NUAK2對肝癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

摘要：目的" 研究肝癌細(xì)胞NUAK家族激酶2（NUAK2）對肝癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響。方法" 選取2022年1月-2023年6月在我院手術(shù)治療的40例患者肝癌組織標(biāo)本為觀察組，并選取同期手術(shù)治療存檔的40例患者正常肝組織標(biāo)本為對照組，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測（PCR）技術(shù)和Western Blot法檢測兩組NUAK2及NUAK2 mRNA的表達(dá)水平，Transwell法檢測NUAK2對肝癌癌細(xì)胞株侵襲能力的影響，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測NUAK2對肝癌癌細(xì)胞株遷移能力的影響。結(jié)果" 觀察組NUAK2水平、NUAK2 mRNA表達(dá)均高于對照組（Plt;0.05）;觀察組肝癌細(xì)胞侵襲細(xì)胞個(gè)數(shù)、侵襲抑制率均低于對照組（Plt;0.05）;觀察組肝癌細(xì)胞遷移細(xì)胞個(gè)數(shù)、遷移抑制率均低于對照組（Plt;0.05）。結(jié)論" NUAK2在肝癌細(xì)胞組織呈現(xiàn)高表達(dá)水平，且會(huì)降低肝癌細(xì)胞侵襲、遷移率，進(jìn)一步表明高水平NUAK2與肝癌的侵襲和遷移能力密切相關(guān)，可能與其他蛋白相互作用后調(diào)控肝癌的發(fā)生與發(fā)展。

關(guān)鍵詞：NUAK2;肝癌細(xì)胞;侵襲;遷移能力

中圖分類號：R735.7" " " " " " " " " " " " " " " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A" " " " " " " " " " " " " " " "DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.24.004

文章編號：1006-1959（2024）24-0012-04

Effect of NUAK2 on the Invasion and Migration of Hepatocellular Carcinoma Cells

LAI Dongxiang1，XIAO Xuewen2，GUO Zhenqiang3，LUO Yi4

（1.Pathology Department of Chongyi County People's Hospital，Chongyi 341399，Jiangxi，China;

2.Pathology Department of the First Affiliated Hospital of Gannan Medical College，Ganzhou 341001，Jiangxi，China;

3.Pathology Department of Ganzhou Municipal Hospital，Ganzhou 341099，Jiangxi，China;

4.Surgey Department of Chongyi County People's Hospital，Chongyi 341399，Jiangxi，China）

Abstract：Objective" To study the effect of NUAK family kinase 2 （NUAK2） on the invasion and migration of hepatocellular carcinoma cells.Methods" From January 2022 to June 2023， 40 cases of liver cancer tissue specimens from patients undergoing surgical treatment in our hospital were selected as the observation group， and 40 cases of normal liver tissue specimens from patients undergoing surgical treatment at the same time were selected as the control group. Polymerase chain reaction （PCR） and Western Blot were used to detect the expression levels of NUAK2 and NUAK2 mRNA in the two groups. Transwell method was used to detect the effect of NUAK2 on the invasion ability of liver cancer cell lines， and cell scratch test was used to detect the effect of NUAK2 on the migration ability of liver cancer cell lines.Results" The level of NUAK2 and the expression of NUAK2 mRNA in the observation group were higher than those in the control group （Plt;0.05）. The number of invasive cells and invasion inhibition rate of liver cancer cells in the observation group were lower than those in the control group （Plt;0.05）. The number of migrated cells and migration inhibition rate of liver cancer cells in the observation group were lower than those in the control group （Plt;0.05）.Conclusion" NUAK2 is highly expressed in hepatocellular carcinoma tissues， and it can reduce the invasion and migration rate of hepatocellular carcinoma cells， which further indicates that high level of NUAK2 is closely related to the invasion and migration ability of hepatocellular carcinoma， and may regulate the occurrence and development of hepatocellular carcinoma after interacting with other proteins.

Key words：NUAK2;Hepatocellular carcinoma cell;Invasion;Migratory ability

肝癌（hepatocellular carcinoma）是臨床常見的惡性腫瘤，其發(fā)生率在全球僅次于肺癌及胃癌，對患者的生命安全造成嚴(yán)重威脅[1]。肝癌發(fā)病初期無顯著特異性癥狀，多數(shù)患者發(fā)病就診時(shí)已經(jīng)處于晚期，失去手術(shù)治療的最佳時(shí)機(jī)[2]。相關(guān)研究顯示[3]，部分患者利用肝移植等治療方式展開根治性治療，但是整體臨床療效無法達(dá)到預(yù)期，術(shù)后具有較高復(fù)發(fā)率。侵襲、遷移是肝癌的基本特征，其侵襲與遷移取決于細(xì)胞黏附以及細(xì)胞外蛋白水解變性[4]。肝癌細(xì)胞可以在趨化因子刺激下發(fā)生運(yùn)動(dòng)，但其黏附性下降，容易從原發(fā)灶脫離并降解細(xì)胞外基質(zhì)，形成向外轉(zhuǎn)移的通道，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移[5]。NUAK2是人腺苷單磷酸（AMP-activated protein， AMP）激酶家族的第4個(gè)成員，編碼相關(guān)激酶[6]。目前，臨床研究已經(jīng)證實(shí)NUAK2參與多種癌癥的發(fā)生與發(fā)展。但是與肝癌相關(guān)研究較少，尤其是對肝癌細(xì)胞侵襲和遷移能力影響方面的研究存在差異[7]。本研究選擇2022年1月-2023年6月在我院手術(shù)治療的40例肝癌患者組織標(biāo)本，進(jìn)一步探究NUAK2對肝癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料" 選取2022年1月-2023年6月在崇義縣人民醫(yī)院手術(shù)治療的40例肝癌患者組織標(biāo)本為觀察組，并選取同期手術(shù)治療存檔的40例患者正常肝組織標(biāo)本為對照組。觀察組男27例，女13例;年齡32～78歲，平均年齡（55.21±2.19）歲。對照組男25例，女15例，年齡33～77歲，平均年齡（55.22±2.18）歲。兩組年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05），有可比性。所有納入患者均自愿參加本研究，并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1儀器和試劑" 試劑盒（上海優(yōu)聯(lián)生物科技有限公司）、光學(xué)顯微鏡（廣州景通儀器有限公司）、離心機(jī)（浙江三聯(lián)環(huán)?？萍脊煞萦邢薰荆⑾窗鍣C(jī)（廣西路博環(huán)?？萍加邢薰荆晒舛縋CR儀（廣州金程科學(xué)儀器有限公司）及酶標(biāo)儀（深圳雷社有限公司）等。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)" 在體外環(huán)境中，對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞株進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)[8]。采用含10.00%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，并在恒溫37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每24 h更換一次培養(yǎng)液。當(dāng)肝癌細(xì)胞完全覆蓋培養(yǎng)瓶底部后，移除培養(yǎng)液，采用0.25%胰蛋白酶對SMMC-7721肝癌細(xì)胞進(jìn)行消化處理。之后使用含10.00%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×106/ml，以確保實(shí)驗(yàn)的一致性和準(zhǔn)確性。在實(shí)驗(yàn)過程中，選擇處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，以確保細(xì)胞的生長活性和實(shí)驗(yàn)的可靠性。

1.2.3細(xì)胞損傷刮擦實(shí)驗(yàn)" 在12孔培養(yǎng)板中，接種對數(shù)生長期的SMMC-7721人肝癌細(xì)胞，細(xì)胞形成單層后，采用移液器滴頭沿著培養(yǎng)板底部進(jìn)行“一”字形劃痕單層培養(yǎng)細(xì)胞的操作，并在顯微鏡下對劃痕區(qū)的相對距離進(jìn)行詳細(xì)記錄[9]。隨后，將培養(yǎng)液更換為體積分?jǐn)?shù)為1%的胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液并持續(xù)培養(yǎng)24 h。然后再次更換為體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液并繼續(xù)培養(yǎng)48 h。在此過程中，觀察并拍攝照片，為了確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，設(shè)置4個(gè)平行樣本，并重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.2.4細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)" 將0.2 ml NIH3T3細(xì)胞培養(yǎng)上清液加入Boyden小室的下室中[10]。選用孔徑為8 μm的聚碳酸酯微孔濾膜將上下室分隔開，并在濾膜上預(yù)先鋪設(shè)40 μl含有120 μg Madrigel的溶液。在37 ℃下聚合0.5 h，以重建基底膜。隨后，將細(xì)胞懸液加入Boyden小室的上室中，并在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育6 h。孵育結(jié)束后，取出濾膜，輕輕擦去膜上的Matrigel及未穿透的細(xì)胞，然后用甲醇固定1 min。接下來，進(jìn)行HE染色處理。在200倍光學(xué)顯微鏡下，隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)算穿過聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)量，并求其平均值。

1.3觀察指標(biāo)" 比較兩組肝癌細(xì)胞NUAK2蛋白和NUAK2的mRNA的表達(dá)、肝癌癌細(xì)胞株侵襲、遷移能力。侵襲抑制率（遷移抑制率）=（陰性對照組各視野中穿膜細(xì)胞數(shù)-轉(zhuǎn)染組各視野中穿膜細(xì)胞數(shù)）/陰性對照組各視野中穿膜細(xì)胞數(shù)×100.00%[11]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法" 采用SPSS 27.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，行χ2檢驗(yàn);計(jì)量資料以（x±s）表示，行t檢驗(yàn);Plt;0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組肝細(xì)胞中NUAK2水平、NUAK2的mRNA比較" 觀察組肝癌細(xì)胞中NUAK2水平、NUAK2的mRNA均高于對照組（Plt;0.05），見表1。

2.2兩組肝細(xì)胞侵襲個(gè)數(shù)、侵襲抑制率比較" 觀察組肝癌細(xì)胞侵襲細(xì)胞個(gè)數(shù)、侵襲抑制率均低于對照組（Plt;0.05），見表2、圖1。

2.3兩組肝細(xì)胞遷移細(xì)胞個(gè)數(shù)、遷移抑制率比較" 觀察組肝癌細(xì)胞遷移細(xì)胞個(gè)數(shù)、遷移抑制率均低于對照組（Plt;0.05），見表3、圖2。

3討論

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，肝癌的治療趨于靶向治療，并且已經(jīng)成為當(dāng)前臨床治療肝癌研究的熱點(diǎn)話題，并且特異性靶向藥物在提高臨床療效方面已經(jīng)取得巨大進(jìn)展[12，13]。治療靶點(diǎn)一般為信號通路上信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)錄活化的關(guān)鍵分子，因此研究肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制可以為肝癌的治療提供新的靶點(diǎn)[14，15]。NUAK2主要定位在細(xì)胞核，可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期通路，將細(xì)胞能力狀態(tài)與細(xì)胞生長、增殖聯(lián)系起來，并且參與調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、運(yùn)動(dòng)功能機(jī)制[16]。肝癌的發(fā)生是癌細(xì)胞無限制增殖，并伴新生血管，隨著病情的進(jìn)展，癌細(xì)胞會(huì)突破基底膜、血管內(nèi)層，例如血液、淋巴管等系統(tǒng)，從而遷移至其他部位，最后黏附于靶器官，形成轉(zhuǎn)移灶[17]。因此，研究NUAK2的表達(dá)，并探究NUAK2與肝癌轉(zhuǎn)移、遷移的關(guān)系，對緩解病情，控制肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要[18]。

本研究結(jié)果顯示，觀察組肝癌細(xì)胞中NUAK2水平、NUAK2的mRNA均高于對照組（Plt;0.05），表明肝癌患者NUAK2呈高水平表達(dá)，且可能參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程。分析認(rèn)為，可能是因?yàn)镹UAK2作為AMPK相關(guān)激酶，可對細(xì)胞代謝、運(yùn)動(dòng)等過程進(jìn)行調(diào)節(jié)，且隨著NUAK2水平的不斷升高，通過激活下游相關(guān)信號通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖等過程，從而增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)特性，如侵襲、遷移能力，進(jìn)而可能增加肝癌轉(zhuǎn)移、進(jìn)展的發(fā)生。因此，NUAK2對肝癌的預(yù)測也具有一定的價(jià)值[19]。同時(shí)本研究顯示，觀察組肝癌細(xì)胞侵襲細(xì)胞個(gè)數(shù)、侵襲抑制率均低于對照組（Plt;0.05），提示NUAK2高水平會(huì)抑制肝癌細(xì)胞侵襲率，對于減緩肝癌惡性進(jìn)程具有積極的影響。究其原因，與對照組比較，觀察組肝癌患者NUAK2高水平表達(dá)，可能會(huì)通過調(diào)控細(xì)胞骨架進(jìn)行重組，影響細(xì)胞黏附、遷移相關(guān)的蛋白表達(dá)，抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程進(jìn)展，增強(qiáng)上皮細(xì)胞活性，有效減弱轉(zhuǎn)移和侵襲能力，從而預(yù)防肝癌細(xì)胞的侵襲[20]。故，肝癌細(xì)胞中NUAK2表達(dá)可降低肝癌細(xì)胞侵襲能力。此外，觀察組肝癌細(xì)胞遷移細(xì)胞個(gè)數(shù)、遷移抑制率均低于對照組（Plt;0.05），表明上調(diào)NUAK2表達(dá)會(huì)降低肝癌細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)功能。因?yàn)?，NUAK2快速表達(dá)可以削弱NUAK2對肝癌細(xì)胞的調(diào)控，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞衰老，從而降低遷移細(xì)胞個(gè)數(shù)，最終抑制遷移?？梢姡琋UAK2 可能是肝癌細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)靶基因，且在其中起到正反饋的作用，降低肝癌細(xì)胞惡性進(jìn)程。

綜上所述，NUAK2高度表達(dá)水平與肝癌細(xì)胞的侵襲與遷移能力緊密相關(guān)，NUAK2水平高，其侵襲及遷移抑制率均降低。基于此，臨床可通過靶向抑制NUAK2的表達(dá)，削弱肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)特征，從而為肝癌的治療開辟出全新的思路與途徑。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉暢，裴晉紅，穆秀麗，等.多靶點(diǎn)蛋白酪氨酸激酶抑制劑Ponatinib對人肝癌細(xì)胞SK-Hep-1增殖、黏附和遷移能力的影響[J].中國生物制品學(xué)雜志，2023，36（6）：668-672，679.

[2]胡霄，朱明輝，蒲青凡，等. HDAC抑制劑Quisinostat對肝癌Huh7細(xì)胞增殖和凋亡的影響及作用機(jī)制[J].浙江醫(yī)學(xué)，2021，43（1）：42-46.

[3]朱冉旭，羊東曄，司徒偉基.EGFR的異常表達(dá)對于肝癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響[J].黑龍江醫(yī)藥，2019，32（4）：924-926.

[4]陳虹瑛，王鑫昕，王瑜茹，等. Polo樣蛋白激酶1抑制劑BI-2536對人肝癌SNU-423細(xì)胞增殖及侵襲的影響[J].中國生物制品學(xué)雜志，2020，33（5）：527-529，534.

[5]梁媛媛，趙頌，胡靜，等.莫特塞尼與EZH2抑制劑GSK126聯(lián)合應(yīng)用對肝癌Huh7細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其機(jī)制[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2023，49（4）：896-904.

[6]朱華，付明月，盧嘉莉，等.SETD8抑制劑UNC0379對肝癌細(xì)胞增殖、遷移的影響[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2023，44（4）：435-439.

[7]王坤，陳奧，馬石楠.轉(zhuǎn)化生長因子β相關(guān)激酶1抑制劑對人肝癌細(xì)胞系HepG2脂滴積累的影響及其機(jī)制[J].山東醫(yī)藥，2020，60（24）：12-16.

[8]李浩然，牟曉靜，羅定安，等.白細(xì)胞介素-1β和核因子κB激酶亞基β的抑制劑高表達(dá)對中國肝癌分期Ⅰ～Ⅱ期肝細(xì)胞癌患者術(shù)后預(yù)后的影響[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2021，38（10）：1890-1893.

[9]劉浩楠，王玉芹，吳萌，等.程序性細(xì)胞死亡受體-1抑制劑治療中晚期非病毒性相關(guān)肝癌的效果及安全性分析[J].臨床肝膽病雜志，2022，38（12）：2761-2766.

[10]Farré PL，Duca RB，Massillo C，et al.MiR-106b-5p：A Master Regulator of Potential Biomarkers for Breast Cancer Aggressiveness and Prognosis[J].Int J Mol Sci，2021，22（20）：11135.

[11]張華穎，劉鑫，趙偉，等.自噬在肝癌SMMC-7721細(xì)胞DNA放射損傷修復(fù)中的影響[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2021，38（10）：1882-1886.

[12]杜晨陽，張建軍，王振，等.miRNA-30a-3p下調(diào)Atg3介導(dǎo)的自噬抑制肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[J].中華普通外科雜志，2023，33（4）：334-337.

[13]王匯鋒，陳潔，趙咫龍.miR-4282對肝癌細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響[J].錦州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2021，15（8）：79-82.

[14]孫建海，馬燕凌，魏武杰，等.FCRL5蛋白對肝癌細(xì)胞增殖與侵襲遷移能力的作用及機(jī)制[J].中國老年學(xué)雜志，2021，25（7）：140-143.

[15]張迪，張惠嬌，葉劍鵬，等.長鏈非編碼RNAEIF3J-AS1通過上調(diào)肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲和遷移能力[J].貴州醫(yī)藥，2021，28（10）：153-155.

[16]劉晨霞.線粒體自噬對肝癌細(xì)胞遷移及侵襲能力的作用及機(jī)制研究[J].西南醫(yī)科大學(xué)，2021，2（1）：366-369.

[17]付雪，寧登，陳勁，等.eEF1A1通過HGF/c-MET通路調(diào)控肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力[J].中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2023，20（4）：221-224.

[18]李志堅(jiān)，王展，熊龍輝，等.微小RNA-498在肝癌中的表達(dá)及其對細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2022，25（12）：260-263.

[19]邱麗芳.IL-33/ST2對人肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲能力的影響[J].右江民族醫(yī)學(xué)院，2020，30（6）：167-170.

[20]王雅冰，趙孟杰，孫景武，等.鳥嘌呤核苷酸抑制因子2基因表達(dá)與肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的關(guān)系[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2020，28（2）：355-358.

收稿日期：2024-10-31;修回日期：2024-11-05

編輯/成森

基金項(xiàng)目：贛州市指導(dǎo)性科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號：GZ2023ZSF402）

作者簡介：賴冬香（1989.11-），女，江西崇義縣人，本科，主治醫(yī)師，主要從事病理診斷工作