⅰ可轉(zhuǎn)變?yōu)長C3-Ⅱ，而后者又可與自噬體膜相結(jié)合，故LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ常被看作自噬的進展程度[15]。

Beclin-l可與Vps34形成復合體，該復合體使磷脂酰肌醇磷酸化，產(chǎn)生三磷酸磷脂酰肌醇以引導自噬相關(guān)蛋白的定位[16]。故Beclin-l也被看做自噬發(fā)生的重要因子。通常自噬與凋亡之間的關(guān)系大致分為3種：促進、拮抗和合作[17]。自噬和凋亡協(xié)作引起細胞死亡，兩者可能同時發(fā)生；或者當其中一個程序受到阻礙或抑制時，另一個程序被激活并繼續(xù)完成細胞死亡過程[18]。

本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用柴胡皂苷干預(yù)卵巢癌SKOV3細胞后，可明顯抑制卵巢癌細胞增長，且其抑制SKOV3細胞增殖；經(jīng)流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡率隨柴胡皂苷劑量增加而增加，說明柴胡皂苷通過增加細胞凋亡而起到抑制卵巢癌細胞增長的作用。為了深入探究柴胡皂苷對卵巢癌SKOV3細胞的作用，本研究進一步檢測了凋亡相關(guān)因子Caspase-3、Bcl-2和Bax，及自噬相關(guān)因子LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和Beclin-l的表達情況，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用柴胡皂苷干預(yù)后Caspase-3表達升高、Bax/Bcl-2比值升高，說明柴胡皂苷可打破卵巢癌細胞凋亡/抗凋亡平衡，并促進卵巢癌SKOV3細胞凋亡，這與步世忠[2]的研究結(jié)果相似。Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用柴胡皂苷干預(yù)治療后，卵巢癌細胞中LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值明顯降低，而Beclin-l的表達明顯升高。Beclin-l是一種重要的自噬調(diào)節(jié)因子，后被人們發(fā)現(xiàn)可與Bcl-2相互作用[19]，Beclin-1/Bcl-2是確定的自噬與凋亡的分子連接。當Beclin-l表達水平升高時，可將促凋亡蛋白BAK/BAX從與Bcl-2的結(jié)合中釋放出來，從而促進細胞凋亡[20-21]，這可能是柴胡皂苷促進卵巢癌SKOV3細胞自噬、凋亡的原因之一。

因此，柴胡皂苷對卵巢癌SKOV3細胞增殖有明顯的抑制作用，其機制可能是通過促進自噬與凋亡相關(guān)因子表達，進而引發(fā)細胞凋亡，抑制卵巢癌細胞生長。但柴胡皂苷是單純通過影響自噬相關(guān)因子進而誘導細胞凋亡，還是同時影響SKOV3細胞自噬及凋亡需進一步實驗證明。

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（收稿日期：2016-10-15 本文編輯：李岳澤）