孤立性側(cè)腦室擴(kuò)張?zhí)涸袐D羊水外泌體miRNA差異表達(dá)譜

關(guān)鍵詞：孤立性側(cè)腦室擴(kuò)張；羊水；外泌體；微小RNA

側(cè)腦室擴(kuò)張（VM）是胎兒發(fā)育中大腦側(cè)腦室液體過(guò)量所致［1］，它是產(chǎn)前超聲檢查中最常見(jiàn)的腦部異常，是胎兒腦發(fā)育異常的標(biāo)志之一［2］。正常側(cè)腦室寬度在中晚期較穩(wěn)定，為6～8 mm，產(chǎn)前超聲檢測(cè)側(cè)腦室內(nèi)徑≥10 mm時(shí)，稱為側(cè)腦室擴(kuò)張［3］。胎兒側(cè)腦室擴(kuò)張的發(fā)病率為0.78%～2.20%，其原因多樣，感染、畸形、染色體異常、腦脊液循環(huán)障礙、腦室周圍損傷都會(huì)導(dǎo)致胎兒腦室擴(kuò)張。孤立性側(cè)腦室擴(kuò)張是指產(chǎn)前超聲檢查中除側(cè)腦室擴(kuò)張外未發(fā)現(xiàn)任何其他顱內(nèi)或顱外畸形［4］。目前研究顯示［5］，側(cè)腦室嚴(yán)重?cái)U(kuò)張者和持續(xù)進(jìn)展的側(cè)腦室擴(kuò)張者易合并其他顱內(nèi)畸形和染色體疾病，是造成胎兒流產(chǎn)和死產(chǎn)的原因之一，出生后神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常的風(fēng)險(xiǎn)也明顯增高。

外泌體廣泛存在于外周血液、唾液、尿液、腦脊液、腹水等人體各種體液中，含量較高且容易獲取。外泌體攜帶的蛋白質(zhì)，微小RNA（miRNA）和其它RNA片段，能夠參與細(xì)胞之間的物質(zhì)傳導(dǎo)和信號(hào)交流［6］。自2007年Valadi等［7］首次報(bào)道外泌體中的miRNA和轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（mRNA）是細(xì)胞間遺傳交換的一種新機(jī)制以來(lái)，學(xué)者對(duì)外泌體miRNA的研究逐漸深入。相比較mRNA，富集于外泌體中的miRNA更穩(wěn)定，不容易被內(nèi)源性核糖核酸酶降解，這些特性使外泌體miRNA可作為最佳的生物標(biāo)志物。在孕婦妊娠過(guò)程中，臍血，胎盤(pán)，羊水和羊膜都可以分泌外泌體，可作為孕期新的診斷標(biāo)志物和治療靶標(biāo)［8］。羊水是羊膜腔內(nèi)包圍胎兒的動(dòng)態(tài)的生物液體，是胎兒胃腸道、肺部、胎盤(pán)和羊膜細(xì)胞的分泌物，為胎兒提供所需的機(jī)械保護(hù)和營(yíng)養(yǎng)［9］，羊水的轉(zhuǎn)錄組學(xué)可作為潛在的胎兒疾病的指導(dǎo)［10］。外泌體是重要的生物學(xué)功能的介質(zhì)，可以反映親本細(xì)胞的健康狀況。因此，羊水中的外泌體可提供重要的診斷信息［11］。近年來(lái)，雖然外泌體的研究已廣泛開(kāi)展，但羊水外泌體miRNA的研究還非常有限。目前報(bào)道的有對(duì)唐氏綜合癥胎兒孕婦羊水外泌體miRNA的差異表達(dá)譜分析［12， 13］，對(duì)先天性腎盂積水孕婦羊水外泌體miRNA的研究［14， 15］，室間隔缺損胎兒孕婦羊水外泌體的全轉(zhuǎn)錄組分析［16］，對(duì)子癇和正常妊娠孕婦的羊水外泌體標(biāo)志物表達(dá)的檢測(cè)來(lái)探討子癇表型和羊水外泌體miRNA的關(guān)聯(lián)［17］，及對(duì)嚴(yán)重先天性膈疝胎兒患者的孕婦羊水和胎兒氣管液體外泌體miRNA的特征及與產(chǎn)后結(jié)局的關(guān)聯(lián)分析［18］，目前國(guó)內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)側(cè)腦室擴(kuò)張?zhí)涸袐D羊水外泌體miRNA的相關(guān)研究報(bào)道。側(cè)腦室擴(kuò)張可以影響胎兒或新生兒神經(jīng)發(fā)育及預(yù)后，它是評(píng)估神經(jīng)系統(tǒng)功能的重要指標(biāo)之一。側(cè)腦室擴(kuò)張?zhí)旱呐R床轉(zhuǎn)歸和神經(jīng)發(fā)育預(yù)后是臨床關(guān)注的熱點(diǎn)，目前的研究主要集中在產(chǎn)前診斷、遺傳學(xué)原因，妊娠結(jié)局和出生后的神經(jīng)發(fā)育，側(cè)腦室擴(kuò)張?zhí)涸诋a(chǎn)前胎兒發(fā)育過(guò)程中的發(fā)病機(jī)制的研究還很少。由于羊水中的外泌體miRNA可以反映胎兒的疾病情況，且人體miRNA中70%為神經(jīng)源性miRNA，其與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的關(guān)聯(lián)非常密切［19］。本研究對(duì)側(cè)腦室擴(kuò)張和正常胎兒孕婦羊水外泌體的miRNA表達(dá)譜進(jìn)行分析，篩選差異表達(dá)miRNA，采用實(shí)時(shí)定量qPCR技術(shù)驗(yàn)證差異表達(dá)，并利用雙熒光素酶活性檢測(cè)技術(shù)分析目的miRNA和靶基因的調(diào)控關(guān)系，為進(jìn)一步研究胎兒側(cè)腦室擴(kuò)張的發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)歸提供理論基礎(chǔ)和新思路。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象

羊水標(biāo)本收集于南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，患者為2021年9月～2024年5月在我院胎兒醫(yī)學(xué)門(mén)診就診的孕婦，均具有行羊膜腔穿刺術(shù)的指征。納入標(biāo)準(zhǔn)：病例組為產(chǎn)前超聲檢查提示胎兒側(cè)腦室中度擴(kuò)張≥12 mm的單胎妊娠孕婦，對(duì)照組為穿刺原因僅為唐篩高風(fēng)險(xiǎn)或高齡的孕婦。排除標(biāo)準(zhǔn)為：雙胎妊娠；合并其他腦部發(fā)育異常；孕婦具妊娠合并癥及并發(fā)癥；染色體核型和基因芯片檢測(cè)染色體異常；羊水檢測(cè)TORCH感染陽(yáng)性。研究對(duì)象共17 例，病例組9 例（年齡25.5±3.8 歲，孕周28.5±2.8 周），對(duì)照組8 例（年齡31.3±7.6 歲，孕周19.4±2.0周）。本研究經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批號(hào)：NFEC-202109-K15），所有參與者均已簽署知情同意書(shū)。

1.2 研究方法

1.2.1 羊水外泌體的分離 超凈工作臺(tái)中取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)組照羊水樣本8 mL，2000×g，4 ℃，20 min 離心；取上清，10 000×g，4 ℃，30 min 離心；取上清，過(guò)0.45 μm濾膜；過(guò)濾液100 000×g，4 ℃，70 min 離心；去掉上清，10 mL 預(yù)冷的PBS 重懸，然后100 000×g，4 ℃，70 min 再次離心；去掉上清，150 μL預(yù)冷的PBS重懸；所得即為外泌體溶液。

1.2.2 羊水外泌體的鑒定

1.2.2.1 磷鎢酸負(fù)染透射電子顯微鏡法觀察外泌體形態(tài)移液器吸取10 μL外泌體懸液樣本到Parafilm 封口膜上，載膜銅網(wǎng)正面朝下，自然吸附懸液10～15 min，濾紙條吸除多余液滴，晾干；移液器吸取2%磷鎢酸溶液10 μL，滴于封口膜上，吸附完成的銅網(wǎng)正面倒扣在染色液上靜置3～5 min；濾紙條吸除多余液滴，白熾燈下晾干；透射電子顯微鏡下觀察拍照。

1.2.2.2 ZetaView納米顆粒跟蹤分析技術(shù)檢測(cè)外泌體的粒徑和濃度 純水清洗樣本池，標(biāo)準(zhǔn)品聚苯乙烯微球（100 nm PS beads）校準(zhǔn)，校準(zhǔn)完成后1×PBS 清洗樣本池，樣本用1×PBS 稀釋后加入到樣本池，ZetaViewParticle Metrix（PMX-120）觀察外泌體顆粒實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)影像。

1.2.2.3 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)外泌體標(biāo)志蛋白 外泌體與RIPA裂解液按體積1∶1 混勻，冰上裂解10 min，4 ℃以12 000 g離心5 min取上清，按照BCA蛋白測(cè)定試劑盒（Beyotime，增強(qiáng)型）說(shuō)明書(shū)檢測(cè)外泌體總蛋白。取15 μL上清約15 μg總蛋白上樣，行SDS-PAGE（10%），電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF 膜，5% 脫脂奶粉的TBST 封閉1 h，分別加入TSG101（DLM 1∶1000）；CD9（DLM 1∶500）；CD63（DLM 1∶2000）；和CD81（Proteintech 1∶1000）抗體，4 ℃搖床孵育過(guò)夜。第2天用TBST洗膜后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗HRPconjugatedAffinipure Goat Anti-Mouse IgG（H+L）（Proteintech1∶6000），室溫孵育30min，TBST 洗膜3次，5 min/次，ECL（Share-bio，SB-WB011）發(fā)光成像。Image Lab 圖像分析軟件對(duì)每個(gè)條帶灰度值進(jìn)行定量分析。

1.2.3 羊水外泌體的miRNA測(cè)序和生物信息學(xué)分析采用HiPure 總RNA 小量抽提試劑盒（美基生物）提取外泌體總RNA。miRNA 測(cè)序文庫(kù)制備用QIAseqTM miRNA Library Kit 文庫(kù)制備試劑盒（QIAGEN）。文庫(kù)制備完成后，對(duì)構(gòu)建好的文庫(kù)使用illuminaNovaSeq6000 進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序讀長(zhǎng)為雙端2×150 bp。通過(guò)對(duì)原始數(shù)據(jù)過(guò)濾得到可信的目標(biāo)序列，對(duì)這些序列的質(zhì)量、長(zhǎng)度及樣品間公共序列進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。對(duì)樣本組和對(duì)照組表達(dá)miRNA做歸一化處理，使其表達(dá)水平在同一量級(jí)，即歸一化表達(dá)量（TPM），TPM=（miRNA表達(dá)量/標(biāo)本總表達(dá)量）×106。采用ANOVA對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組對(duì)已知miRNA進(jìn)行差異表達(dá)分析，閾值log2FC的絕對(duì)值大于1和Plt;0.05判斷兩組樣品之間的表達(dá)量是否存在顯著性差異。對(duì)高表達(dá)的顯著上下調(diào)前20 個(gè)已知miRNA 采用targetscan，miRanda 和PITA軟件預(yù)測(cè)靶基因。對(duì)目的miRNA靶基因的集合進(jìn)行Gene Ontology富集分析，包括基因的分子功能，細(xì)胞組成和參與的生物過(guò)程。并對(duì)候選靶基因進(jìn)行KEGG代謝通路分析，通過(guò)信號(hào)通路顯著性富集分析，確定候選靶基因參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

1.2.4 qPCR 驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果 挑選3 個(gè)在對(duì)照和樣本組間顯著差異表達(dá)，具高表達(dá)，經(jīng)文獻(xiàn)檢索可能和胎兒側(cè)腦室擴(kuò)張相關(guān)的基因及信號(hào)通路有關(guān)聯(lián)的miRNA進(jìn)行qPCR 驗(yàn)證，包括let-7b-5p，miR-122-5p 和miR-146a-5p。使用Trizol 提取外泌體總RNA，根據(jù)TaqManTM 的miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)miRNA qRT-PCR TB Green@說(shuō)明書(shū)進(jìn)行定量分析，以rRNA-U6 為內(nèi)參，采用2-△△CT法計(jì)算各組miRNA 的相對(duì)表達(dá)量。目的miRNAs 和U6 的引物序列如下：let-7b-5p，CGTGAGGTAGTAGGTTGTGTGGTT；miR-146a-5p，CGTGAGAACTGAATTCCATGGGTT；miR-122-5p，CGTGGAGTGTGACAATGGTGTTTG；miRNA通用反向引物，AGTGCAGGGTCCGAGGTATT；U6-S，CTCGCTTCGGCAGCACA，U6-A，AACGCTTCACGAATTTGCGT。

1.2.5 通過(guò)雙熒光報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)miR-122-5p 對(duì)AKT3和CCD88C的調(diào)控作用 采用生物學(xué)軟件預(yù)測(cè)，結(jié)合文獻(xiàn)檢索與腦室擴(kuò)張相關(guān)的基因及全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，預(yù)測(cè)miR-122-5p 可能調(diào)控的靶基因有AKT3 和CCDC88C，評(píng)估m(xù)iR-122-5p 靶向調(diào)控這兩個(gè)基因的可能性。根據(jù)預(yù)測(cè)的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合位點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)AKT3 3'UTR WT、AKT3 3'UTR mut、CCDC88C3'UTR WT和CCDC88C 3'UTR mut 序列，克隆至雙熒光素酶報(bào)告載體pmirGLO的BglII-SalI 雙酶切位點(diǎn)中進(jìn)行酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至EPI400感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行酶切驗(yàn)證和一代測(cè)序驗(yàn)證。熒光素酶活性鑒定是采用Lipo2000轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒，復(fù)蘇293T細(xì)胞，接種于6孔板中，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，使之第2天能達(dá)到70%～90%匯合度。采用miR-122-5p體外模擬物（mimics）轉(zhuǎn)染，構(gòu)建miR-122 上調(diào)表達(dá)模型。miR-122-5p mimics及其陰性對(duì)照物（NC），AKT3-3' UTR-WT/mut、CCDC88C-3' UTR-WT/mut（賽索飛生物）。將miR-122-5p mimics/ mimics NC分別與重組載體AKT3 WT/mut， CCDC88C WT/mut 共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染分組為mimics NC+AKT3-WT，miR-122-5pmimics+AKT3-WT，mimics NC+AKT3-mut，miR-122-5p mimics+AKT3-mut；mimics NC+CCDC88C-WT，miR-122-5p mimics+CCDC88C-WT，mimics NC+CCDC88C-mut 和miR-122-5p mimics+CCDC88Cmut。轉(zhuǎn)染48 h后，參照Duo-Luciferase Assay Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。miR-122-5p 序列與AKT3和CCDC88C基因的3'UTR野生型和突變型的合成序列見(jiàn)表1。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩樣本構(gòu)成比的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用四格表資料的卡方檢驗(yàn)，采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析處理。兩組樣本均數(shù)比較采用兩個(gè)獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，多變量采用F檢驗(yàn)，采用GraphPad Prism8 進(jìn)行分析，以Plt;0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有的實(shí)驗(yàn)都是獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 羊水外泌體鑒定

透射電鏡下，外泌體的形態(tài)學(xué)特征為小囊泡，大小不等，具有明顯的脂質(zhì)雙分子層，直徑約為30～100nm，透射電鏡下，負(fù)染色顯示對(duì)照和樣本中檢測(cè)到茶托狀的外泌體（圖1A）。Western blotting 檢測(cè)兩組羊水外泌體標(biāo)志蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組羊水外泌體均表達(dá)CD9、CD63、CD81、TSG101，且表達(dá)水平一致（圖1B）。納米顆粒檢測(cè)，對(duì)照樣本C2 的顆粒檢測(cè)濃度為3.0×107 /mL，稀釋倍數(shù)30 000，原始濃度為9.1×1011/mL，Median（×50）為153.0nm。實(shí)驗(yàn)樣本AFS042的顆粒檢測(cè)濃度為2.9×107/mL，稀釋倍數(shù)10 000，原始濃度為2.9×1011 /mL，Median（×50）為145.8 nm（ 圖1C）。

2.2 兩組羊水外泌體miRNA差異表達(dá)情況

測(cè)序結(jié)果顯示，側(cè)腦室擴(kuò)張和對(duì)照組存在272個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中43 個(gè)miRNA 上調(diào)，229 個(gè)miRNA下調(diào)；對(duì)照平均表達(dá)量大于20 TPM的有90 個(gè)差異表達(dá)miRNA，21 個(gè)上調(diào)，69 個(gè)下調(diào)。表達(dá)量上調(diào)的TOP20和下調(diào)的TOP 20個(gè)，共40個(gè)miRNAs在對(duì)照和病例組中的表達(dá)豐度熱圖，紅色為上調(diào)，藍(lán)色為下調(diào)（圖2）。

2.3 qPCR驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果

側(cè)腦室擴(kuò)張組的miR-122-5p 較對(duì)照組顯著降低（P=0.028），與測(cè)序結(jié)果一致。miR-146a-5p 較對(duì)照組上調(diào)，與測(cè)序組結(jié)果一致，但差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.693）。let-7b-5p 較對(duì)照組下調(diào)，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.249），與測(cè)序結(jié)果相反（圖3）。

2.4 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果

重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染48 h 后，熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果（圖4）。在293T 細(xì)胞中，miR-122-5p 過(guò)表達(dá)對(duì)AKT33'UTR-WT 熒光素酶的活性與空白對(duì)照組（mimicsNC+AKT3-WT）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.958）；miR-122-5p 過(guò)表達(dá)對(duì)AKT3 3'UTR-mut 熒光素酶的活性與空白對(duì)照組（mimics NC+AKT3-mut）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.093）；miR-122-5p 過(guò)表的AKT3-WT和AKT3-mut熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.929）。對(duì)于CCDC88C，miR-122-5p過(guò)表達(dá)對(duì)CCDC88C 3'UTR-WT熒光素酶的活性與空白對(duì)照組（mimics NC+CCDC88C-WT）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.836）；miR-122-5p 過(guò)表達(dá)對(duì)CCDC88C 3'UTR-mut 熒光素酶的活性與空白對(duì)照組（mimics NC+CCDC88C-mut）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.170） ；miR-122-5p 過(guò)表的CCDC88C-WT 和CCDC88C-mut 熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.418）。

2.5 TOP40差異表達(dá)miRNAs靶基因預(yù)測(cè)和生物學(xué)功能

對(duì)于TOP40差異表達(dá)miRNAs的調(diào)控靶基因進(jìn)行GO和KEGG分析，發(fā)現(xiàn)歸屬GO條目里富集顯著的有：細(xì)胞組分上的質(zhì)膜（GO：0005886），膜（GO：0016020）和細(xì)胞外圍（GO：0071944）；發(fā)揮的分子功能有核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性（GO：0001071），跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性（GO：0022857），轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性（GO：0005215），DNA 結(jié)合（GO：0003677）和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（GO：0008134）相關(guān)；參與的生物學(xué)過(guò)程中有定位（GO：0051179），發(fā)育過(guò)程（GO：0032502），移動(dòng)（GO：0040011），細(xì)胞分化、遷移、定位和發(fā)育過(guò)程（GO：0030154，0048870，0051674，0048869），神經(jīng)系統(tǒng)過(guò)程（GO：0050877），跨膜運(yùn)輸（GO：0055085）等。KEGG信號(hào)通路顯著性分析顯示前20的通路主要包括：MAPK信號(hào)通路、cGMP-PKG信號(hào)通路，趨化因子信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、配體-受體神經(jīng)活性互作、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)通路、細(xì)胞粘附分子、Wnt信號(hào)通路、軸突引導(dǎo)即神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中軸突生長(zhǎng)的方向和路徑的調(diào)控過(guò)程等（圖5）。

3 討論

miRNA是一類高度保守的內(nèi)源性小RNA，miRNA的種類非常有限，人體中大約有2654 種成熟的人類miRNA，每個(gè)miRNA可以識(shí)別并沉默多個(gè)mRNA，而多個(gè)miRNA也可以沉默同一個(gè)mRNA。miRNA最經(jīng)典的調(diào)控方式是直接結(jié)合到mRNA 3'端非翻譯區(qū)，導(dǎo)致mRNA降解，在轉(zhuǎn)錄后翻譯水平調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá)。外泌體中轉(zhuǎn)運(yùn)的miRNA非常安全穩(wěn)定，miRNA到達(dá)靶細(xì)胞仍能保持功能活性。目前人體外泌體miRNA的研究主要集中在腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和心血管疾?。?0］。丁凱澤等［12］對(duì)唐氏綜合征羊水miRNA的特征表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)15個(gè)差異表達(dá)miRNA，其中有4個(gè)miRNA在本研究也發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)，包括miR-30a，miR-323a-3p，miR-329-3p和與let-7e同屬let-7家族的let-7d?？沦I(mǎi)春等［13］的研究在唐篩綜合征胎兒孕婦羊水中驗(yàn)證的5種21號(hào)染色體編碼的外泌體miRNA中也包含了3種本研究檢測(cè)發(fā)現(xiàn)的let-7，miR-155和miR-802。Xie等［14］對(duì)胎兒先天性腎阻塞病例羊水外泌體miRNA研究中表達(dá)顯著下降的miR-122-5p，miR-299-3p，miR-299-5p，miR-320a，miR-379-5p，miR-493-5p，miR-548t和miR-585，在本研究中都有顯著下調(diào)，除了miR-30a上調(diào)。Fabietti等［18］在胎兒先天性膈疝病例的羊水外泌體中檢測(cè)到的顯著增加的miR-190-5p，miR-379-5p 和miR-889-3p，在本研究中也有顯著差異表達(dá)，說(shuō)明miRNA在羊水外泌體廣泛存在，并且有一些共同的差異表達(dá)miRNAs，這些共性miRNAs可能在胎兒的發(fā)育中具廣泛調(diào)控機(jī)體生物學(xué)功能的特點(diǎn)，包括細(xì)胞分化、凋亡、炎癥及免疫反應(yīng)，結(jié)合孕婦血清中miRNA的研究，有潛力作為臨床診斷胎兒疾病及孕婦妊娠期疾病的生物標(biāo)志物。腦室擴(kuò)張外泌體miRNA的研究，目前已報(bào)道的有先天性腦積水，但都是在腦脊液中的研究［21， 22］。胎兒側(cè)腦室后角寬度≥15 mm時(shí)為腦積水。Chen等［21］對(duì)腦積水的病人和對(duì)照的腦脊液外泌體進(jìn)行分離和表達(dá)譜測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)31個(gè)差異表達(dá)miRNAs，26 個(gè)上調(diào)5 個(gè)下調(diào)，其中包括本研究的羊水外泌體中也存在顯著差異表達(dá)的miR-130b-3p，miR-134-5p，miR-136-5p，miR-137，miR-181a，miR-320a，miR-320b，miR-320c，miR-320d，miR-1298 和let-7，表明羊水和腦脊液的外泌體具有共同的顯著差異表達(dá)miRNAs，個(gè)別miRNA在腦脊液和羊水外泌體中的表達(dá)上下調(diào)不一致，可能是由于樣本例數(shù)和個(gè)體差異導(dǎo)致，特別是異質(zhì)性比較高的疾病。腦脊液的樣本在產(chǎn)前無(wú)法獲得，而羊穿已成為成熟而廣泛使用的產(chǎn)前診斷技術(shù)。雖然腦脊液更能反映腦室擴(kuò)張miRNA的表達(dá)情況，但從羊水中挖掘?qū)ふ页龊湍X脊液外泌體中共同作用的相關(guān)miRNAs，可為進(jìn)一步探討產(chǎn)前胎兒腦室擴(kuò)張的分子作用機(jī)制提供更便捷的研究載體。

本研究發(fā)現(xiàn)的TOP40差異表達(dá)miRNA，let-7是細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，作為一個(gè)遠(yuǎn)古的致死m(xù)iRNA，在動(dòng)物的生存進(jìn)化史上對(duì)生存和發(fā)育起著必需的作用。let-7 已被發(fā)現(xiàn)靶向調(diào)控Trim71 基因，是先天性腦積水的致病基因［23］。let-7和本研究的另一個(gè)TOP40差異表達(dá)miR-155參與的生物學(xué)通路都是對(duì)BACH1活性起調(diào)節(jié)作用，BACH1 在大多數(shù)哺乳動(dòng)物組織中廣泛表達(dá)，BACH1活性的增加可以激活A(yù)KT/mTOR信號(hào)通路［24］，PI3K-AKT-mTOR通路參與神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞增值、凋亡等過(guò)程，在神經(jīng)系統(tǒng)中普遍存在且發(fā)揮重要作用，有研究表明PI3K/Akt通路的過(guò)度激活可導(dǎo)致小鼠腦室的過(guò)度擴(kuò)張繼而導(dǎo)致腦積水［25］。miR-181c作用的生物學(xué)通路是NOTCH的前轉(zhuǎn)錄和翻譯，miR-181c在高度甲基化時(shí)，會(huì)導(dǎo)致NOTCH2/4和KRAS的表達(dá)增加［26］，上調(diào)的NOTCH信號(hào)通路促進(jìn)室管膜細(xì)胞的增殖，從而導(dǎo)致導(dǎo)水管狹窄和腦積水［27］。miR-181c還可能參與MAPK調(diào)節(jié)通路［28］，p38 MAPK是神經(jīng)細(xì)胞凋亡調(diào)控的重要通路，其表達(dá)強(qiáng)弱與神經(jīng)細(xì)胞存活密切相關(guān)，而ERK/MAPK通路的激活可以觸發(fā)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生，星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生可能會(huì)引起腦積水的發(fā)生［29， 30］。miR-215參與的生物學(xué)通路是調(diào)節(jié)RUNX1的表達(dá)活性，RUNX1基因是miR-215的直接靶點(diǎn)，miR-215的異常表達(dá)會(huì)降低RUNX1 啟動(dòng)子的熒光素酶活性，下調(diào)RUNX1 的表達(dá)。RUNX1作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，它能直接或間接調(diào)節(jié)多個(gè)信號(hào)通路，包括TGF-β信號(hào)通路，BMP 信號(hào)通路和Wnt信號(hào)通路［31］。TGF-β通路在腦積水形成過(guò)程中起重要的作用，活化后可以啟動(dòng)胞內(nèi)一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使得多種膠原等細(xì)胞外基質(zhì)合成增多及腦膜纖維化［32］。Wnt信號(hào)通路則在多種組織細(xì)胞活化及纖維化中起重要作用，有研究報(bào)道在腦積水大鼠模型中Wnt/β-catenin 通路活性增高，抑制β-catenin的表達(dá)可以減輕大鼠模型反應(yīng)膠質(zhì)的增生，減緩腦積水的形成［33］。miR-452 的直接靶基因是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）［34］，VEGFA已被證明是腦積水患者腦脊液中的炎癥標(biāo)志物之一［35］。miR-134則是一種富集于大腦的miRNA，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、突觸可塑性、神經(jīng)炎癥和凋亡等多種過(guò)程，在各種神經(jīng)過(guò)程中起重要的作用。miR-134-5p 已報(bào)道的靶基因也是VEGFA［36］，它參與的信號(hào)通路有miR-134-5p/Itgb1/MAPK通路［37］和ITGB1/MMP2/PI3K/Akt通路［38］。此外，Chen等［21］的研究指出，上調(diào)的hsa-miR-130b-3p 可能介導(dǎo)與腦積水相關(guān)的磷酸酶和張力蛋白同源基因（PTEN）的下調(diào)。

本研究采用qPCR對(duì)顯著差異的miRNA中高表達(dá)的3 個(gè)miRNA 進(jìn)行驗(yàn)證，miRNA-122-5p 和miRNA-146a-5p與測(cè)序結(jié)果一致，而let-7b-5p與測(cè)序結(jié)果相反，原因可能是由于測(cè)序和qPCR是兩種不同的技術(shù)方法，原理和計(jì)算公式均不同。qPCR檢測(cè)目標(biāo)miRNA的表達(dá)是利用莖環(huán)狀引物進(jìn)行miRNA的反轉(zhuǎn)錄，然后再進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。測(cè)序法是通過(guò)miRNA文庫(kù)構(gòu)建、簇生成及上機(jī)測(cè)序，一次獲得數(shù)百萬(wàn)條miRNA序列，然后再將reads 比對(duì)到參考基因組、miRBase 上，計(jì)算miRNA表達(dá)量。qPCR是靶向檢測(cè)一種miRNA，測(cè)序是同時(shí)檢測(cè)多個(gè)miRNA，受文庫(kù)和測(cè)序深度影響，且本研究有些樣本在全轉(zhuǎn)錄測(cè)序?qū)嶒?yàn)中已經(jīng)用完，驗(yàn)證只做了其中的8個(gè)樣本和8個(gè)對(duì)照，臨床樣本個(gè)體差異較大，兩種檢測(cè)方法的結(jié)果會(huì)出現(xiàn)不一致的情況。

本研究經(jīng)qPCR驗(yàn)證在腦室擴(kuò)張樣本組中顯著下降的miR-122 是一種在肝組織中高峰度表達(dá)的miRNA［39］，但近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)miR-122-5p 調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞，有研究表明大鼠顱腦受傷后腦組織miR-122-5p 表達(dá)下降，神經(jīng)元凋亡增加，神經(jīng)功能受損［40］。有研究發(fā)現(xiàn)［41］，在創(chuàng)傷性腦外傷小鼠模型中，miR-122-5p的表達(dá)顯著下調(diào)，而NLRP3炎癥小體表達(dá)顯著上調(diào)；在細(xì)胞模型中，miR-122-5p抑制劑減輕小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，顯著促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞從M1（促炎）向M2（抗炎）表型轉(zhuǎn)化；抑制miR-122-5p的表達(dá)，可以抑制NLRP3炎癥小體激活和NFｋB磷酸化，這兩個(gè)都是典型的炎癥信號(hào)通路，與神經(jīng)毒性有關(guān)。有研究報(bào)道m(xù)iR-122 可以通過(guò)靶向RUNX2促進(jìn)線粒體凋亡通路的激活，促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡［42］。另有研究發(fā)現(xiàn)，腦出血小鼠模型中miR-122-5p通過(guò)破壞MLLT1/PI3K/AKT信號(hào)通路的破壞促進(jìn)外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥［43］。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的腦室擴(kuò)張相關(guān)信號(hào)通路，預(yù)測(cè)miR-122-5p可能靶向AKT3，CCDC88C基因。AKT3是AKT激酶家族之一，AKT激酶是細(xì)胞信號(hào)中響應(yīng)胰島素和生長(zhǎng)因子的調(diào)控因子。AKT3 在大腦中廣泛存在，其缺失可以造成小頭畸形，重復(fù)可造成巨頭畸形［44］。研究報(bào)道體內(nèi)實(shí)驗(yàn)敲除miR-122-5p，通過(guò)MLLT1/PI3K/AKT信號(hào)通路，降低腦出血小鼠外周血和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)弄能受損和炎癥［43］，但作用的靶基因是MLLT1。CCDC88C 是Wnt 信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子，Wnt信號(hào)通路在胚胎發(fā)育、組織維持和腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。CCDC88C基因突變是已知的導(dǎo)致胎兒先天性腦積水致病基因，但具體作用機(jī)制不明［45］。本研究的熒光素酶活性測(cè)定結(jié)果，在AKT3-WT組中，miR-122過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的熒光素酶活性較NC 組無(wú)顯著差異；在AKT3-mut 組中，過(guò)表miR-122 的細(xì)胞素酶活性與NC組也無(wú)顯著差異的改變，說(shuō)明miR-122-5p不靶向AKT3 的3'端非翻譯區(qū)。在CCDC88C-WT 組中，轉(zhuǎn)染miR-122 過(guò)表達(dá)后細(xì)胞熒光素酶活性較NC組下降，但差異不顯著；在CCDC88C-mut 組中，過(guò)表達(dá)miR-122 后細(xì)胞熒光酶活性較NC 組也無(wú)明顯改變，說(shuō)明miR-122-5p 也不靶向于CCDC88C 的3'端非翻譯區(qū)。雖然本研究未找到miR-122-5p 的靶向基因，但提示miR-122-5p不靶向AKT3和CCDC88C，在以后的研究需更進(jìn)一步的生物學(xué)信息學(xué)分析和更多的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，本研究首次報(bào)道了側(cè)腦室擴(kuò)張?zhí)汉驼Ｌ貉蛩饷隗w中的顯著差異表達(dá)miRNAs，發(fā)現(xiàn)了在側(cè)腦室擴(kuò)張?zhí)喊l(fā)育過(guò)程中可能起調(diào)控作用的外泌體miRNAs，包括let-7，miR-122，miR-130，miR-134，miR-145，miR-155，miR-181c，miR-215 和miR-452，這些差異表達(dá)miRNAs 主要通過(guò)MAPK， PI3KAkt和Wnt 信號(hào)通路參與腦室擴(kuò)張的發(fā)病過(guò)程，具體的靶基因和調(diào)控作用的途徑和機(jī)制仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。其次，對(duì)比分析了胎兒其它病種孕婦羊水外泌體，及腦積水病人在腦脊液和孕婦羊水外泌體中的差異表達(dá)miRNAs。腦室擴(kuò)張?zhí)涸袐D羊水外泌體中這些高峰度差異顯著miRNAs 的發(fā)現(xiàn)為miRNA調(diào)控胎兒腦室擴(kuò)張的分子機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)，并提供了新的思路和方向。