UPLC-QTof-MS 測(cè)定不同提取條件下柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 的轉(zhuǎn)化規(guī)律

郭 智，彭 冰，李宗陽(yáng)，潘瑞樂(lè)*

1中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193;2 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院 北京 100010

柴胡為臨床的常用中藥，其原植物為傘形科柴胡屬植物北柴胡Bupleurum chinense DC.或狹葉柴胡Bupleurum scorzonerifolium Wild 的干燥根，具有疏散退熱、疏肝解郁、升陽(yáng)舉陷之功效［1］。研究表明柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 是柴胡藥材中含量高、活性好的兩個(gè)主要成分，《中國(guó)藥典》(2010 版)記載柴胡藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 作為定性定量的控制指標(biāo)。文獻(xiàn)［2-4］指出柴胡皂苷a、d 結(jié)構(gòu)含有醚鍵，遇酸或受熱不穩(wěn)定，因此測(cè)定柴胡皂苷a、d 含量時(shí)建議采用低溫提取并加入少量堿水。本課題組前期在測(cè)定某柴胡制劑中柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 的含量時(shí)，發(fā)現(xiàn)制劑中柴胡皂苷d 未能檢出，柴胡皂苷a 的含量下降了很多。相同藥材采用甲醇低溫提取時(shí)柴胡皂苷a、d 具有較高的含量;但采用水煮提取時(shí)，發(fā)現(xiàn)水提液呈酸性，柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 均發(fā)生了不同程度的變化。柴胡作為臨床常用中藥，湯劑及中成藥制劑中使用很多，且大多以水煎煮法提取。以水作溶劑加熱提取柴胡藥材時(shí)，柴胡皂苷a、d 如何變化、變化成何種化合物及變化程度未見(jiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究利用高靈敏度的UPLCQTof-MS 對(duì)不同提取條件柴胡藥材柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 的變化進(jìn)行定性研究，以期找到柴胡藥材和制劑質(zhì)量控制的合理指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Acquity UPLC I-class 超高效液相系統(tǒng)(沃特世)，Xervo G2 QTof 質(zhì)譜系統(tǒng)(沃特世)，Acquity 工作站(沃特世)，Masslynx4.1 工作站(沃特世);Integral 3 Milli-Q 超純水系統(tǒng)(默克密理博);MS105 DU電子分析天平(梅特勒);N1100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化);KQ-250B 超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。Optima LC/MS 乙腈(賽默飛)，HPLC 甲醇(賽默飛)。提取用乙醇為分析純(北京化工廠)，提取用水為市售Wahaha 純凈水。

柴胡皂苷a(SSa)、柴胡皂苷d(SSd)標(biāo)準(zhǔn)品由中國(guó)藥品生物制品鑒定所提供，批號(hào)分別為110777-200406、110778- 200506;柴胡皂苷b1(SSb1)標(biāo)準(zhǔn)品由成都曼斯特生物科技有限公司提供，批號(hào)為MUST-13 091109;柴胡皂苷b2(SSb2)標(biāo)準(zhǔn)品由天津馬克生物技術(shù)有限公司提供，批號(hào)為2012-1205。柴胡樣品采自甘肅隴西縣，經(jīng)張本剛教授鑒定為植物銀州柴胡B.yinchowense 的干燥根。樣品標(biāo)本存于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所標(biāo)本館。

1.2 儀器條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱:Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm ×50 mm，1.7 μm);保護(hù)柱:VanGuand BEH C18(2.1 mm×5 mm，1.7 μm)，流動(dòng)相:A 為乙腈，B 為0.01%甲酸水溶液，梯度洗脫程序:0～2 min，10%～30% A;2～9 min，30%～38% A;9～11 min，38%～50% A;11～12 min，50%～100% A;12～13.5 min，100%A;13.5～13.51 min，100%～10% A;13.51～15 min，10% A;流速:0.45 mL/min;進(jìn)樣量:1 μL;柱溫35 ℃。

1.2.2 質(zhì)譜條件

負(fù)離子，MSe模式;檢測(cè)范圍100～1500 Da;毛細(xì)管電壓:3 kV，錐孔電壓:45 V，裂解電壓:45～55 V;錐孔氣流量:50 L/h;脫溶劑氣流量:800 L/h;源溫:100 ℃;脫溶劑氣溫度350 ℃;準(zhǔn)確質(zhì)量測(cè)定采用亮氨酸-腦啡肽(Leucine-Enkephalin，m/z=554.2615)溶液做為質(zhì)量鎖定溶液。

在以上條件下，四種柴胡皂苷均能達(dá)到基線分離，質(zhì)譜信號(hào)響應(yīng)良好。

1.3 對(duì)照品溶液制備

分別精密稱定柴胡皂苷a、d、b1、b2分別為2.38、2.52、1.93、2.43 mg，使用色譜甲醇定容于2 mL 容量瓶得到對(duì)照品儲(chǔ)備液。精確吸取儲(chǔ)備液100 μL 于25 mL 容量瓶，色譜甲醇定容后吸取2.0 mL，使用0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液，分別得SSa、SSd、SSb1、SSb2對(duì)照品工作液。

1.4 供試品溶液制備

1.4.1 提取方法設(shè)計(jì)

選擇溫度(30 ℃和100 ℃)、溶劑(水和乙醇)、酸堿度(酸性、中性和堿性)作為考查因素，設(shè)計(jì)不同的提取方法，見(jiàn)表1。

表1 柴胡提取方法設(shè)計(jì)Table 1 Different extraction conditions of saikosaponin a and saikosaponin d

1.4.2 制備流程

精密稱定柴胡藥材粉末(40 目)1.00 g，置于50 mL 梨形瓶中，精確加入25 mL 提取液，分別按照表2 設(shè)計(jì)的方法提取。各提取液過(guò)濾，濾渣用少量相同提取液潤(rùn)洗兩次，合并濾液，減壓回收至干，殘?jiān)尤肷V純甲醇使其充分溶解，定溶于25 mL 容量瓶，搖勻。分析前用0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液，既得供試品溶液，編號(hào)按表1 順序?yàn)?～12。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 對(duì)照品SSa、SSd、SSb1、SSb2質(zhì)譜裂解規(guī)律

SSa、SSd、SSb1、SSb2屬于同分異構(gòu)體，在此分析條件下，SSa、SSd、SSb1、SSb2的色譜保留時(shí)間分別為6.56、10.37、8.26、6.84 min 對(duì)照品的總離子流色譜圖見(jiàn)圖1;ESI 離子源負(fù)離子模式下，它們具有基本相同的一級(jí)質(zhì)譜，基峰為［M-H +HCOOH］ˉ(m/z=825.4635);二級(jí)質(zhì)譜主要的碎片峰有:［M-H］ˉ(m/z=779.4594)，［M-H-Glc］ˉ(m/z=617.4050)，［MH-Glc-Fuc-］ˉ(m/z=471.3469)，SSb1和SSb2還有［M-H-Glc-Fuc-CH2OH］ˉ(m/z=423.2360)。

圖1 對(duì)照品SSa、SSd、SSb1、SSb2的結(jié)構(gòu)式和總離子流色譜圖Fig.1 Chemical structures and total ion chromatograms of SSa，SSd，SSb1，SSb2standards

2.2 柴胡不同提取方法柴胡皂苷a 和d 的UPLCQTof-MS 研究

不同提取方法柴胡樣品1～12 的UPLC-QTof-MS 色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 中樣品1～4 為酸性條件下提取的柴胡樣品的UPLC-MS 色譜圖。由圖可知，四個(gè)樣品均未檢測(cè)出柴胡皂苷a(保留時(shí)間為6.56 min)、d(保留時(shí)間為10.37 min)。在常溫酸性條件下提取的樣品1和2 中檢測(cè)到柴胡皂苷b1(保留時(shí)間為8.26 min)和柴胡皂苷b2(保留時(shí)間為6.84 min)。以水為溶劑，加酸加熱回流條件提取的樣品3 中，柴胡皂苷a、d、b1、b2均未檢測(cè)出，在此條件下柴胡皂苷發(fā)生酸水解;以乙醇作溶劑，加酸加熱回流提取的樣品4中，可檢測(cè)到脫去兩分子糖的苷元加甲酸峰(m/z:517.3536)。

圖2 中樣品5～8 為中性條件下提取的柴胡樣品的UPLC-MS 色譜圖。由圖可知，四個(gè)樣品中均有柴胡皂苷a、d 檢出。其中水、醇常溫提取和醇加熱提取的樣品5、6、8 檢測(cè)到柴胡皂苷a、d 為大量成分，基本無(wú)柴胡皂苷b1檢出，有少量柴胡皂苷b2檢出。由樣品6 中小量柴胡皂苷b2的檢出推測(cè)柴胡生藥中也含有少量柴胡皂苷b2。水加熱提取的樣品7 中柴胡除有柴胡皂苷a、d 檢出外，還有較大量的柴胡皂苷b2檢出，測(cè)定其提取液的pH 值由中性轉(zhuǎn)變?yōu)樗嵝?pH=4)，由于酸性條件部分柴胡皂苷d 水解開(kāi)環(huán)生成柴胡皂苷b2。

圖2 中樣品9～12 為堿性條件下提取的柴胡樣品的UPLC-MS 色譜圖。由圖可知，四個(gè)樣品中柴胡皂苷a、d 均為大量成分，無(wú)柴胡皂苷b1檢出，四個(gè)樣品均有小量柴胡皂苷b2檢出。加入堿可以抑制柴胡皂苷a、d 的水解開(kāi)環(huán)。

對(duì)1～12 號(hào)樣品色譜圖進(jìn)行積分，以SSa、SSd、SSb1、SSb2的最大峰面積為基峰(100%)分別計(jì)算相對(duì)含量，圖3 為1～12 號(hào)樣品柴胡皂苷a、b1相對(duì)含量。

圖2 樣品1～12 以核質(zhì)比825.46 ±0.1Da 提取離子流色譜圖Fig.2 Extracted ion chromatograms (825.46 ±0.1Da)of sample1-12

圖4 為1-12 號(hào)樣品柴胡皂苷d、b2相對(duì)含量。

圖3 樣品1-12 號(hào)柴胡皂苷a、b1相對(duì)含量Fig.3 Relative contents of saikosaponin a，b1of sample 1-12

圖4 樣品1～12 號(hào)柴胡皂苷d、b2相對(duì)含量Fig.4 Relative contents of saikosaponin d，b2of sample 1-12

3 討論

柴胡皂苷紫外吸收很弱或無(wú)紫外吸收，傳統(tǒng)對(duì)柴胡皂苷的測(cè)定選擇紫外檢測(cè)器，使用210 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)［5，6］，但存在吸收較弱和干擾較多的問(wèn)題。本研究選擇飛行時(shí)間質(zhì)譜(Q-Tof)作為檢測(cè)器，解決了以上問(wèn)題。同時(shí)可以給出碎片精確的分子量，有助于對(duì)化合物結(jié)構(gòu)變化的跟蹤和解析。前期實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較正離子、負(fù)離子兩種模式，發(fā)現(xiàn)負(fù)離子模式色譜峰型優(yōu)于正離子模式，雜峰較少，故選擇負(fù)離子模式。而超高效液相系統(tǒng)相比傳統(tǒng)的高效液相系統(tǒng)能顯著的縮短分析時(shí)間，提高分析效率。

本研究表明在酸性條件提取時(shí)，柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 全部轉(zhuǎn)化。常溫時(shí)柴胡皂苷a 轉(zhuǎn)化為柴胡皂苷b1，柴胡皂苷d 轉(zhuǎn)化為b2;加熱時(shí)柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 發(fā)生糖苷鍵酸水解。在中性常溫條件提取時(shí)，柴胡皂苷a、d 比較穩(wěn)定，但以水作溶劑加熱時(shí)，柴胡皂苷d 轉(zhuǎn)化為柴胡皂苷b2。在弱堿性條件下，柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 均比較穩(wěn)定，但四個(gè)樣品仍有極小量的柴胡皂苷b2檢出，但未有柴胡皂苷b1，說(shuō)明柴胡皂苷b2可能是柴胡中天然存在的。

由于水作溶劑加熱提取柴胡時(shí)，柴胡皂苷a、d 不穩(wěn)定，并且隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，柴胡皂苷a、d 會(huì)逐漸水解開(kāi)環(huán)生成柴胡皂苷b1、b2。柴胡制劑多數(shù)以水加熱提取，因此，柴胡制劑質(zhì)量控制的指標(biāo)若仍以柴胡皂苷a、d 作為指標(biāo)是不科學(xué)的。柴胡制劑的質(zhì)量控制建議綜合考慮柴胡皂苷a、d、b1、b2總量來(lái)控制。

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