人鼻粘膜類器官冠狀病毒感染模型可用于抗病毒藥物的篩選和評價

關(guān)鍵詞：類器官；鼻粘膜；病毒感染；疾病模型

雖然新型冠狀病毒大流行已經(jīng)結(jié)束，全球仍有新型變異毒株不斷出現(xiàn)，成為威脅人類健康的全球性公共健康問題。鼻腔作為病毒進(jìn)入人體的首要靶器官，其病毒感染方式、復(fù)制變異規(guī)律和致病機(jī)制尚不清楚［1， 2］。然而，傳統(tǒng)體外模型如2D培養(yǎng)的永生化鼻粘膜上皮細(xì)胞系缺乏組織結(jié)構(gòu)和生理功能［3， 4］，動物模型也存在與人的種屬差異大，成本高，通量低等限制［5-9］。

類器官是一種利用干細(xì)胞體外培養(yǎng)而成具有三維結(jié)構(gòu)的微器官［10-12］，具有與體內(nèi)高度相似的分子特征與組織結(jié)構(gòu)，并能部分模擬來源組織器官的生理功能?；谝陨蟽?yōu)勢，類器官近年被廣泛用于發(fā)育生物學(xué)研究、疾病建模、再生醫(yī)學(xué)與氣管移植研究、藥物發(fā)現(xiàn)、療效評估以及毒理學(xué)等的研究［13-15］。

目前已有許多研究使用呼吸道類器官分析冠狀病毒感染及其相關(guān)機(jī)制［16-19］。但將鼻粘膜類器官用于冠狀病毒感染相關(guān)研究尚未見報道。鼻粘膜類器官含有纖毛細(xì)胞、分泌細(xì)胞和基底細(xì)胞等多種細(xì)胞成分［20， 21］，具備典型的假復(fù)層柱狀纖毛上皮的組織學(xué)特征。其具有分泌功能的腺腔結(jié)構(gòu)，節(jié)律擺動的纖毛和粘液毯共同組成的粘液纖毛傳輸系統(tǒng)，可完整重現(xiàn)鼻粘膜的組織形態(tài)與功能。

本研究基于鼻粘膜類器官，采用包括新冠病毒在內(nèi)的兩種冠狀病毒對鼻粘膜類器官進(jìn)行感染，以期更真實地模擬病毒在鼻腔內(nèi)的感染過程；并建立了抗病毒藥物體外篩選與評價的技術(shù)體系，通過分子對接與三維結(jié)構(gòu)模擬，對藥物抗病毒機(jī)制進(jìn)行預(yù)測與研究。研究結(jié)果表明，鼻粘膜類器官可以作為抗病毒藥物開發(fā)的有力模型，用以推進(jìn)冠狀病毒感染人上呼吸道的相關(guān)基礎(chǔ)研究與藥物研發(fā)。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

本課題的樣本來源為南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院生物樣本庫凍存的鼻粘膜類器官。根據(jù)南方醫(yī)院生物樣本庫出入庫管理規(guī)定，填寫樣本提取申請表，提取凍存不超過1 年的鼻粘膜類器官樣本共14 例，復(fù)蘇成功率為85.7%（表1）。

Transwell 板、Matrigel（Corning）；IV型膠原酶、III型膠原酶（Worthington）；DNA酶、透明質(zhì)酸酶、分散酶、抗β-tubulin（sigma）；抗-MUC5AC、抗-ZO-1、抗-AQP5、抗-SFTPC、抗-CK5、抗-Sodium Potassium ATPase 抗體、山羊抗兔二抗（Abcam）。 類器官培養(yǎng)基主要細(xì)胞因子：R-Sponding1、 Noggin、Human EGF、不含Vit A的 B27、Y-27632、A83-01、SB202190 （Peprotech）、Nacetylcysteine、Nicotinamide（sigma）等；使用真空濾膜過濾除菌，4 ℃保存。佛手柑素（Bergamottin），卡莫司他（Camostat，MCE）；海腎熒光素酶報告基因檢測試劑盒（碧云天）。

相關(guān)引物均購自蘇州金唯智生物科技有限公司。qRT-PCR對差異表達(dá)miRNA的引物序列：

SARS-CoV-2 RBD （primers 5'-CAATGGTTTAACAGGCACAGG-3' 和5'-CTCAAGTGTCTGTGGATCACG-3'）。HCoV-OC43（primers 5'-ATGTTAGGCCGATAATTGAGGACTAT-3' 和5'-AATGTAAAGATGGCCGCGTATT-3'）。Human GAPDH （primers 5'- TCCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT-3' 和5'-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3'）

病毒：SARS-CoV-2假病毒（SARS-CoV-2 pv）是以VSV 為骨架外包SARS-CoV-2，WT株S蛋白的假病毒；人冠狀病毒OC43（HCoV-OC43 pv 病毒）；由武漢病毒所王薇教授團(tuán)隊提供。

病毒：SARS-CoV-2 WT（2019-nCoV-WIV04）、SARS-CoV-2（B. 1.1.7，IVCAS6.7552）、SARS-CoV-2（B.1.351，NPRC2.062100001）均由武漢病毒所國家病毒資源庫保藏中心提供，活病毒相關(guān)操作均在武漢病毒研究所生物安全三級實驗室進(jìn)行。

細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific），-80 ℃超低溫冰箱、生物安全柜（Biobase），全自動細(xì)胞計數(shù)儀（Bodboge），普通光學(xué)顯微鏡（Olympus），低速離心機(jī)（Eppendorf），熒光定量PCR儀（Thermo），多功能酶標(biāo)儀、高通量活細(xì)胞成像系統(tǒng)（BioTek），100 μm細(xì)胞過濾器（JET BIOFIL）。

1.2 人鼻粘膜類器官模型的建立培養(yǎng)和鑒定

用于培養(yǎng)人鼻粘膜類器官的組織均取自南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，相關(guān)研究均通過南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院倫理委員會倫理審批（倫理批號：NFSC-2020-157）。

無菌條件下將人鼻粘膜組織放入含1%青霉素和鏈霉素的4 ℃預(yù)冷HBSS溶液中清洗數(shù)次并置于冰盒上剪切至1 mm3的組織塊，在37 ℃下在已修改配制的消化酶中消化2 h。消化后，用100 μm細(xì)胞過濾器過濾上清液，并以200 g離心5 min。將細(xì)胞重新懸浮在培養(yǎng)基中，并與Matrigel以1∶1.5（v/v）的比例混合，隨后滴入Transwell板中，加入擴(kuò)增培養(yǎng)基并每2～3 d更換新鮮培養(yǎng)基。我們使用酶消化法和機(jī)械分離法相結(jié)合，每培養(yǎng)7 d對鼻粘膜類器官進(jìn)行傳代處理，傳代過程中，鼻粘膜類器官或被消化為2～3個細(xì)胞團(tuán)，或被吹散解離為多個片段，最終形成多個完整的類器官結(jié)構(gòu)，并于此后體積逐漸增大。

1.3 鼻粘膜類器官病毒感染模型的建立

將鼻粘膜類器官按2.0×104/孔的細(xì)胞密度接種至96孔板，100 μL/孔，放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，待細(xì)胞活性良好時進(jìn)行實驗。將待感染的病毒液加入96 孔板，放入37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中感染2 h。2 h后吸出病毒液，替換成100 μL類器官培養(yǎng)基，放置37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。使用熒光顯微鏡觀察病毒感染情況；海腎熒光素酶法檢測假病毒的感染情況；收集Matrigel外培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)病毒RNA的檢測。

1.3.1 鼻粘膜類器官對SARS-CoV-2 毒株易感性的研究 分別將3D培養(yǎng)的鼻粘膜類器官按照細(xì)胞密度約2.0×104/孔鋪入96孔板，100 μL/孔，放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，待細(xì)胞活性良好時進(jìn)行實驗。制備SARS-CoV-2假病毒和HCoV-OC43假病毒，將病毒液分別加入96孔板中，每孔感染體積為30 μL，放入37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中感染2 h，2 h后吸出病毒液，替換成100 μL類器官培養(yǎng)基，放置37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h；收集Matrigel外培養(yǎng)液，采用熒光定量PCR檢測進(jìn)行培養(yǎng)液中病毒RNA檢測含量變化。

分別設(shè)置高感染復(fù)數(shù)組（MOI=10）與低感染復(fù)數(shù)組（MOI=1）的感染條件，將病毒液加入鼻粘膜類器官中，放入37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別感染2 h、24 h。感染后吸出病毒液，替換成100 μL類器官培養(yǎng)基，放置37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h；收集Matrigel 外培養(yǎng)液，進(jìn)行培養(yǎng)液中病毒RNA檢測。

1.3.2 免疫熒光法病毒感染鑒定鑒定實驗 病毒感染24 h 后，棄去培養(yǎng)基及基質(zhì)膠， 離心收集類器官沉淀，4%甲醛固定，將樣本進(jìn)行脫水梯度脫水，之后進(jìn)行透明和浸蠟。包埋切片，將鼻粘膜類器官石蠟切片脫蠟、水化后，轉(zhuǎn)移至PBS溶液中清洗3次/5 min，滴加3%過氧化氫，洗去殘留于切片的抗原修復(fù)液；滴加血清封閉液，室溫靜置20 min，滴加病毒核衣殼蛋白（NP）一抗4 ℃過夜（稀釋比例1∶200）。次日，放入37 ℃烘箱復(fù)溫45 min；移入PBS洗去一抗，滴加二抗37 ℃（稀釋比例1∶500），1 h，PBS洗去二抗，DAPI染核，移入PBS洗去殘留于切片上的DAPI，防淬滅膠封片。通過高內(nèi)涵細(xì)胞定量成像分析系統(tǒng)分析。

1.4 鼻粘膜類器官用于藥物的抗病毒功效作用的驗證

選擇活性良好的鼻粘膜類器官，用Tryple在低溫環(huán)境下進(jìn)行類器官消化。待類器官消化至20～30 μm的細(xì)胞團(tuán)時終止消化，離心收集細(xì)胞，將Matrigel與培養(yǎng)基按1∶1.5的體積比例混合，然后加入細(xì)胞懸液。細(xì)胞密度應(yīng)保持在1.0×105/mL。在96 孔板中每孔接種一個20 μL的膠滴，轉(zhuǎn)移到37 ℃的培養(yǎng)箱中，倒置30 min，以提高類器官的立體性。每孔加入100 μL類器官培養(yǎng)基，置于37 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長情況，在傳代后的2～3 周后，可以將樣品帶入P3 實驗室。使用類器官培養(yǎng)基稀釋藥物，在感染前1h 將維持培養(yǎng)基換為含藥物培養(yǎng)基。使用SARS-CoV-2 WT感染鼻粘膜類器官，在膠滴外加入病毒原液，感染2 h 后換為含藥物的培養(yǎng)基，在37 ℃培養(yǎng)至感染后4 h 收樣。棄去膠滴外的培養(yǎng)基，使用500 μL 的Trizol 裂解膠滴。通過qPCR實驗檢測病毒載量，以評估藥物對病毒感染的抑制效果。

1.5 分子對接

本實驗采用人源ACE2 蛋白三維結(jié)構(gòu)（PDB ID：1o86）作為生物大分子結(jié)構(gòu)，并使用ChemDraw軟件繪制佛手柑素、卡莫司他與賴諾普利的三維分子結(jié)構(gòu)，使用iGEMDOCK軟件［22］對潛在的小分子抑制劑與ACE2蛋白進(jìn)行分子對接實驗，分析其潛在結(jié)合位點(diǎn)并計算結(jié)合能，并通過PyMol軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析與繪制。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

所獲得的數(shù)據(jù)均進(jìn)行了3次及以上的重復(fù)驗證，數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，使用 GraphPad Prism 8.0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。當(dāng)兩組實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行比較時，采用t-test分析，多組比較，采用單因素方差分析，以Plt;0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鼻粘膜類器官的長期培養(yǎng)

按照上述培養(yǎng)體系將鼻粘膜組織切割消化后，細(xì)胞在EGF、Wnt-3a 等基本生長因子存在的條件下持續(xù)的快速生長形成細(xì)胞團(tuán)，培養(yǎng)3 d直徑即可從20 μm生長至200 μm左右實心球或空心泡狀結(jié)構(gòu)（圖1）。鼻粘膜類器官的傳代效率（1∶3）和持續(xù)擴(kuò)增時間可達(dá)到6個月以上，實現(xiàn)了對鼻粘膜類器官的連續(xù)傳代和長期擴(kuò)增。HE染色顯示鼻粘膜類器官與來源組織的具有高度一致性（圖1）。

2.2 鼻粘膜類器官可感染SARS-CoV-2 假病毒和HCoV-OC43假病毒

與對照組相比，HCoV-OC43假病毒和SARS-CoV-2假病毒感染組的病毒mRNA 的表達(dá)升高（Plt;0.001，圖2），證明成功建立人鼻粘膜上皮類器官感染SARSCoV-2（BSL-3）及同屬β冠狀病毒科人易感的冠狀病毒HCoV-OC43（BSL-2）模型。

2.3 熒光定量PCR法檢測鼻粘膜類器官可感染SARSCoV-2 活病毒

通過對不同病毒暴露載量的測試，發(fā)現(xiàn)MOI=10感染的上清中的SARS-CoV-2的拷貝數(shù)高于MOI=1的類器官上清中的拷貝數(shù)，說明病毒暴露載量和鼻粘膜細(xì)胞病毒感染率、復(fù)制傳播能力呈正相關(guān)（P=0.027）。SARS-CoV-2活病毒感染類器官24 h后，培養(yǎng)基上清中拷貝數(shù)，高于感染2 h后上清拷貝數(shù)，（圖3A）。

不同變異株，包括新冠原始株（WT）、alpha變異株、beta 變異株、delta 變異株和Omicron 變異株檢測，結(jié)果顯示感染后2 h，病毒拷貝數(shù)升高至在105～106 copies/mL，感染后24 h 更換培養(yǎng)基后，病毒拷貝數(shù)輕度升高（Plt;0.05，圖3B）。

2.4 免疫組化及免疫熒光檢測鼻粘膜類器官可感染SARS-CoV-2 的細(xì)胞類型

免疫組織化學(xué)（IHC）結(jié)果顯示鼻粘膜類器官中的冠狀病毒感染關(guān)鍵蛋白ACE2及TMPRSS2的均有表達(dá)（圖4A），具備病毒感染的基本條件。進(jìn)而，免疫熒光實驗顯示，病毒衣殼蛋白主要在鼻粘膜類器官的杯狀細(xì)胞表達(dá)（圖4B）。

2.5 抗病毒藥物對鼻粘膜類器官中新型冠狀病毒感染具有抑制效果

在3 μmol/L濃度下，卡莫司他可出現(xiàn)劑量依賴性的抑制SARS-CoV-2感染鼻粘膜類器官的效果；在濃度為0.11 μmol/L時，即可達(dá)到抑制效果（P=0.0003，圖5A）。佛手柑素可劑量依賴的抑制SARSCoV-2在鼻粘膜類器官中的感染，50 μmol/L的佛手柑素對SARS-CoV-2 的抑制效果顯著（Plt;0.0001，圖5B）。

2.6 抗病毒藥物對鼻粘膜類器官中新型冠狀病毒感染具有抑制效果

分子對接實驗顯示佛手柑素（圖6A）與卡莫司他（圖6B）均能與人ACE2 蛋白有較強(qiáng)的結(jié)合能力，跟已知的小分子抑制劑賴諾普利具有相同的結(jié)合口袋（圖6C，D），其結(jié)合能稍弱于賴諾普利，但仍有很好的結(jié)合強(qiáng)度（圖6E）。

3 討論

鼻腔是呼吸道病毒的首要靶器官，鼻粘膜既是病毒入侵與復(fù)制的第一站，也是免疫反應(yīng)的激活點(diǎn)。作為新冠病毒感染的首個損傷部位，鼻粘膜類器官成為研究其感染機(jī)制的理想模型［9］。假病毒是通過重組技術(shù)構(gòu)建的，具備野生病毒的結(jié)構(gòu)和特征，但不具自我復(fù)制能力的病毒學(xué)研究的重要工具［23］，其生物安全性高，且可引入報告基因，便于檢測。HCoV-OC43 和SARS-CoV-2均為β冠狀病毒，前者在1967年首次被分離，能引發(fā)人類及動物的多種疾?。?4， 25］。我們利用假病毒感染實驗，驗證鼻粘膜類器官對冠狀病毒的穩(wěn)定易感性。

鼻粘膜由柱狀纖毛細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和基底細(xì)胞構(gòu)成，其中ACE2和TMPRSS2的高表達(dá)，使其成為新冠病毒的主要感染與復(fù)制部位。病毒通過杯狀細(xì)胞的分泌和纖毛細(xì)胞的擺動傳播［26， 27］。因此鼻粘膜不僅是病毒的靶器官，也是高效傳播的源頭。

接著我們進(jìn)一步驗證了鼻粘膜類器官能夠被SARS-CoV-2 野生病毒感染，且病毒暴露載量（MOI=1和MOI=10）和鼻粘膜細(xì)胞病毒感染率、復(fù)制傳播能力呈正相關(guān)。免疫熒光實驗顯示，病毒衣殼蛋白主要在鼻粘膜類器官的杯狀細(xì)胞表達(dá)，說明杯狀細(xì)胞對新冠病毒的易感性高于其他細(xì)胞類型，這與其他感染實驗中的研究結(jié)果一致［27］。由于杯狀細(xì)胞具有分泌功能，新冠病毒基因產(chǎn)物在杯狀細(xì)胞的高表達(dá)，提示病毒可能在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)復(fù)制，并被隨分泌物排出，進(jìn)入培養(yǎng)基。通過SARS-CoV-2 活病毒單次感染鼻粘膜類器官后，培養(yǎng)基上清中病毒基因拷貝數(shù)不斷增加，說明病毒不但能夠有效感染，而且隨著類器官的生長不斷復(fù)制擴(kuò)增，并對外分泌病毒顆粒。這進(jìn)一步說明鼻粘膜類器官能夠模擬病毒從侵入細(xì)胞、到胞內(nèi)復(fù)制、分泌傳播的完整生命周期。

此外，研究發(fā)現(xiàn)卡莫司他能夠阻斷SARS-CoV- 2刺突蛋白介導(dǎo)的膜融合，抑制病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞［28］。同時，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)佛手柑素通過降低病毒RNA合成，抑制病毒復(fù)制，顯著降低感染動物鼻甲及肺組織中的病毒滴度［29］。本研究結(jié)果表明，兩者在鼻粘膜類器官中均顯示出良好的抗病毒活性，可以顯著降低病毒對鼻粘膜類器官的感染能力。最后，本研究還通過分子對接實驗，預(yù)測卡莫司他與佛手柑素可能通過結(jié)合ACE2蛋白，阻斷其與冠狀病毒S蛋白結(jié)合，從而抑制病毒對鼻粘膜細(xì)胞的感染。這些結(jié)果也證實鼻粘膜類器官病毒感染模型用于藥物評價的可行性。

成人鼻粘膜面積可達(dá)150 cm2，具有豐富的血液循環(huán)，適合經(jīng)鼻給藥，操作方便且吸收迅速［30-33］，新冠疫情后，多種鼻腔給藥的抗病毒藥物進(jìn)入研發(fā)，但臨床前模型的缺陷仍是主要瓶頸。有些企業(yè)高價采購靈長類動物，而有的研究者則用人類腸道類器官進(jìn)行測試［16］。成功建立鼻粘膜感染模型后，我們具備了低成本、高通量的藥物評價手段，可以快速測試多種藥物的抗病毒效果。

綜上，本研究建立的鼻粘膜類器官新冠病毒感染模型，具有高仿生和人源化特征，適用于新冠病毒感染機(jī)制的研究與抗病毒藥物的篩選，為經(jīng)鼻給藥的預(yù)防和治療提供了新的思路與實驗證據(jù)。