白花丹素通過(guò)抑制JAK2/STAT3通路減弱焦亡對(duì)抗膿毒癥心肌損傷

關(guān)鍵詞：白花丹素；膿毒癥心肌損傷；焦亡；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

膿毒癥是指因感染引起宿主反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙［1］，在這些器官功能障礙中，膿毒癥引起的心肌損傷普遍發(fā)生，約占50%，其特征是嚴(yán)重且可逆的心臟功能障礙［2］。細(xì)菌感染是宿主反應(yīng)中炎癥小體組裝和激活的重要誘因，細(xì)胞焦亡會(huì)引起顯著的炎癥反應(yīng)，這有助于清除感染，然而過(guò)度激活的細(xì)胞焦亡可導(dǎo)致膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征或繼發(fā)感染的風(fēng)險(xiǎn)增加［3］。

白花丹素是從藥用植物白花丹的根中提取的主要生物活性化合物，表現(xiàn)出多種藥理活性，包括抗癌、抗菌和抗炎特性等［4］。白花丹素不僅能抑制心血管系統(tǒng)中二磷酸腺苷誘導(dǎo)的血小板聚集，還能抑制煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4的表達(dá)，顯著改善心肌I/R的氧化還原狀態(tài)失衡［5］。有研究表明，白花丹素對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的大鼠心臟毒性具有治療潛力［6］，可通過(guò)激活Nrf2降低ROS水平，增加谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、過(guò)氧化氫酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶等抗氧化酶活性［7］；白花丹素預(yù)處理通過(guò)激活Nrf2 顯著抑制心肌I/R 損傷［8］。另有報(bào)道，白花丹素可顯著改善LPS 誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷，抑制LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞炎癥反應(yīng)［4］；能顯著抑制早期（IL-1β）和晚期（HMGB1）細(xì)胞因子的全身釋放，降低膿毒癥的致死率［10］?；诎谆ǖに氐纳鲜鲎饔?，我們推測(cè)白花丹素在治療膿毒癥心肌損傷方面具有很大的潛力，但目前白花丹素對(duì)膿毒癥心肌損傷的保護(hù)作用和相關(guān)機(jī)制尚不清楚，缺乏白花丹素的有效成分靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶點(diǎn)相互作用的研究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)、基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等學(xué)科，是通過(guò)計(jì)算分析與體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，整合大量信息，發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點(diǎn)和分子機(jī)制的方法［9］。因此，基于上述問(wèn)題，本研究首先通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)首先篩選出白花丹素治療膿毒癥心肌損傷的靶點(diǎn)，并對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG分析，明確白花丹素治療膿毒癥心肌損傷核心靶點(diǎn)以及潛在的分子機(jī)制，并在小鼠模型上進(jìn)行初步驗(yàn)證，為白花丹素未來(lái)的臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究提供新的見(jiàn)解及依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 白花丹素靶點(diǎn)的獲取

利用NPACT 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//ngdc. cncb. ac. cn/databasecommons/database/id/440）、Swisstargetprediction數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//swisstargetprediction.ch/）、SEA數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//sea.bkslab.org/）和STITCH 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//ngdc. cncb. ac. cn/databasecommons/database/id/208）獲取白花丹素藥物靶點(diǎn)，靶點(diǎn)種類(lèi)設(shè)定為Mouse Only，其他默認(rèn)。

1.2 膿毒癥心肌損傷相關(guān)靶點(diǎn)的獲取

通過(guò)GeneCards（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)，以“sepsis-induced myocardial injury”為關(guān)鍵詞檢索相關(guān)的基因，獲取疾病靶點(diǎn)。

1.3 焦亡相關(guān)靶點(diǎn)的獲取

通過(guò)GeneCards（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)，以“pyroptosis”為關(guān)鍵詞檢索相關(guān)的基因，獲取疾病靶點(diǎn)。

1.4 白花丹素-膿毒癥心肌損傷-焦亡交集靶點(diǎn)蛋白質(zhì)互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將篩選過(guò)的靶點(diǎn)上傳至在線(xiàn)韋恩圖（https：//www.bioinformatics. com. cn/static/others/jvenn/example.html），得到白花丹素-膿毒癥心肌損傷-焦亡的交集基因。將交集基因?qū)隨tring 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string- db.org/cgi/input.pl）構(gòu)建蛋白質(zhì)之間的PPI，將PPI 網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2 軟件（http：//www.cytoscape.org/）進(jìn)行調(diào)整以及利用cytoHubba插件得到關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5 GO和KEGG富集分析

GO分析可以進(jìn)一步解釋交集基因在分子功能、生物過(guò)程和細(xì)胞組成抗膿毒癥心肌損傷的過(guò)程。KEGG富集分析則是研究交集基因涉及的主要抗膿毒癥心肌損傷信號(hào)通路。本研究將關(guān)鍵核心靶點(diǎn)數(shù)據(jù)，利用Metascape平臺(tái)（https：//metascape.org/gp /index.html），物種為“Mus musculus”進(jìn)行 KEGG 通路富集分析與GO功能富集分析。

1.6 白花丹素與膿毒癥心肌損傷分子對(duì)接

將已知的關(guān)鍵靶點(diǎn)與白花丹素進(jìn)行分子對(duì)接，得到對(duì)接親和力反映其穩(wěn)定性。PDB數(shù)據(jù)庫(kù)下載核心蛋白分子結(jié)構(gòu)，PUBCHEM下載白花丹素的結(jié)構(gòu)，將蛋白和白花丹素結(jié)構(gòu)導(dǎo)入PyMol 2.4.0 和Auto Dock Tools 軟件進(jìn)行處理后進(jìn)行分子對(duì)接，PyMol 2.4.0進(jìn)行可視化。

1.7 藥品及試劑

白花丹素（PLB，MCE）；丙二醛（MDA）試劑盒（APE×BIO）；肌酸激酶同工酶（CK-MB）和乳酸脫氫酶（LDH）測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司）；RIPA強(qiáng)效裂解液（Biosharp）；PMSF、BCA蛋白試劑盒、5×蛋白上樣緩沖液、DAPI 染液（碧云天）；PAGE凝膠試劑盒（雅酶生物）；PVDF膜Immobilon和ECL試劑盒（Millipore）；IL-18和IL-1β ELISA試劑盒（晶美生物科技有限公司）；STAT3（1∶1000）、HMGB1（Abcam，1∶1000）、Caspase-11（1∶1000）、GSDMD（1∶1000）、P-STAT3（1∶1000）、JAK2（1∶1000）、P-JAK2（Abcam，1∶1000），GSDMD-N（Affinity，1∶1000）和GAPDH（Absin，1∶6000）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（Biosharp，1∶20000）、DHE熒光探針；異氟烷（深圳瑞沃德生命科技有限公司）；Marker（賽默飛）。

1.8 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性C57BL/6J小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)自江蘇青龍山生物科技有限公司［許可證號(hào)：SCXK（蘇）2024-0001］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照蚌埠醫(yī)科大學(xué)倫理要求進(jìn)行（倫理批號(hào)：［2024］第581號(hào)）。

1.9 實(shí)驗(yàn)方法

1.9.1 動(dòng)物模型建立及分組 實(shí)驗(yàn)小鼠在25～ 27 ℃、相對(duì)濕度60%～70%的條件下飼養(yǎng)，待小鼠適應(yīng)1周后。將小鼠隨機(jī)分為4組，8只/組：Sham組、盲腸結(jié)扎組（CLP）、白花丹素（PLB，2 mg/kg）+CLP 組和PLB（4 mg/kg）+CLP組［ 10］。給藥組小鼠CLP前24 h 腹腔注射不同濃度白花丹素。CLP 手術(shù)前12 h 禁食不禁水，首先使用2.5%異氟烷誘導(dǎo)麻醉；待小鼠深度麻醉后仰臥固定于恒溫板上，術(shù)中使用1%異氟烷維持麻醉，并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)小鼠生命體征。消毒小鼠腹部后，于下腹部中線(xiàn)剪開(kāi)腹膜約2 cm，將盲腸輕柔地拉出后，在盲腸遠(yuǎn)端1/2處使用無(wú)菌3-0手術(shù)線(xiàn)結(jié)扎，并使用18G無(wú)菌針頭穿刺結(jié)扎點(diǎn)與盲腸末端的中間區(qū)域，擠出米粒大小的腸內(nèi)容物后，將盲腸放回腹腔，縫合小鼠腹膜和皮膚，皮下注射生理鹽水后放置恒溫箱，可進(jìn)食水，注意觀(guān)察術(shù)后表現(xiàn)［11］。

1.9.2 超聲心動(dòng)圖評(píng)估小鼠左心室結(jié)構(gòu)和功能 術(shù)后24 h吸入1%的異氟烷麻醉小鼠，剃除小鼠胸前區(qū)毛發(fā)，然后使用配備30 MHz 的MS-400 超聲探頭的Vevo2100 超高分辨率小動(dòng)物超聲系統(tǒng)（VisualSonics）進(jìn)行評(píng)估。在M型超聲模塊下檢測(cè)心輸出量（CO）、左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、縮短分?jǐn)?shù)（LVFS）和每搏輸出量（SV）等，每只小鼠至少取3個(gè)心動(dòng)周期，反映小鼠心臟的舒張和收縮功能。

1.9.3 心肌組織HE染色 術(shù)后24 h，收集新鮮心肌組織樣本，在PBS中泵出血液，4%多聚甲醛固定24 h，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，將固定的心肌組織切片（0.5 mm），蘇木精-伊紅染色，光鏡下（Nikon Eclipse E100）分析心肌組織結(jié)構(gòu)變化。

1.9.4 ELISA法檢測(cè)各組小鼠血清中炎癥因子IL-18和IL-1β的表達(dá) 術(shù)后24 h，收集小鼠全血放置2 h后，4 ℃低溫離心機(jī)中1000×g離心15 min，取上清液，每個(gè)樣本吸取50 μL血清再加入50 μL的樣品稀釋液。按照試劑盒說(shuō) 明，按步驟測(cè)量各孔的吸光度，計(jì)算出各組血清IL-18和IL-1β的濃度。

1.9.5 試劑盒檢測(cè)小鼠血清MDA、CK-MB 和LDH含量 MDA含量的測(cè)定：術(shù)后24 h，收集小鼠全血放置2 h后，4 ℃低溫離心機(jī)中1000×g離心15 min，取小鼠眼球血上清液，按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行操作，檢測(cè)各孔的吸光度值A(chǔ)532 nm，計(jì)算各組血清MDA含量。

CK-MB含量的測(cè)定：取小鼠眼球血上清液并用蒸餾水稀釋5 倍后檢測(cè)，按照各試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行操作，在酶標(biāo)儀內(nèi)340 nm讀取吸光度值A(chǔ)1，繼續(xù)孵育3 min，讀吸光度值A(chǔ)2，△A=A2-A1，根據(jù)1-3 min A值變化斜率代入公式CK-MB活力（U/L）=△A/min×F（反應(yīng)系數(shù)=8360）得到各組小鼠CK-MB值。

LDH含量的測(cè)定：取小鼠眼球血上清液，按照各試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行操作，室溫放置5 min，測(cè)定吸光度值A(chǔ)440 nm，根據(jù)LDH（U/L）＝（A測(cè)定-A對(duì)照）/（A標(biāo)準(zhǔn)-A空白）×C標(biāo)準(zhǔn)（0.2 μmol/mL）×N（稀釋倍數(shù)）×1000，計(jì)算出各組小鼠血清LDH含量。

1.9.6 Western blotting檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平 取每只小鼠約10 mg 心肌組織，加入磁珠，按照RIPA∶PMSF=100∶1 的比例提取組織總蛋白，BCA法測(cè)定各組蛋白濃度，加入5×蛋白上樣緩沖液后，定量20 μg 上樣，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜，用快速封閉液封閉PVDF膜30 min，隨后將PVDF 膜分別與STAT3、HMGB1、Caspase-11、GSDMD、P-STAT3、JAK2、P-JAK2、GSDMD-N和GAPDH一抗4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜后室溫孵育HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體2 h。洗膜后，ECL發(fā)光檢測(cè)并用ImageJ軟件對(duì)灰度值進(jìn)行分析計(jì)算。

1.9.7 免疫熒光檢測(cè)心臟ROS 表達(dá)水平 制備心肌組織冰凍切片，切片6 μm，DHE染色，熒光顯微鏡拍照采集圖像，應(yīng)用Image J軟件分析熒光面積百分比。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 9.0統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。不同實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。Plt;0.05時(shí)被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白花丹素相關(guān)靶點(diǎn)獲取

利用NPACT 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//ngdc. cncb. ac. cn/databasecommons/database/id/4 40）、Swisstargetprediction數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//swisstargetprediction.ch/）、SEA數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//sea.bkslab.org/）和STITCH 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//ngdc. cncb. ac. cn/data base commons/database/id/208）獲取白花丹素藥物靶點(diǎn)，限定物種為“Mouse”，最終得到143個(gè)靶點(diǎn)。

2.2 膿毒癥心肌損傷相關(guān)靶點(diǎn)獲取

在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)共篩選出406個(gè)基因，保留所有基因作為疾病靶點(diǎn)。

2.3 焦亡相關(guān)靶點(diǎn)獲取

在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)共篩選出886個(gè)基因，保留所有基因作為疾病靶點(diǎn)。

2.4 白花丹素-膿毒癥心肌損傷-焦亡的共同靶點(diǎn)

將白花丹素潛在靶點(diǎn)信息、膿毒癥心肌損傷靶點(diǎn)和焦亡取交集得到10個(gè)作用靶點(diǎn)基因（圖1）。

2.5 PPI 網(wǎng)絡(luò)及白花丹素治療膿毒癥心肌損傷的關(guān)鍵靶點(diǎn)

將白花丹素-膿毒癥心肌損傷-焦亡交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)，物種限定為Mus，得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中共有10個(gè)節(jié)點(diǎn)，33條邊（圖2）。利用cytoHubba插件得到Degree 排名前5 的關(guān)鍵靶點(diǎn)STAT3、Bcl-2、AKT1、NFKB1和mTOR。

2.6 GO分析結(jié)果

白花丹素-膿毒癥心肌損傷-焦亡的GO功能結(jié)果提示（圖3），生物過(guò)程主要集中在：自噬的負(fù)調(diào)控、對(duì)細(xì)胞凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞對(duì)胰島素刺激的反應(yīng)；細(xì)胞組成主要集中在：大分子復(fù)合物、細(xì)胞質(zhì)和線(xiàn)粒體；分子功能主要集中在：蛋白激酶結(jié)合、相同的蛋白質(zhì)結(jié)合和大分子復(fù)合物結(jié)合等。

2.7 KEGG分析結(jié)果

KEGG通路富集篩選結(jié)果共有68 個(gè)富集項(xiàng)，其中前30 是最具有顯著性的通路（圖4），其中前列腺癌、JAK-STAT信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、癌癥通路等可能為重要的通路。

2.8 分子對(duì)接分析

將白花丹素與STAT3、JAK2和P-STAT3進(jìn)行分子對(duì)接，白花丹素與STAT3 的結(jié)合能是-5.9 kcal/mol，白花丹素與JAK2 的結(jié)合能是-7.1 kcal/mol，白花丹素與P-STAT3的結(jié)合能是-6.1 kcal/mol（圖5）。

2.9 各組小鼠一般情況

Sham組小鼠毛發(fā)光滑，小鼠精神狀態(tài)良好、攝食、飲水、攀爬打斗等行為較活躍；對(duì)聲音、觸碰等刺激的行為反應(yīng)迅速；呼吸頻率正常。CLP組小鼠毛發(fā)凌亂，四肢顫抖，眼角分泌物增多；攝食飲水等日?；顒?dòng)次數(shù)減少，對(duì)刺激的反應(yīng)減弱，行動(dòng)遲緩或靜止，呼吸頻率增加。PLB2mg+CLP 和PLB4mg+CLP 組較CLP 組整體精神狀態(tài)明顯改善，背部豎毛及眼角分泌物減少，攝食飲水等日?；顒?dòng)次數(shù)增加，對(duì)刺激反應(yīng)增強(qiáng)，可見(jiàn)緩慢步行移動(dòng)，呼吸頻率趨于正常。

2.10 膿毒癥心肌損傷小鼠模型心臟超聲的變化

與Sham 組相比，CLP 組小鼠CO、LVEF、LVFS 及SV 均降低（Plt;0.01）；與CLP 組相比，PLB2mg+CLP組和PLB4mg+CLP 組CO、LVEF、LVFS 及SV均升高（Plt;0.05，圖6）。

2.11 各組小鼠心肌形態(tài)學(xué)變化

小鼠心臟HE染色顯示，Sham組心肌纖維細(xì)胞完整，排列整齊，無(wú)壞死和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌橫紋清晰可見(jiàn)，排列較整齊，細(xì)胞核為深藍(lán)色（圖7）。CLP組心肌纖維斷裂、心肌橫紋模糊，部分消失，間質(zhì)水腫，有紅細(xì)胞滲出，炎癥浸潤(rùn)，細(xì)胞核為淡藍(lán)色。PLB2mg+CLP 和PLB4mg+CLP組小鼠炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，心肌排列較規(guī)則。

2.12 各組小鼠心肌組織ROS的變化

DHE熒光染色結(jié)果顯示，與Sham組相比，CLP組紅色熒光強(qiáng)度升高，ROS 水平升高（Plt;0.001）；與CLP組相比，PLB2mg+CLP組和PLB+CLP組紅色熒光強(qiáng)度降低，ROS水平降低（Plt;0.05，圖8）。

2.13 各組小鼠血清中炎癥因子IL-18 和IL-1β 的表達(dá)變化

與Sham組相比，CLP組血清中IL-18和IL-1β含量升高（Plt;0.001）；與CLP 組相比，PLB2mg+CLP 組、PLB4mg+CLP組IL-18和IL-1β含量降低（Plt;0.05，圖9）。

2.14 小鼠血清MDA、CK-MB和LDH含量變化

與Sham組相比，CLP 組血清中MDA、CK-MB和LDH 含量升高（Plt;0.001），與CLP 組相比，PLB2mg+CLP 組和PLB4mg+CLP 組LDH 和CK-MB 含量降低（Plt;0.001），PLB2mg+CLP 組MDA 含量和PLB4mg+CLP組MDA含量降低（Plt;0.05，圖10）。

2.15 Western blotting檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平

與Sham 組相比，CLP 組小鼠心肌GSDMD、Caspase-11、HMGB1、P-JAK2、JAK2、P-STAT3、STAT3 和GSDMD-N蛋白表達(dá)升高（Plt;0.05）；與CLP組相比，PLB2mg+CLP 組和PLB4mg+CLP 組小鼠心肌GSDMD、Caspase-11、HMGB1、P-JAK2、JAK2、PSTAT3、STAT3 和GSDMD-N 蛋白表達(dá)降低（Plt;0.05，圖11）。

3 討論

膿毒癥可導(dǎo)致全身多器官功能障礙，心臟是其最常累及的重要器官之一［12］。本研究中，心臟超聲結(jié)果顯示，CLP小鼠LVEF、LVFS、CO和SV水平明顯下降；HE染色顯示CLP小鼠出現(xiàn)心肌纖維斷裂、心肌橫紋模糊等變化，提示膿毒癥小鼠模型建立成功。越來(lái)越多的證據(jù)表明，白花丹素可通過(guò)阻斷自由基生成發(fā)揮抗氧化作用，通過(guò)降低炎癥介質(zhì)水平發(fā)揮抗炎潛力［13］。有研究表明，白花丹素通過(guò)下調(diào)COX2、iNOS和炎癥因子的表達(dá)水平，調(diào)節(jié)NF-κB水平，抑制炎癥反應(yīng)［14］。盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的應(yīng)用明顯提高了膿毒癥的生存率，但如何有效預(yù)防和減輕膿毒癥誘導(dǎo)的多器官功能損傷，仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)［15］。過(guò)度的細(xì)胞焦亡導(dǎo)致大量炎癥細(xì)胞因子釋放，引發(fā)促進(jìn)全身炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，是器官功能障礙的主要原因［16］。鑒于白花丹素良好的抗炎特性，本研究旨在闡明白花丹素是否通過(guò)抑制與炎癥密切相關(guān)的焦亡來(lái)減輕膿毒癥心肌損傷。

細(xì)胞焦亡在膿毒癥相關(guān)器官損傷的發(fā)病機(jī)制中至關(guān)重要，包括膿毒癥急性肺損傷、膿毒癥心肌病和膿毒癥急性腎損傷等［17-19］。課題組前期研究中已經(jīng)觀(guān)察到，CLP誘導(dǎo)的小鼠膿毒癥肺損傷模型中發(fā)生了GSDMD/Caspase-1介導(dǎo)的焦亡，抑制GSDMD/Caspase-1保護(hù)小鼠免受膿毒癥誘導(dǎo)的肺臟焦亡發(fā)生［20］。因此，本研究在前期工作基礎(chǔ)上重點(diǎn)觀(guān)察了另一類(lèi)非經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑。與依賴(lài)Caspase-1經(jīng)典激活途徑不同，非經(jīng)典激活途徑是依賴(lài)Caspase-4/5/11 完成的。革蘭氏陰性菌進(jìn)入吞噬細(xì)胞，通過(guò)降解細(xì)菌壁，釋放LPS。LPS結(jié)合并刺激小鼠Caspase-11 或人Caspase-4/5，導(dǎo)致Caspases寡聚化和自切割，從而導(dǎo)致NLRP3非典型激活?；罨腃aspase-11 不能直接切割pro-IL-1β和pro-IL-18，但

可以水解GSDMD生成 GSDMD-Ｎ，GSDMD-Ｎ與質(zhì)膜中的心磷脂、磷酸基肌醇和磷脂酰絲氨酸結(jié)合，從而在細(xì)胞膜上穿孔，誘導(dǎo)Ｋ＋外流，導(dǎo)致細(xì)胞焦亡［21］。HMGB1是一種非組蛋白核蛋白，在膿毒癥相關(guān)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［22］；當(dāng)LPS 入胞后，caspase-11 與GSDMD作為非經(jīng)典焦亡的關(guān)鍵蛋白及執(zhí)行蛋白在其發(fā)生的過(guò)程中發(fā)揮決定性作用［23］。為了觀(guān)察白花丹素是否通過(guò)抑制焦亡來(lái)減輕膿毒癥小鼠心肌損傷，本研究觀(guān)察了心肌形態(tài)學(xué)改變及相關(guān)酶學(xué)指標(biāo)變化。HE染色結(jié)果顯示，不同濃度白花丹素干預(yù)后，小鼠心肌損傷減輕，CK-MB、LDH、MDA、IL-18和IL-1β釋放減少，焦亡相關(guān)蛋白caspase-11、GSDMD、GSDMD-N及HMGB1表達(dá)減少。以上結(jié)果提示，一定濃度的白花丹素可顯著降低膿毒癥引起的氧化應(yīng)激和炎癥水平，并通過(guò)抑制細(xì)胞焦亡減輕心肌組織損傷。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門(mén)在生物網(wǎng)絡(luò)背景下研究疾病機(jī)制和藥物作用機(jī)制的新學(xué)科［24］，通過(guò)利用藥物、化合物、基因和疾病數(shù)據(jù)庫(kù)信息構(gòu)建藥物-靶點(diǎn)、靶點(diǎn)-疾病和藥物-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)，以揭示具有多靶點(diǎn)和多組分特征的中藥制劑的復(fù)雜機(jī)制［25］。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析出白花丹素-膿毒癥心肌損傷-焦亡有5個(gè)核心靶點(diǎn)，核心靶點(diǎn)包括STAT3、AKT1、Bcl-2、mTOR和NFKB1。其中，STAT3蛋白是炎癥反應(yīng)的主要介質(zhì)之一，STAT3信號(hào)通路的活化與多種炎癥疾病的發(fā)生密切相關(guān)，如潰瘍性結(jié)腸炎［26］、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎［27］及膿毒癥［28］等，STAT3信號(hào)通路在膿毒癥心功能障礙中亦發(fā)揮重要作用［29］。LPS處理小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞后，STAT3 與TRAF6 和TBK-1直接相互作用，導(dǎo)致STAT3第727位磷酸化。隨后，磷酸化的STAT3轉(zhuǎn)位到線(xiàn)粒體中，在LPS誘導(dǎo)的代謝重編程和體內(nèi)外炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生中發(fā)揮關(guān)聯(lián)關(guān)鍵作用［30］。下調(diào)CXCR5 可以抑制p38MAPK/NF- κB/STAT3信號(hào)傳導(dǎo)，減輕膿毒癥誘導(dǎo)的腦損傷［31］。本研究觀(guān)察到，CLP組小鼠心肌STAT3蛋白表達(dá)水平升高，不同濃度白花丹素干預(yù)后，STAT3蛋白表達(dá)水平降低，同時(shí)分子對(duì)接結(jié)果顯示，白花丹素與STAT3 結(jié)合能是-5.9Kcal/mol，結(jié)合能越低，表明結(jié)合效能越好。以上結(jié)果提示白花丹素可能通過(guò)抑制核心成分STAT3，減輕膿毒癥炎癥反應(yīng)和心肌損傷。

進(jìn)一步對(duì)白花丹素-膿毒癥心肌損傷-焦亡的潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能及KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，JAK-STAT信號(hào)通路參與其中。炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展與JAK2/STAT3信號(hào)通路密切相關(guān)。Xie等［32］揭示了白皮杉醇課通過(guò)直接抑制JAK2/STAT3 信號(hào)通路來(lái)改善膿毒癥后的心肌功能和炎癥；Zhen等［33］發(fā)現(xiàn)褪黑素可通過(guò)抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善細(xì)胞凋亡，減輕膿毒癥心肌受損。JAK/STAT信號(hào)通路可調(diào)節(jié)CLP誘導(dǎo)的膿毒癥大鼠模型的急性肺損傷，抑制JAK或STAT可減輕嚴(yán)重膿毒癥所致的急性肺損傷和致死性［34］。NLRP12 的過(guò)表達(dá)觸發(fā)早期HSV-1 感染和焦亡，通過(guò)JAK-STAT信號(hào)通路誘導(dǎo)IL-18的產(chǎn)生和激活下游抗病毒反應(yīng)［35］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也觀(guān)察到，CLP組小鼠心肌組織中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3增加，表明膿毒癥心肌受損與激活JAK2/STAT3 信號(hào)通路有關(guān)。經(jīng)不同劑量的白花丹素干預(yù)后，p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 表達(dá)均降低，表明白花丹素可能通過(guò)抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路，減少炎癥反應(yīng)和焦亡的發(fā)生，改善小鼠心肌損傷。

綜上所述，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)系統(tǒng)的分析明確白花丹素-膿毒癥心肌損傷-焦亡的關(guān)鍵靶點(diǎn)，GO和KEGG分析以及篩選得到了核心信號(hào)通路及分子機(jī)制。利用分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)行白花丹素與關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合驗(yàn)證，并通過(guò)在小鼠模型上驗(yàn)證，觀(guān)察到白花丹素可能通過(guò)調(diào)控JAK2-STAT3 通路減輕焦亡發(fā)生，改善膿毒癥心肌損傷。本研究可為白花丹素臨床應(yīng)用于膿毒癥心肌損傷治療提供研究依據(jù)，為相關(guān)藥物研發(fā)提供新的思路和方法。