基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及體外實驗方法探究和驗證理中丸治療慢性萎縮性胃炎的作用機制

[摘要]"目的"運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及體外實驗方法探究并驗證理中丸治療慢性萎縮性胃炎（chronic"atrophic"gastritis，CAG）的分子機制。方法"借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺篩選理中丸的有效活性成分，并通過PubChem、Swiss"Target"Prediction數(shù)據(jù)庫獲取理中丸的相關(guān)作用靶點。借助GeneCards、OMIM和DisGeNET數(shù)據(jù)庫獲取CAG的相關(guān)靶點。利用Venn工具獲得理中丸治療CAG的藥物-疾病共同靶點，借助STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建理中丸治療CAG的藥物-疾病共同靶點互作網(wǎng)絡(luò)。應(yīng)用Cytoscape軟件構(gòu)建理中丸治療CAG的“藥物-疾病-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)，對理中丸治療CAG的藥物-疾病共同靶點進行基因功能和通路富集分析。運用Moe軟件對藥物活性成分與關(guān)鍵靶點進行分子對接和結(jié)合能力預(yù)測。構(gòu)建脾胃虛寒型CAG大鼠模型，觀察理中丸對大鼠胃組織形態(tài)改變、胃黏膜細胞凋亡及CAG關(guān)鍵靶點信使RNA（messenger"RNA，mRNA）和蛋白水平表達的影響。結(jié)果"共篩選出理中丸有效活性成分57種，包括花生四烯酸、人參皂苷Rg5、五味子酯乙、阿樸天仙子堿和人參皂苷Rh2等；獲得理中丸相關(guān)作用靶點869個。獲得理中丸與CAG的共同靶點47個，其中關(guān)鍵靶點包括腫瘤蛋白P53（tumor"protein"P53，TP53）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor"necrosis"factor-α，TNF-α）、表皮生長因子受體（epidermal"growth"factor"receptor，EGFR）、B細胞淋巴瘤2（B-cell"lymphoma"2，Bcl-2）等。通路富集分析共獲得135條通路，主要包括腫瘤的發(fā)病途徑、腫瘤中的蛋白聚糖、膽堿能突觸、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通路等。分子對接結(jié)果顯示，TP53、IL-6、TNF-α、EGFR、Bcl-2與五味子酯乙和人參皂苷Rh2有較好的結(jié)合活性。體外實驗發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠的脾胃虛寒證候評分顯著高于空白組；理中丸可改善CAG大鼠的病理變化，顯著減少胃黏膜細胞凋亡，降低胃黏膜組織中TP53、IL-6、TNF-α、EGFR、Bcl-2"mRNA和蛋白表達水平。結(jié)論"理中丸治療脾胃虛寒型CAG的作用可能與其調(diào)控TP53、IL-6、TNF-α、EGFR、Bcl-2的表達、減輕炎癥反應(yīng)、減少胃黏膜細胞凋亡有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]"理中丸；慢性萎縮性胃炎；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；體外實驗；細胞凋亡

[中圖分類號]"R285.5""""""[文獻標識碼]"A""""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.34.015

Explore"and"verify"the"mechanism"of"action"of"Lizhong"Wan"in"treatment"of"chronic"atrophic"gastritis"based"on"network"pharmacology"and"in"vitro"experimental"method

WANG"Yan1，"ZHANG"Zhanhao2，"WANG"Jiahui2，"ZHENG"Yang2，"ZHAO"Tiejian2

1.Department"of"Spleen"and"Stomach"Diseases，"Hangzhou"Hospital"of"Traditional"Chinese"Medicine，"Hangzhou"310007，"Zhejiang，"China;"2.School"of"Basic"Medicine，"Guangxi"University"of"Chinese"Medicine，"Nanning"530200，"Guangxi，"China

[Abstract]"Objective"To"investigate"the"molecular"mechanism"of"Lizhong"Wan"in"treatment"of"chronic"atrophic"gastritis"（CAG）"using"network"pharmacology"and"in"vitro"experimental"method."Methods"The"active"ingredients"of"Lizhong"Wan"were"screened"by"Traditional"Chinese"Medicine"Systems"Pharmacology"Database"and"Analysis"Platform，"and"the"related"targets"were"obtained"from"PubChem"andnbsp;Swiss"Target"Prediction"databases."The"CAG-related"targets"were"obtained"from"GeneCards，"OMIM"and"DisGeNET"databases."The"drug-disease"common"targets"of"Lizhong"Wan"and"CAG"were"obtained"by"Venn"tool."The"interaction"network"of"common"targets"of"Lizhong"Wan"and"CAG"was"constructed"with"the"help"of"STRING"database，"and"the"drug-disease-target-pathway"network"was"constructed"with"the"help"of"Cytoscape"software."Gene"function"and"pathway"enrichment"analyses"were"performed"on"the"common"targets."The"molecular"docking"and"binding"ability"of"the"active"ingredients"of"the"drug"and"the"key"targets"were"predicted"by"using"Moe"software."The"mice"of"spleen"and"stomach"deficiency"cold"syndrome"CAG"was"established."The"effects"of"Lizhong"Wan"on"the"morphological"changes"of"gastric"tissue，"apoptosis"of"gastric"mucosa"cells"and"the"expression"of"messenger"RNA"（mRNA）"and"protein"of"the"key"target"of"CAG"were"observed."Results"A"total"of"57"active"ingredients"of"Lizhong"Wan"were"screened，"including"arachidonic"acid，"ginsenoside"Rg5，"gomisin"B，"aposiopolamine"and"ginsenoside"Rh2."869"active"targets"of"Lizhong"Wan"were"obtained."CAG"and"Lizhong"Wan"had"47"common"targets，"the"key"common"targets"including"tumor"protein"P53"（TP53），"interleukin-6"（IL-6），"tumor"necrosis"factor-α"（TNF-α），"epidermal"growth"factor"receptor"（EGFR），"B-cell"lymphoma"2"（Bcl-2），"etc.."A"total"of"135"pathways"were"obtained"by"enrichment"analysis，"mainly"including"tumor"pathogenesis，"proteoglycan"in"tumor，"cholinergic"synapse，"phosphoinositide"3-kinase/protein"kinase"B"signaling"pathway，"etc.."Molecular"docking"results"showed"that"TP53，"IL-6，"TNF-α，"EGFR，"Bcl-2"had"good"binding"activity"with"gomisin"B"and"ginsenoside"Rh2."Meanwhile，"in"vitro"experimental"found"that"the"scores"of"spleen"and"stomach"deficiency"cold"syndrome"in"model"group"were"significantly"higher"than"those"in"blank"group."Lizhong"Wan"could"improve"the"pathological"changes"of"CAG"mice，"could"significantly"reduce"the"apoptosis"of"gastric"mucosa"cells，"could"significantly"reduce"the"expression"of"mRNA"and"protein"of"TP53，"IL-6，"TNF-α，"EGFR，"Bcl-2."Conclusion"The"effect"of"Lizhong"Wan"in"treating"CAG"with"spleen"and"stomach"deficiency"cold"syndrome"may"be"related"to"regulating"the"expression"of"TP53，"IL-6，"TNF-α，"EGFR"and"Bcl-2，"alleviating"inflammation"and"reducing"apoptosis"of"gastric"mucosa"cells.

[Key"words]"Lizhong"Wan;"Chronic"atrophic"gastritis;"Network"pharmacology;"In"vitro"experimental;"Cell"apoptosis

慢性萎縮性胃炎（chronic"atrophic"gastritis，CAG）是以慢性進行性炎癥為病理基礎(chǔ)，胃腺體逐漸萎縮消失，伴或不伴假幽門腺化生、腸上皮化生、異型增生的一種常見消化系統(tǒng)疾病[1]。CAG的發(fā)病人群以中老年人居多，其癌變率為3%～8%；但近年來CAG在年輕人中的發(fā)病率逐年升高[2-4]。目前，臨床上沒有針對CAG的特效治療藥物?？刂坡匝装Y、調(diào)節(jié)腺體形態(tài)是CAG研究的重點和熱點問題之一。中醫(yī)藥治療CAG的療效顯著，其可通過逆轉(zhuǎn)胃黏膜萎縮進程而減少癌變的發(fā)生[5]。中醫(yī)學(xué)理論將CAG歸于“胃脘痛”“嘈雜”等范疇，CAG與稟賦不足、外感邪氣、勞逸失調(diào)有關(guān)，以脾胃虛寒型最為常見。理中丸以干姜為君藥，大辛大熱、溫暖脾胃；人參為臣藥，益氣健脾、補虛助陽；白術(shù)為佐藥，甘溫苦燥、以助化生；炙甘草與諸藥等量，以助補虛助陽、緩急止痛，主要用于脾胃虛寒、陽虛失血、中陽不足等證，對脾虛型腹瀉具有確切療效。同時，理中丸可調(diào)控胃黏膜炎癥因子表達，介導(dǎo)胃腸激素調(diào)節(jié)胃腸運動，對多種消化系統(tǒng)疾病具有治療效果[6-8]。本文擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實驗驗證方法探討理中丸治療CAG的分子機制。

1""資料與方法

1.1""理中丸活性成分及其靶點的篩選

借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（Traditional"Chinese"Medicine"Systems"Pharmacology"Database"and"Analysis"Platform，TCMSP）篩選理中丸的有效活性成分。篩選條件為口服生物利用度（oral"bioavailability，OB）和類藥性（drug"likeness，DL），根據(jù)OB≥30%和DL≥0.18篩選人參、白術(shù)和干姜；甘草以O(shè)B≥60%和DL≥0.18為條件篩選。將得到的有效活性成分通過PubChem和Swiss"Target"Prediction數(shù)據(jù)庫獲得其靶點信息。

1.2""CAG對應(yīng)疾病靶點基因的篩選

以“chronic"atrophic"gastritis”為關(guān)鍵詞，在GeneCards、OMIM、DisGeNET數(shù)據(jù)庫中檢索CAG相關(guān)靶點，對得到的相關(guān)靶點去除重復(fù)后合并，運用Venn工具得到理中丸治療CAG的關(guān)鍵靶點。

1.3""關(guān)鍵靶點蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在STRING數(shù)據(jù)庫中導(dǎo)入理中丸治療CAG的關(guān)鍵靶點，篩選物種為人，構(gòu)建理中丸治療CAG關(guān)鍵靶點蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（proteinprotein"interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。

1.4""基因功能和通路富集分析

使用DAVID數(shù)據(jù)庫設(shè)置“homo"sapiens”和“Plt;0.05”為篩選條件，進行基因本體論（gene"ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto"Encyclopedia"of"Genes"and"Genomes，KEGG）通路富集分析，運用微生信軟件進行結(jié)果可視化。

1.5""“藥物-疾病-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將理中丸的有效活性成分、交集基因、CAG相關(guān)靶點和KEGG通路富集分析中P值按照由小到大順序排列的前20條通路輸入Cytoscape"3.9.1中構(gòu)建“靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)，同時借助Network"Analyzer插件計算網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)。

1.6""分子對接分析

借助PDB數(shù)據(jù)庫獲取靶點結(jié)構(gòu)，通過PubChem數(shù)據(jù)庫獲取理中丸有效活性成分的二維分子結(jié)構(gòu)。通過Moe軟件對蛋白結(jié)構(gòu)進行處理，從而完成分子對接和可視化。

1.7""體外實驗驗證

1.7.1""動物與試劑""清潔級SD大鼠30只，周齡6～8周，體質(zhì)量200～220ｇ，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[許可證號：SYXK（桂）2019-0001]。理中丸[批準文號：國藥準字Z44023078，生產(chǎn)單位：國藥集團馮了性（佛山）藥業(yè)有限公司，規(guī)格：每丸重9g]。原位末端轉(zhuǎn)移酶標記（terminal-"deoxynucleotidyl"transferase-mediated"dUTP-biotin"nick"end"labeling，TUNEL）法試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司。腫瘤蛋白P53（tumor"protein"P53，TP53）抗體購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）抗體購于Abcam公司，腫瘤壞死因子-α（tumor"necrosis"factor-α，TNF-α）抗體購于Abcam公司，表皮生長因子受體（epidermal"growth"factor"receptor，EGFR）抗體購于CST公司，B細胞淋巴瘤2（B-cell"lymphoma"2，Bcl-2）抗體購于Abcam公司。

1.7.2""動物CAG模型制備、分組及給藥""大鼠隨機分為空白組、模型組和理中丸組，每組10只。模型組和理中丸組大鼠給予1周2次60%冰乙醇灌胃，給藥容積100g/ml，同時給予2mmol/L冰脫氧膽酸鈉和30%冰乙醇交替飲用，并應(yīng)用饑飽失常法（足量喂食1d，禁食1d，交替進行）飼養(yǎng)；空白組大鼠給予正常飼養(yǎng)及等量生理鹽水灌胃；造模時間均為12周[9]。造模結(jié)束后，理中丸組大鼠在正常喂食情況下給予理中丸灌胃，0.94g/kg，1次/d；模型組和空白組大鼠給予等量生理鹽水；連續(xù)給藥8周。

1.7.3""大鼠脾胃虛寒證候的觀察""通過大鼠舌象、體溫、體質(zhì)量、糞便干稀程度、精神活力狀態(tài)等指標判斷大鼠是否為脾胃虛寒型CAG。設(shè)置大鼠脾胃虛寒證候評分表對大鼠進行評定。評分越高表明脾胃虛寒證越明顯，反之越輕，見表1。

1.7.4""觀察大鼠胃黏膜組織病理變化""大鼠最后1次給藥后，禁食不禁水24h，10%水合氯醛（0.4ml/100g）腹腔麻醉，剖腹取胃，沿胃大彎剪開，冰0.9%"NaCl溶液沖洗。取胃竇部組織0.5cm×0.5cm，10%甲醛固定24h，梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，切片厚3μm，蘇木精-伊紅（hematoxylin"and"eosin，HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠胃黏膜組織的病理變化。

1.7.5""觀察大鼠胃黏膜細胞凋亡情況""取4%多聚甲醛固定的胃黏膜組織，常規(guī)脫蠟、水化，加入蛋白酶K工作液修復(fù)組織，熒光標記TUNEL反應(yīng)液染色，室溫避光孵育1h，加入4′，6-二脒基-2-苯基吲哚復(fù)染10min，抗熒光淬滅封片劑封片，置于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，計算細胞凋亡指數(shù)。細胞凋亡指數(shù)=陽性細胞數(shù)/視野下總細胞數(shù)×100%。正常細胞核呈藍色，陽性凋亡細胞核呈綠色。

1.7.6""檢測TP53、IL-6、TNF-α、EGFR、Bcl-2"mRNA表達情況""取–80℃冰箱中保存的胃黏膜組織，冰浴剪碎裂解，TRIzol法提取總RNA，分析所得RNA的濃度與純度，逆轉(zhuǎn)錄合成互補DNA（complementary"DNA，cDNA），以cDNA為模板進行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase"chain"reaction，PCR）擴增。引物序列見表2。擴增條件為：預(yù)變性95℃、30s，95℃、10s，60℃、30s，循環(huán)40次。溶解曲線95℃、15s，60℃、60s，95℃、15s。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計算目的基因的相對表達量。相關(guān)引物由武漢領(lǐng)康時代生物科技有限公司合成。

1.7.7""檢測TP53、IL-6、TNF-α、EGFR、Bcl-2蛋白表達水平""將石蠟包埋的胃黏膜組織切成2μm，常規(guī)脫蠟，3%"H2O2處理清除內(nèi)源性過氧化物酶，將切片浸入0.01mol/L枸櫞酸緩沖液（pH=6.0）中抗原高壓修復(fù)。10%正常山羊血清封閉后，分別滴加相應(yīng)抗體，–4℃過夜，然后依次滴加二抗、辣根過氧化物酶標記鏈親和素。顯微鏡下控制聯(lián)苯二胺顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片，顯微鏡觀察，應(yīng)用Image"Pro"Plus"6.0軟件進行統(tǒng)計分析，計算相關(guān)蛋白陽性表達的平均光密度。

1.8""統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS"27.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（"）表示，比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2""結(jié)果

2.1""理中丸活性成分和作用靶點及CAG相關(guān)靶點

借助TCMSP得到人參（22個）、白術(shù)（7個）、干姜（5個）、甘草（23個）的有效活性成分。通過Uniprot轉(zhuǎn)換相關(guān)靶點名稱后得到藥物作用靶點869個。借助GeneCards等數(shù)據(jù)庫共得到CAG相關(guān)靶點313個；將藥物作用靶點與CAG相關(guān)靶點交互處理后得到47個關(guān)鍵靶點。

2.2""關(guān)鍵靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

借助STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建理中丸與CAG的共同靶點PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖1A。用MCODE模塊將網(wǎng)絡(luò)進行模塊化，模塊中的score值反映該模塊節(jié)點與周邊節(jié)點的密集程度，score值越大說明該靶點在網(wǎng)絡(luò)中越重要，見圖1B。以度值為條件排列PPI網(wǎng)絡(luò)，該PPI網(wǎng)絡(luò)節(jié)點度值的平均值為13.74，共有12個靶點的度值大于平均值，見圖1C。其中，TP53、IL-6、TNF-α、EGFR、Bcl-2的度值最高且與其他靶點關(guān)聯(lián)最密切，可能成為治療CAG的關(guān)鍵靶點。

2.3""GO功能分析

借助DAVID數(shù)據(jù)庫對理中丸治療CAG的關(guān)鍵靶點進行功能分析，共獲得308個條目，其中生物過程207個，分子功能43個，細胞組分24個。選取前10條GO項目，利用微生信進行可視化，顏色深淺與基因數(shù)量成正比，見圖2。

2.4""KEGG通路分析

KEGG通路富集分析共獲得135條通路，主要有腫瘤的發(fā)病途徑、腫瘤中的蛋白聚糖、膽堿能突觸、磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide"3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein"kinase"B，PKB，又稱Akt）信號通路等，見圖3。

2.5""“藥物-疾病-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將藥物有效活性成分、交集基因、疾病靶點和KEGG通路富集分析中前20條通路導(dǎo)入Cytoscape"3.9.1軟件，剔除與疾病靶點無關(guān)聯(lián)的藥物活性成分，構(gòu)建“關(guān)鍵靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)，見圖4。結(jié)果顯示網(wǎng)絡(luò)包含70個節(jié)點，118條相互作用的邊。其中TP53、IL-6、TNF-α、EGFR、Bcl-2在CAG的發(fā)病過程中有重要作用，可成為CAG治療的關(guān)鍵靶點。

2.6""“活性成分-靶點”分子對接

將核心活性成分花生四烯酸、人參皂苷Rg5、五味子酯乙、阿樸天仙子堿、人參皂苷Rh2與TP53、IL-6、TNF-α、EGFR、Bcl-2進行分子對接，將結(jié)合能以熱圖呈現(xiàn)，見圖5。結(jié)果顯示，與TP53、IL-6、Bcl-2親和力最高的是人參皂苷Rh2，與TNF-α、EGFR親和力最高的是五味子酯乙。運用Moe軟件對結(jié)合活性較好的結(jié)果進行可視化，見圖6。

2.7""體外實驗結(jié)果

2.7.1""脾胃虛寒型CAG大鼠模型的構(gòu)建""造模過程中動態(tài)觀察各組大鼠的毛發(fā)、進食、飲水、活動、大便、體溫、體質(zhì)量等變化。造模第8周時，模型組部分大鼠出現(xiàn)毛發(fā)蓬亂枯燥、活動減少、肢體溫度降低。造模第11周時，模型組大部分大鼠出現(xiàn)進食飲水減少、蜷臥少動、體溫降低、體質(zhì)量增長減慢、大便稀溏，提示脾胃虛寒型CAG大鼠模型已基本建成。造模第12周末時，與空白組比較，模型組大鼠形態(tài)消瘦，背毛枯槁、松散、易脫落、無光澤，精神萎靡，雙眼無神，活動遲鈍，食量下降，大便稀溏，肛周污染，體型偏小。模型組大鼠的脾胃虛寒證候評分顯著高于空白組[（8.30±0.60）分"vs."（3.90±0.56）分，Plt;0.05]。

2.7.2""各組大鼠胃黏膜組織的病理結(jié)果""空白組：胃底腺區(qū)胃腺豐富，排列緊密，細胞形態(tài)正常，組織未見異常。模型組：較大范圍胃腺萎縮，結(jié)構(gòu)不清，可見較多膠原增生，并伴有炎癥細胞浸潤，黏膜下層間隙增寬，可見炎癥細胞滲出。理中丸組：胃黏膜病變較模型組有所好轉(zhuǎn)，炎癥細胞浸潤主要局限于黏膜淺層，胃腺萎縮，胃腺結(jié)構(gòu)不清，細胞界限不清，可見較多膠原增生，組織未見明顯炎癥反應(yīng)，見圖7。

2.7.3""各組大鼠胃黏膜組織細胞凋亡情況比較""空白組、模型組和理中丸組大鼠胃黏膜細胞凋亡指數(shù)分別為（2.45±0.22）%、（11.31±2.15）%和（6.51±0.88）%。與空白組比較，模型組和理中丸組細胞凋亡指數(shù)顯著增加（Plt;0.05）；而與模型組相比，理中丸組細胞凋亡指數(shù)顯著下降（P=0.005），見圖8。

2.7.4""各組TP53、IL-6、TNF-α、EGFR、Bcl-2"mRNA表達水平比較""模型組的TP53、IL-6、TNF-α、EGFR、Bcl-2"mRNA表達水平均顯著高于空白組（Plt;0.01）；理中丸組的TP53、IL-6、TNF-α、EGFR、Bcl-2"mRNA表達水平均顯著低于模型組（Plt;0.01），見圖9。

2.7.5""各組P53、IL-6、TNF-α、EGFR、Bcl-2蛋白表達水平比較""模型組的TP53、IL-6、TNF-α、EGFR、Bcl-2蛋白表達水平均顯著高于空白組（Plt;0.01）；理中丸組的TP53、IL-6、TNF-α、EGFR、Bcl-2蛋白表達水平均顯著低于模型組（Plt;0.05），見圖10。

3""討論

本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和體外實驗法對理中丸治療脾胃虛寒型CAG的作用機制進行探究。篩選理中丸的有效活性成分，獲得花生四烯酸、人參皂苷Rg5、五味子酯乙、阿樸天仙子堿、人參皂苷Rh2等核心活性成分?；ㄉ南┧崾求w內(nèi)廣泛存在的生物活性物質(zhì)，對免疫、炎癥、腫瘤等發(fā)揮重要調(diào)控作用[10]?；ㄉ南┧岽x通路下游物質(zhì)在胃黏膜損傷與修復(fù)方面扮演重要角色[11]。人參皂苷Rg5是人參的主要成分，屬于原生苷二醇人參皂苷家族，可通過G2/M期停滯抑制細胞增殖進而抑制CAG向胃癌的惡化[12]。人參皂苷Rh2表現(xiàn)出比較好的抗腫瘤活性，通過多靶點、多途徑產(chǎn)生抗腫瘤活性，對多種腫瘤有良好的抵抗效應(yīng)[13]。在理中丸-CAG關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)中，進一步篩選出TP53、IL-6、TNF-α、EGFR、Bcl-2等核心靶點。TP53蛋白是一種能激活多個靶基因表達的轉(zhuǎn)錄因子，主要生物學(xué)功能是阻滯細胞周期、誘導(dǎo)細胞凋亡、調(diào)控DNA修復(fù)等[14]。TNF-α是由巨噬細胞分泌的重要促炎因子，其介導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子1通路可引發(fā)胃黏膜組織細胞凋亡和炎癥反應(yīng)[15]。EGFR過度表達可激活細胞中的增殖和分化通路，抑制細胞凋亡和血管生成導(dǎo)致腫瘤進展[16]。當(dāng)CAG發(fā)生時，胃黏膜細胞處于活躍的增殖狀態(tài)，Bcl-2表達水平的增加可幫助細胞逃避凋亡[17]。KEGG信號通路富集分析顯示，關(guān)鍵靶點主要富集在腫瘤的發(fā)病途徑、腫瘤中的蛋白聚糖、膽堿能突觸、PI3K/Akt信號通路。KEGG通路富集血小板衍生生長因子受體β、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、蛋白激酶C"β型、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶P1等20個交集基因，其中包括IL-6、Bcl-2、TP53、EGFR等關(guān)鍵基因。腫瘤中的蛋白聚糖富集關(guān)鍵基因包括TNF-α、EGFR和TP53。膽堿能突觸屬于生物體系統(tǒng)通路，是一種Ca2+介導(dǎo)電壓依賴性神經(jīng)遞質(zhì)釋放突觸，富集13種基因，包括核心基因Bcl-2[18]。PI3K/Akt信號通路的作用機制為PI3K特異性磷酸化Akt中的Thr308和Ser473，進一步調(diào)節(jié)靶基因表達以調(diào)控細胞表型[19]。PI3K/Akt信號通路富集16種基因，包括核心基因IL-6、TP53、EGFR和Bcl-2。在CAG的發(fā)病過程中，PI3K/Akt信號通路被激活，導(dǎo)致Bcl-2大量表達，誘導(dǎo)下游活性氧產(chǎn)生，激活氧化應(yīng)激反應(yīng)，加劇細胞損傷[20]。分子對接結(jié)果顯示理中丸的核心活性成分與關(guān)鍵靶點TP53、IL-6、TNF-α、EGFR、Bcl-2均展現(xiàn)出較好的親和力。體外實驗結(jié)果表明理中丸可改善胃黏膜組織的病理改變，減少胃黏膜細胞凋亡，抑制TP53、IL-6、TNF-α、EGFR、Bcl-2"mRNA和蛋白的表達。

綜上，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合體外實驗發(fā)現(xiàn)理中丸治療脾胃虛寒型CAG是通過多成分、多靶點、多通路的協(xié)同作用發(fā)揮療效。實驗驗證理中丸通過調(diào)控胃黏膜細胞的增殖-凋亡失衡狀態(tài)，降低炎癥反應(yīng)，進而對胃黏膜萎縮小鼠黏膜細胞的損傷起到一定保護作用，發(fā)揮防治脾胃虛寒型CAG的作用，為后續(xù)深入研究提供科學(xué)依據(jù)，為理中丸的開發(fā)利用提供新思路和參考。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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