LC 基因在細(xì)胞自噬過程中的表達(dá)研究

倪志華+張玉明+鄧傳懷+等

摘要：自噬是細(xì)胞為維持自身代謝發(fā)生的胞質(zhì)組分降解的動態(tài)過程。自噬不僅是細(xì)胞在饑餓環(huán)境下的一種適應(yīng)性反應(yīng)，而且對于組織和細(xì)胞維持動態(tài)平衡十分重要。細(xì)胞自噬出現(xiàn)問題往往會導(dǎo)致多種疾病。自噬相關(guān)基因被命名為Atg（Autophagy-related gene），LC3（Microtubule-associated protein 1 light chain 3）是哺乳動物中了解的最透徹的一個Atg同源蛋白。LC3蛋白在細(xì)胞中存在兩種剪切形式，即LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ， 定位于自噬體膜的LC3-Ⅱ是自噬的標(biāo)志性分子。詳細(xì)論述自噬過程和LC3在自噬過程中的表達(dá)修飾過程，并進(jìn)一步討論自噬在神經(jīng)退行性疾病和微生物感染中的生物學(xué)功能。

關(guān)鍵詞：自噬；LC3；神經(jīng)退行性疾病；免疫應(yīng)答

中圖分類號：Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）20-4932-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.20.002

Expression of LC3 Gene in Cell Autophagy

NI Zhi-hua1，2，ZHANG Yu-ming1，DENG Chuan-huai1，ZHAO Ze1，ZHANG Rui-ying1，ZHOU Yan-fen1，2

（1.College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002，Hebei，China；

2.Research Center of Bioengineering of Hebei Province，Baoding 071002，Hebei，China）

Abstract：Autophagy is a dynamic process for degradation of cytosolic components in cell， aiming to maintain cells metabolic balance. Autophagy is an adaptive reaction of nutrient deficiency. Moreover， autophagy is very important for tissue and cell to keep dynamic metabolic balance. Disturbance of autophagy could trigger various diseases. Usually， autophagy-related gene is named as Atg. Microtuble associated protein lightchain 3 （LC3）， a mammalian homolog of yeast Atg8， has been extensively reported. In cell，LC3 proteins are presented in two forms （LC3-Ⅰand LC3-Ⅱ）. LC3-Ⅱ， locating on autophosome membrane， is usually used as a specific marker to monitor autophagy. In this review， the process of autophagy and the function of LC3 were involved. Moreover， the biological function of autophagy in neurodegenerative disease and immune response were also discussed intensively.

Key words：autophagy；LC3；neurodegenerative disease；immune response

自噬（Autophagy）一詞源于希臘詞語“Self”和“Eating”，指細(xì)胞為了維持自身的代謝平衡而自我犧牲的一種重要的細(xì)胞功能[1]。1993年，Tsukada等[2]發(fā)現(xiàn)了釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的細(xì)胞自噬現(xiàn)象，并對自噬相關(guān)的基因突變體以Atg（Autophagy-related gene）進(jìn)行了命名和性質(zhì)研究。從酵母到哺乳動物，細(xì)胞自噬過程是高度保守的。目前，哺乳動物的多種組織和器官中都觀測到了自噬的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，自噬途徑對細(xì)胞清除功能缺陷的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，維持細(xì)胞的生存、分化，組織的發(fā)育十分重要[3]。如果自噬途徑受損或自噬相關(guān)基因的改變會導(dǎo)致一系列的疾病，例如神經(jīng)退行性疾病及各種癌癥[4]。本文將就自噬過程以及哺乳動物細(xì)胞中參與自噬的標(biāo)志性分子LC3 （Microtubule-associated protein 1 light chain 3）在自噬過程中的表達(dá)修飾概述，并闡述自噬在神經(jīng)退行性疾病和免疫應(yīng)答反應(yīng)中的生物學(xué)功能。

1 自噬過程

細(xì)胞自噬包括三種主要類型：大自噬（Macroautophagy）、小自噬（Microautophagy）和分子伴侶介導(dǎo)的自噬（Chaperone mediated autophagy，CMA），此外還有一些器官特異性的自噬途徑[5]。其中大自噬（以后簡稱為自噬，Autophagy）是細(xì)胞內(nèi)自身發(fā)生的大規(guī)模的降解過程，包括細(xì)胞質(zhì)組分的降解和細(xì)胞器成分的分解。待降解的細(xì)胞組分會被稱為自噬體的雙層膜結(jié)構(gòu)所包裹，然后被運(yùn)送至溶酶體中進(jìn)行降解。小自噬是不需任何載體的協(xié)助，溶酶體直接攝取細(xì)胞組分并進(jìn)行降解的過程[6]。分子伴侶介導(dǎo)的自噬有別于大自噬和小自噬的是，待降解的底物蛋白必須存在一段五肽序列，熱休克蛋白HSP70與底物蛋白結(jié)合形成底物-分子伴侶復(fù)合物，溶酶體CMA受體識別該復(fù)合物，并將底物去折疊后轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體中進(jìn)行消化[7]。

自噬是從酵母到哺乳動物細(xì)胞都普遍存在的保守的代謝途徑。一般認(rèn)為自噬的動態(tài)過程分成5個緊密相連的步驟：歐米伽體（Omegasome）的形成，自噬體膜的形成與延伸，自噬體的形成，自噬體—溶酶體的融合，自噬體內(nèi)物質(zhì)被溶酶體水解酶降解等過程[8]。

細(xì)胞自噬過程大多可在10～15 min內(nèi)完成，如圖1所示。首先是mTOR（mammalian target of rapamycin）激酶信號途徑激活細(xì)胞內(nèi)的泛素樣激酶1（Ubiquitin like kinase 1，ULK）-Atg13-FIP200（Focal adhesion kinase family interacting protein of 200 kD）-Atg101復(fù)合物，誘導(dǎo)自噬的起始。隨著自噬的開始，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過與DFCP1（Double FYVE-containing protein 1）結(jié)合形成歐米伽體，同時，Atg13招募Atg14-Vps34（PI3KC3的激酶亞基）-beclin1蛋白，促進(jìn)自噬體膜的形成并為自噬體的形成貯備原料。歐米伽體與Atg5-Atg12-Atg16L復(fù)合物結(jié)合形成孤立的自噬膜結(jié)構(gòu)，該膜結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步延伸過程中細(xì)胞質(zhì)組分包括線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被包裹起來。隨著自噬體膜結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步延伸，Atg5-Atg12-Atg16L從膜上解離，膜結(jié)構(gòu)發(fā)生閉合，形成自噬體，LC3-II在自噬體的形成過程中定位于封閉的自噬體膜結(jié)構(gòu)上。最后溶酶體與自噬體發(fā)生融合，形成自噬體-溶酶體復(fù)合物。在自噬體-溶酶體復(fù)合物內(nèi)，被包裹的細(xì)胞質(zhì)組分被溶酶體中的水解酶所降解，其中LC3-II也隨之降解。降解結(jié)束后，從自噬體-溶酶體復(fù)合物變成長形結(jié)構(gòu)的原溶酶體，原溶酶體在細(xì)胞中會再次形成溶酶體。

由此可見，在哺乳動物細(xì)胞中，核心的Atg蛋白分成5個亞組：ULK1蛋白激酶復(fù)合物[9]、Vps34-beclin1 III型PI3-激酶復(fù)合物、Atg9-WIPI1（WD-repeat domain protein interacting with phosphoinositides）復(fù)合物[10]、Atg12結(jié)合系統(tǒng)[11]以及LC3結(jié)合系統(tǒng)[12]。對于自噬的發(fā)生，順序進(jìn)入的蛋白激酶復(fù)合物、磷酸化酶、脂類以及ATP依賴的結(jié)合系統(tǒng)復(fù)合物是必需的，缺少任何一個組分均會導(dǎo)致自噬受損。自噬啟動之初，PI3激酶和mTOR激酶是必需的[13]，Vps34-beclin1 III型PI3激酶復(fù)合物在自噬中也是必不可少的[14]，此外，自噬過程中還有兩個泛素化系統(tǒng)Atg12結(jié)合系統(tǒng)和LC3結(jié)合系統(tǒng)對自噬體的形成十分重要。

自噬過程主要是由mTOR信號通路調(diào)節(jié)。在生理條件下，mTOR途徑通過抑制泛素樣激酶ULK的活性來抑制自噬的發(fā)生[6]。在饑餓狀態(tài)下，mTOR的活性被抑制，ULK被激活從而誘導(dǎo)細(xì)胞啟動細(xì)胞自噬。因此，mTOR可激活饑餓誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬細(xì)胞。

2 LC3在自噬過程中的表達(dá)

自噬相關(guān)基因（Autophagy-related genes）對于細(xì)胞及生物個體十分重要，自噬相關(guān)基因的缺失不僅會導(dǎo)致酵母細(xì)胞和黏細(xì)菌細(xì)胞的快速死亡，而且對于剛脫離母體的新生小鼠也是致命的。缺失自噬相關(guān)基因的小鼠表現(xiàn)為神經(jīng)細(xì)胞和肝細(xì)胞蛋白質(zhì)的積累[15]。

大多數(shù)自噬相關(guān)基因在酵母、真菌、多細(xì)胞動物和綠色植物以及幾種原生動物中都相對保守。自噬相關(guān)基因Atg8（Autophagy-related 8 genes，Atg8s）的研究起源于酵母。到目前為止在哺乳動物中至少發(fā)現(xiàn)了4個Atg8的同源物：LC3、GABARAP、GATE-16、Atg8L[16]。其中，LC3是了解的最透徹的一個Atg8同源蛋白，目前已知人類有4個編碼LC3的基因（MAP1LC3A、MAP1LC3B、MAP1LC3B2、MAP1LC3C）[17]，分別定位于染色體20q11.22、16q24.2、12q24.22和1q43。蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，LC3和其他Atg8家族的蛋白結(jié)構(gòu)類似，如圖2所示[18]，因其有與泛素十分相似的結(jié)構(gòu)，被稱為泛素樣蛋白。作為自噬形成中重要的一個組分，LC3結(jié)合系統(tǒng)的目的是進(jìn)行磷脂化（PE），因此LC3連接系統(tǒng)也被稱為LC3-脂化系統(tǒng)。LC3蛋白在細(xì)胞中存在兩種剪切形式LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ，LC3-Ⅰ定位于細(xì)胞質(zhì)，LC3-Ⅱ定位于自噬體膜。

細(xì)胞營養(yǎng)缺乏時，LC3基因的轉(zhuǎn)錄被激活，從而翻譯出足夠的LC3前體。在自噬體膜形成過程中，LC3前體被Atg4B剪切形成具有C-末端甘氨酸的胞質(zhì)形式——LC3-Ⅰ。LC3-Ⅰ的C末端甘氨酸幫助催化其與Atg7和Atg3活性位點處的半胱氨酸形成硫酯鍵，并且促進(jìn)LC3-Ⅰ與磷脂以酰胺鍵進(jìn)行結(jié)合形成LC3-PE，即膜結(jié)合形式的LC3-Ⅱ[19]。整個反應(yīng)過程由Atg7和Atg3介導(dǎo)并且有泛素化折疊。隨著自噬體的形成，LC3-Ⅱ逐漸聚集并定位于自噬體膜上。在此過程中LC3-Ⅱ的表達(dá)量逐漸增加[20]。之后，自噬體與溶酶體融合，自噬溶酶體降解，自噬體膜表面的LC3-Ⅱ被Atg4B脂化重新變成LC3-Ⅰ，以完成LC3-Ⅰ在自噬體形成過程中的再次利用[21]；自噬溶酶體內(nèi)的LC3-Ⅱ被溶酶體的水解酶降解。LC3-Ⅰ修飾成LC3-II 的過程不是孤立的，此過程會受到很多因素的影響。在缺乏Atg12-Atg5的結(jié)合時，修飾過程無法進(jìn)行[22]。此外，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)了兩個新的自噬調(diào)節(jié)因子Nix（BCL2-related protein） 和 DOR （Diabetes- and obesity-regulated gene），能夠與LC3蛋白結(jié)合參與自噬過程中靶蛋白的選擇或者自噬體的形成與聚集[23，24]。

LC3-Ⅱ?qū)τ谧允审w的形成十分必要，有研究表明去除LC3-Ⅱ?qū)⑿纬梢幌盗胁婚]合的自噬體結(jié)構(gòu)[25]。因LC3-Ⅱ的數(shù)量和自噬體的數(shù)量存在一一對應(yīng)的關(guān)系，LC3-Ⅱ被普遍認(rèn)為是哺乳動物自噬體的標(biāo)記物。試驗中常常通過Western blotting、免疫熒光和GFP-LC3法檢測LC3用以衡量細(xì)胞或組織的自噬行為[26]。

3 自噬的生物學(xué)功能

自噬的功能首先是細(xì)胞在饑餓環(huán)境下的一種適應(yīng)性反應(yīng)[27]。細(xì)胞處于營養(yǎng)缺乏的環(huán)境時，會啟動自噬來重復(fù)利用自身的材料產(chǎn)生游離的氨基酸以應(yīng)對饑餓脅迫[28]。自噬在細(xì)胞的發(fā)育和分化過程中起著十分重要的作用[29]。在細(xì)胞發(fā)育、變態(tài)和細(xì)胞分化過程中細(xì)胞重塑的動態(tài)過程需要細(xì)胞成分的大規(guī)模降解。研究證明在米曲霉[30]乃至人的角質(zhì)細(xì)胞[31]、皮膚和毛發(fā)的分化[32]、心肌細(xì)胞分化和心臟發(fā)育[33]、T細(xì)胞的發(fā)育分化過程中[34]都需要Atg基因的參與。

此外，研究發(fā)現(xiàn)自噬過程對于組織和細(xì)胞維持動態(tài)平衡十分重要。細(xì)胞自噬與多種疾病相關(guān)，例如神經(jīng)退行性疾病、病原微生物所引發(fā)的細(xì)胞免疫應(yīng)答、心肌病、腫瘤、糖尿病、脂肪肝及克羅恩病等[35-37]。

神經(jīng)退行性疾病包括阿爾茲海默癥（Alzheimers diseases，AD）、帕金森病（Parkinsons disease，PD）、亨廷頓舞蹈癥（Huntingtons disease，HD）等[38]。自噬異常在這些疾病的病理學(xué)和發(fā)病過程中起著十分重要的作用。神經(jīng)元細(xì)胞是高度分化的極性細(xì)胞，其活力和功能的維持除了需要有賴于神經(jīng)營養(yǎng)因子的存在，還必須活躍的膜運(yùn)輸在細(xì)胞體與樹突和軸突之間進(jìn)行連接。神經(jīng)元細(xì)胞的高度極化特性，也使其對細(xì)胞質(zhì)組分或細(xì)胞膜的聚集和積累更加敏感，而要清除錯誤折疊的蛋白質(zhì)其中最重要的途徑之一就是自噬-溶酶體途徑。該途徑可以在細(xì)胞內(nèi)對胞漿的長壽蛋白和細(xì)胞器進(jìn)行降解[39]。因此，在神經(jīng)系統(tǒng)中，自噬的主要作用是維持神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)蛋白的合成與降解水平的平衡，對于諸如神經(jīng)細(xì)胞這樣的長壽細(xì)胞，自噬功能和自噬水平的穩(wěn)定尤其重要。當(dāng)自噬功能異常時往往會導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病[40，41]。

此外，自噬的管家功能是與先天性和獲得性免疫相關(guān)[42]，使細(xì)胞遠(yuǎn)離不必要的或者可能有毒的環(huán)境及作為監(jiān)控體系控制病原體入侵自噬具有胞內(nèi)抗病毒作用。病原微生物感染可以通過不同的途徑影響自噬。一方面自噬作為防御機(jī)制參與先天性免疫或者獲得性免疫。當(dāng)病原微生物侵入細(xì)胞后，即被自噬識別，然后被自噬體吞噬，最終被自噬溶酶體降解。另一方面，有些病原菌也進(jìn)化出了不同的策略來破壞自噬途徑，從而逃脫了溶酶體的降解并利用該途徑所產(chǎn)生的氨基酸進(jìn)行菌體代謝。這時自噬的功能就變成了清除感染的細(xì)胞[43]。自噬清除病原體的能力與病原體自身的性質(zhì)有關(guān)。目前研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞感染結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）或者A群鏈球菌（Group A streptococcus）時，自噬不僅承擔(dān)清除入侵者的任務(wù)還在有2型MHC存在時起著遞呈抗原的作用。在病毒侵染時，自噬體以病毒組分作為靶標(biāo)，啟動溶酶體降解系統(tǒng)降解病毒粒子和病毒的主要組分，在病毒感染的免疫應(yīng)答系統(tǒng)啟動過程中發(fā)揮重要作用[44]?？傊_測定自噬活性對于研究感染后的免疫應(yīng)答十分重要，而且調(diào)節(jié)自噬活性也將成為抗感染治療的一種途徑。

4 展望

自噬作為維持自身平衡的重要細(xì)胞代謝過程，擔(dān)負(fù)著重復(fù)利用細(xì)胞質(zhì)中游離物質(zhì)和清除受損細(xì)胞器和有毒分子的作用。LC3的結(jié)構(gòu)和在細(xì)胞自噬中的作用已經(jīng)研究清楚，LC3檢測已經(jīng)成為自噬體檢測的一種重要手段。

研究表明，除了應(yīng)對營養(yǎng)缺乏所致的細(xì)胞饑餓，自噬還可以清除細(xì)胞代謝過程中產(chǎn)生的錯誤折疊蛋白，以維持細(xì)胞正常的生理功能，并且在細(xì)胞感染微生物后積極地參與細(xì)胞免疫。自噬功能的缺乏或異?？赡苁巧窠?jīng)退行性疾病的主要原因?？傊?，研究自噬會對相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理和治療起到重要的推動作用。

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