杜仲葉的化學(xué)成分研究

董 芬，范田運(yùn)，張建新，黃 滔，黃烈軍*，郝小江*

1貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025;2 貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550002

杜仲(Eucommia ulmoides Oilv.)為杜仲科杜仲屬植物，又名木棉、絲連皮、思仲、思仙等，是我國(guó)特有的落葉喬木植物，其干燥樹皮為我國(guó)名貴滋補(bǔ)藥材［1］。杜仲入藥已有2000 多年的歷史，《神農(nóng)本草經(jīng)》和《本草綱目》均將其列為藥之上品，具補(bǔ)中益氣、堅(jiān)筋骨、強(qiáng)志、安胎、久服輕身耐勞之功效?！侗静輩R言》中記載:“凡下焦之慮，非杜仲不補(bǔ);下焦之濕，非杜仲不利。”多年來(lái)，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)杜仲的化學(xué)成分和藥理作用進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)杜仲具有調(diào)節(jié)血壓、降低血糖、調(diào)節(jié)血脂、抗菌、抗病毒、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)等藥理作用，具有延緩衰老、美白養(yǎng)顏、滋陰補(bǔ)腎、強(qiáng)壯筋骨等功效［2-4］。其主要活性成分包括木脂素類、環(huán)烯醚萜類、苯丙素類、多糖類、黃酮類和萜類等［5］。傳統(tǒng)入藥部位是樹皮，但近年來(lái)的研究表明，杜仲傳統(tǒng)非藥用部位如杜仲葉、杜仲雄花和翅果等，含有藥用部位結(jié)構(gòu)相同或相似的生物活性成分，如杜仲葉浸膏對(duì)麻醉貓具有非常明顯的降壓作用［6］，杜仲葉的氯仿提取物對(duì)免疫的抑制活性［7］，以及杜仲葉提取物因其補(bǔ)腎、強(qiáng)筋骨、抗衰老、安胎、調(diào)血脂、抗氧化等方面研究具有較好活性而受到關(guān)注，已在醫(yī)藥和保健品方面都有應(yīng)用［1］。本課題組對(duì)杜仲葉化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，分離得到14 個(gè)化合物，其中化合物6、8、10、12 和13為首次從該屬植物中分離得到。

1 儀器與材料

1H，13C NMR 和2D NMR 圖譜用INOVA-400 核磁共振儀測(cè)定，以TMS 為內(nèi)標(biāo)。EI-MS 質(zhì)譜用安捷倫-5973 型質(zhì)譜儀測(cè)定，ESI-MS 以美國(guó)Thermo Finnigan 公司的Waters 2695 LCQ-MS 聯(lián)用儀測(cè)定。柱層析硅膠(40～80 目、200～300 目、300～400目)、薄層層析硅膠H(60 型)、薄層層析使用硅膠GF254均為青島海洋化工有限公司產(chǎn)品;柱色譜用反相硅膠RP-18 和薄層層析反相硅膠RP-18，RP-8 為Merck 公司產(chǎn)品;MCI(75～150 μm)柱層析材料為Mitsubishi Chemical 公司(日本東京)產(chǎn)品;大孔吸附樹脂D101 為南開大學(xué)樹脂廠產(chǎn)品;葡聚糖凝膠Sephadex LH-20 為Amersham Biosciences 公司(瑞典)產(chǎn)品;所用的有機(jī)溶劑(石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮和甲醇等)均為工業(yè)級(jí)，使用前重蒸處理;核磁共振用氘代試劑均為中科院武漢波譜公司產(chǎn)品;HPLC 所用試劑均為色譜純;其它試劑均為分析純。顯色方法為254 和365 nm 熒光、10%濃硫酸的乙醇溶液，5%磷鉬酸乙醇溶液以及碘蒸氣顯色。

實(shí)驗(yàn)用藥材于2012 年7 月采自貴州省貴陽(yáng)市三江農(nóng)場(chǎng)，并由貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院付志明教授鑒定為杜仲科杜仲屬植物杜仲Eucommia ulmoides Oilv.的干燥葉。

2 提取與分離

取干燥的杜仲葉樣品10 kg，粉碎后用10 倍量65%的乙醇溶液加熱回流提取3 次(提取時(shí)間依次為5、4、3 h)后過(guò)濾，合并濾液，減壓回收乙醇，加入適量蒸餾水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3 次，減壓回收溶劑，得石油醚萃取物650 g，乙酸乙酯萃取物1043 g，正丁醇萃取物220 g。

乙酸乙酯萃取物用硅膠(40～80 目)拌樣。將拌好的樣品采用硅膠(200～300 目)柱層析分離，先用石油醚:乙酸乙酯(1∶0～0∶1)，然后用乙酸乙酯:甲醇(1∶0～0∶1)進(jìn)行梯度洗脫。合并相似部分，共分為6 段，標(biāo)記為Fr.1 (13.2 g)、Fr.2 (20.5 g)、Fr.3 (62.3 g)、Fr.4 (53.3 g)、Fr.5 (502.5 g)和Fr.6 (273.4 g)。Fr.3 經(jīng)多次正相硅膠柱色譜、凝膠柱色譜以及制備液相分離制備得到化合物10(23 mg)、11 (426 mg)、14 (42 mg);Fr.4 經(jīng)MCI、正相、反相硅膠、Sephadex LH-20 等柱色譜分離制備得到化合物1(67 mg)、2 (56 mg)、8 (6 mg)、12 (7 mg)、13 (23 mg);Fr.5 經(jīng)大孔樹脂、正相、反相硅膠、凝膠等柱色譜以及HPLC 法等手段分離制備得化合物3 (1.6 g)、4 (11 mg)、5 (27 mg)、6 (25 mg);正丁醇部位經(jīng)D101 大孔樹脂及ODS 柱色譜分離得到化合物7 (8 mg)、9 (6 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 黃色粉末，C15H10O6，易溶于丙酮;ESI-MS (positive)m/z 309 ［M+Na］+;1H NMR(CD3COCD3，400 MHz)δ:8.15 (2H，dd，J=6.8，2.0 Hz，H-2'，6')，7.01 (2H，dd，J=7.2，2.0 Hz，H-3'，5')，6.54 (1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.28(1H，d，J=2.0 Hz，H-6);13C NMR (CD3COCD3，100 MHz)δ:146.9 (C-2)，136.6 (C-3)，176.5 (C-4)，160.1 (C-5)，99.1 (C-6)，164.9 (C-7)，94.4(C-8)，157.7 (C-9)，104.1 (C-10)，123.2 (C-1')，130.4 (C-2')，116.3 (C-3')，160.1 (C-4')，116.3(C-5')，130.4 (C-6')。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］報(bào)道基本一致，鑒定化合物1 為kaempferol。

化合物2 黃色粉末，C15H10O7，易溶于丙酮;ESI-MS (positive)m/z 303［M+H］+，325［M +Na］+;1H NMR (CD3COCD3，400 MHz)δ:7.66(1H，d，J=1.6 Hz，H-2')，7.54 (1H，dd，J=6.7，1.8 Hz，H-6')，6.88 (1H，d，J=6.7 Hz，H-5')，6.39 (1H，d，J=1.4 Hz，H-8)，6.18 (1H，d，J=1.4 Hz，H-6);13C NMR (CD3COCD3，100 MHz)δ:146.8 (C-2)，135.8 (C-3)，175.8 (C-4)，156.1 (C-5)，98.2 (C-6)，163.9 (C-7)，93.3 (C-8)，160.7(C-9)，103.0 (C-10)，121.9 (C-1')，115.0 (C-2')，145.0 (C-3')，147.7 (C-4')，115.6 (C-5')，119.9(C-6')。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］報(bào)道基本一致，鑒定化合物2 為quercetin。

化合物3 黃色粉末，C21H20O12，易溶于丙酮;ESI-MS (positive)m/z 465［M+H］+，487［M +Na］+;1H NMR (CD3COCD3，400 MHz)δ:7.97(1H，s，H-2')，7.58 (1H，d，J=8.4 Hz，H-5')，6.95 (1H，d，J=8.4 Hz，H-6')，6.51 (1H，s，H-8)，6.28 (1H，s，H-6)，5.28 (1H，d，J=7.2 Hz，H-1'，β-構(gòu) 型);13C NMR (CD3COCD3，100 MHz)δ:156.4 (C-2)，133.3 (C-3)，177.5 (C-4)，161.3 (C-5)，99.0 (C-6)，164.4 (C-7)，93.6 (C-8)，156.2(C-9)，103.9 (C-10)，121.7 (C-1')，115.3 (C-2')，144.9 (C-3')，148.6 (C-4')，116.2 (C-5')，121.2(C-6')，Glu 100.8 (C-1″)，74.1 (C-2″)，77.7 (C-3″)，69.9 (C-4″)，76.5 (C-5″)，60.9 (C-6″)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］報(bào)道基本一致，鑒定化合物3 為hirsutin。

化合物4 黃色粉末，C21H20O11，易溶于二甲亞砜;ESI-MS (positive)m/z 449［M+H］+，471［M+Na］+;1H NMR (DMSO-d6，400 MHz)δ:8.00(2H，d，J=8.8 Hz，H-2'，6')，6.87 (2H，d，J=8.8 Hz，H-3'，5')，6.41 (1H，s，H-8)，6.17 (1H，s，H-6)，5.44 (1H，d，J=7.2 Hz，H-1″，β-構(gòu)型);13C NMR (DMSO-d6，100 MHz)δ:156.5 (C-2)，133.1(C-3)，177.3 (C-4)，161.1 (C-5)，99.0 (C-6)，165.5 (C-7)，93.8 (C-8)，156.1 (C-9)，103.5 (C-10)，120.7 (C-1')，130.8 (C-2')，115.2 (C-3')，160.3 (C-4')，115.2 (C-5')，130.8 (C-6')，Glu 100.9 (C-1″)，74.2 (C-2″)，77.5 (C-3″)，69.9 (C-4″)，76.4 (C-5″)，60.8 (C-6″)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］報(bào)道基本一致，鑒定化合物4 為astragalin。

化合物5 無(wú)定型粉末，C20H22O7，易溶于丙酮;ESI-MS (positive)m/z 397 ［M+Na］+;1H NMR(CD3COCD3，400 MHz) δ:6.74-7.10 (6H，m，arom.H)，4.81 (1H，d，J=4.8 Hz，H-6)，4.65(1H，s，H-2)，4.40-4.48 (1H，m，H-4b)，3.84-4.06(3H，m，H-4a，8)，3.82 (6H，s，2 × OCH3)，2.87-3.06 (1H，m，H-5);13C NMR (DMSO-d6，125 MHz)δ:91.1 (C-1)，87.1 (C-2)，70.3 (C-4)，60.8 (C-5)，85.4 (C-6)，74.7 (C-8)，128.0 (C-1')，112.3(C-2')，146.9 (C-3')，145.9 (C-4')，114.6 (C-5')，120.2 (C-6')，132.4 (C-1″)，110.7 (C-2″)，147.5 (C-3″)，145.9 (C-4″)，115.2 (C-5″)，118.9(C-6″)，56.1 (2 × OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10］報(bào)道基本一致，鑒定化合物5 為(+)-1-hydroxypinoresinol。

化合物6 無(wú)定型粉末，C20H22O7，易溶于丙酮;ESI-MS (positive)m/z 397 ［M+Na］+;1H NMR(CD3COCD3，400 MHz) δ:6.74-7.08 (6H，m，arom.H)，5.13 (1H，d，J=6.0 Hz，H-6)，4.38(1H，s，H-2)，4.21 (1H，d，J=9.2 Hz，H-4b)，3.86(1H，s，H-8b)，3.84 (6H，s，2 ×OCH3)，3.75 (1H，s，H-8a)，3.60 (1H，d，J=9.2 Hz，H-4a)，2.85-2.95 (1H，m，H-5);13C NMR (CD3COCD3，100 MHz)δ:91.6 (C-1)，81.9 (C-2)，68.6 (C-4)，58.5(C-5)，90.1 (C-6)，76.8 (C-8)，129.2 (C-1')，112.2 (C-2')，147.8 (C-3')，147.0 (C-4')，115.1(C-5')，121.1 (C-6')，131.0 (C-1″)，110.0 (C-2″)，148.1 (C-3″)，146.3 (C-4″)，115.5 (C-5″)，118.9 (C-6″)，56.1 (2 ×OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］報(bào)道基本一致，鑒定化合物6 為(+)-1-hydroxy-6-epipinoresinol。

化合物7 無(wú)定型粉末，C26H32O11，易溶于甲醇;ESI-MS (positive)m/z 543 ［M+Na］+;1H NMR (CD3OD，400 MHz)δ:7.14 (1H，d，J=8.4 Hz，H-5)，7.02 (1H，s，H-2)，6.94 (1H，s，H-2')，6.91 (1H，d，J=8.4 Hz，H-6)，6.80 (1H，d，J=9.2 Hz，H-6')，6.76 (1H，d，J=8.0 Hz，H-5')，4.87 (1H，s，H-1″)，4.76 (1H，s，H-7)，4.65 (1H，d，J=3.6 Hz，H-7')，4.23 (2H，m，H-9β，H-9'β)，3.86 (3H，s，OCH3)，3.85 (3H，s，OCH3)，3.82(2H，m，H-9α，H-9'α)，3.71-3.22 (Sugar H)，3.12(2H，m，H-8，8');13C NMR (CD3OD，100 MHz)δ:137.5 (C-1)，111.6 (C-2)，147.3 (C-3)，150.9 (C-4)，117.9 (C-5)，119.8 (C-6)，87.1 (C-7)，55.3(C-8)，72.7 (C-9)，133.7 (C-1')，110.9 (C-2')，147.5 (C-3')，149.1 (C-4')，116.1 (C-5')，120.0(C-6')，87.5 (C-7')，55.5 (C-8')，72.7 (C-9')，102.8 (C-1″)，74.9 (C-2″)，77.8 (C-3″)，71.3 (C-4″)，78.2 (C-5″)，62.5 (C-6″)，56.7 (OCH3)，56.4(OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［12］報(bào)道基本一致，鑒定化合物7 為pinoresinol-4-O-glucoside。

化合物8 無(wú)色針狀，C15H12O5，易溶于丙酮;ESI-MS (positive)m/z 273［M+H］+，295［M +Na］+;1H NMR (CD3COCD3，400 MHz)δ:7.37(2H，d，J=8.8 Hz，H-2'，6')，6.80 (2H，d，J=8.8 Hz，H-3'，5')，6.30 (1H，s，H-5)，6.28 (1H，d，J=2.0 Hz，H-7)，5.55 (1H，dd，J=12.0，3.2 Hz，H-3)，3.28 (1H，dd，J=16.4，12.0 Hz，H-4a)，3.05(1H，dd，J=12.0，3.2 Hz，H-4b);13C NMR(CD3COCD3，100 MHz)δ:170.7 (C-1)，81.1 (C-3)，35.3 (C-4)，143.3 (C-4a)，107.4 (C-5)，165.3(C-6)，101.9 (C-7)，165.3 (C-8)，101.8 (C-8a)，130.5 (C-1')，128.8 (C-2')，116.1 (C-3')，158.6(C-4')，116.1 (C-5')，128.8 (C-6')。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［13］報(bào)道基本一致，鑒定化合物8 為thunberginol C。

化合物9 白色粉末，C27H34O12，易溶于甲醇;ESI-MS (positive)m/z 551［M+H］+，573［M +Na］+;1H NMR (CD3OD，400 MHz)δ:6.61-6.82(5H，m，arom.H)，3.85 (9H，s，3 ×OCH3)，3.55～3.81 (4H，m，H-4，8);13C NMR (CD3OD，100 MHz)δ:55.3 (C-1)，87.6 (C-2)，72.7 (C-4)，55.5 (C-5)，87.4 (C-6)，72.9 (C-8)，135.5 (C-1')，105.3(C-2')，154.4 (C-3')，139.6 (C-4')，154.4 (C-5')，104.8 (C-6')，133.7 (C-1″)，110.9 (C-2″)，149.3 (C-3″)，149.1 (C-4″)，116.1 (C-5″)，120.0(C-6″)，Glu 104.4 (C-1')，75.7 (C-2')，77.8 (C-3')，71.3 (C-4')，78.3 (C-5')，62.5 (C-6')，56.8(OCH3)，56.4 (OCH3)，55.8 (OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［14］報(bào)道基本一致，鑒定化合物9 為(+)-medioresinol 4'-O-β-D-glucopyranoside。

化合物10 白色粉末，C9H6O3，易溶于丙酮;ESI-MS (positive)m/z 185 ［M+Na］+;1H NMR(CD3COCD3，400 MHz)δ:7.87 (1H，d，J=9.6 Hz，H-4)，7.52 (1H，d，J=8.4 Hz，H-5)，6.85(1H，dd，J=8.4，2.4 Hz，H-6)，6.17 (1H，d，J=9.2 Hz，H-3);13C NMR (CD3COCD3，100 MHz)δ:161.0 (C-2)，112.8 (C-3)，144.7 (C-4)，130.4 (C-5)，113.7 (C-6)，161.9 (C-7)，103.2 (C-8)，156.9(C-9)，112.8 (C-10)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［15］報(bào)道基本一致，鑒定化合物10 為7-hydroxycoumarin。

化合物11 白色粉末，C17H20O9，易溶于丙酮;ESI-MS (positive)m/z 369［M+H］+，391［M +Na］+;1H NMR (CD3COCD3，400 MHz)δ:7.54(1H，d，J=16.0 Hz，H-3')，7.16 (1H，d，J=1.6 Hz，H-5')，7.04 (1H，dd，J=8.0，1.6 Hz，H-9')，6.87 (1H，d，J=8.0 Hz，H-8')，6.25 (1H，d，J=16.0 Hz，H-2')，5.33 (1H，m，H-3)，4.17 (1H，m，H-5)，3.75 (1H，t，J=8.4，2.8 Hz，H-4)，3.73(3H，s，OCH3)，2.05-2.30 (2H，m，H-2)，5.33 (1H，m，H-3);13C NMR (CD3COCD3，100 MHz)δ:75.9(C-1)，37.9 (C-2)，72.9 (C-3)，71.5 (C-4)，71.5(C-5)，37.9 (C-6)，174.5 (C-7)，52.6 (OCH3)，166.9 (C-1')，115.1 (C-2')，145.9 (C-3')，127.5(C-4')，115.7 (C-5')，146.4 (C-6')，148.9 (C-7')，116.4 (C-8')，122.6 (C-9')。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［16］報(bào)道基本一致，鑒定化合物11 為methylchlorogenate。

化合物12 無(wú)色油狀，C18H32O2，易溶于氯仿;ESI-MS (positive)m/z 303 ［M+Na］+;1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ:5.36-5.33 (4H，m，-CH=CH-)，2.77 (2H，m，J=6.4 Hz，H-11)，2.35 (2H，t，J=7.6 Hz，H-2)，2.05 (2H，m，J=6.4 Hz，H-14)，2.04 (2H，m，J=7.2 Hz，H-8)，1.64 (2H，m，J=7.2 Hz，H-3)，1.38-1.30 (6H，m，3 × CH2，H-15-17)，1.30-1.22 (8H，m，4 × CH2，H-4-7)，0.89(3H，m，J=6.8 Hz，H-18);13C NMR (CDCl3，100 MHz)δ:180.1 (C-1)，34.0 (C-2)，24.6 (C-3)，29.2(C-4，5)，29.5 (C-6)29.3(C-7)，27.1(C-8)，129.7 (C-9)，129.9 (C-10)，25.6 (C-11)，130.2(C-12)，127.8 (C-13)，27.2 (C-14)，31.9 (C-15)，31.9 (C-16)，31.9 (C-17)，14.0 (C-18)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［17］報(bào)道基本一致，鑒定化合物12 為leinoleic acid。

化合物13 白色粉末，C4H6O4，易溶于甲醇;ESI-MS (positive)m/z 141 ［M+Na］+;1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ:2.50 (4H，s，H-2，3);13C NMR (CD3OD，100 MHz)δ:176.3 (C-1，4)，29.7(C-2，3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［18］報(bào)道基本一致，鑒定化合物13 為butanedioic acid。

化合物14 白色針狀結(jié)晶(氯仿)，C29H50O，易溶于氯仿;ESI-MS (positive)m/z 437［M +Na］+;10%硫酸乙醇溶液顯紫色，5%磷鉬酸乙醇溶液顯藍(lán)色。將化合物與β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品在三個(gè)溶劑系統(tǒng)下進(jìn)行共薄層檢查，結(jié)果顯示兩者具有相同的顯色行為及Rf值一致，可以確定化合物14 為β-sitosterol。

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