miR-204-5p通過靶向負(fù)性調(diào)控RAB22A促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為

關(guān)鍵詞：miR-204-5p；RAB22A；膀胱癌

目前，膀胱癌是最常見的惡性腫瘤之一，也是癌癥死亡的主要原因之一［1］。根據(jù)2018 年GLOBOCA數(shù)據(jù)，膀胱癌導(dǎo)致了199 922人死亡，占所有癌癥死亡人數(shù)的2.1%。同年，膀胱癌新發(fā)病例549 393 例，占所有癌癥新發(fā)病例的3.0%［2］。盡管膀胱癌的預(yù)后已得到明顯改善，但由于早期診斷率低以及缺乏針對晚期患者的有效療法，其總體生存率仍然很低［3，4］。吸煙和一些致癌化合物是膀胱癌的主要危險(xiǎn)因素［5］，但這些因素并不足以導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，這表明探究遺傳因素參與腫瘤的重要性［6， 7］。

MicroRNA是長約25-nt 的單鏈ncRNA分子。它們與兩種蛋白質(zhì)（GW182蛋白和AGO2蛋白）結(jié)合會產(chǎn)生一種稱為miRNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（miRISC）［8］。在該復(fù)合物中，miRNA與目標(biāo)mRNA的3'UTR中的互補(bǔ)序列結(jié)合，并抑制其轉(zhuǎn)錄后翻譯成蛋白質(zhì)［9］。先前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種miRNA調(diào)控了膀胱癌的發(fā)展和進(jìn)展［10， 11］。確定膀胱癌中的關(guān)鍵遺傳因子可為開發(fā)靶向療法提供新的途徑［ 12］。多項(xiàng)研究表明，miR-204-5p調(diào)控多種惡性腫瘤的發(fā)展［ 13-15］。miR-204-5p 參與了多種信號級聯(lián)，包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3 和Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［16］。這些研究闡述了miR-204-5p作為惡性腫瘤潛在生物標(biāo)志物的作用，但miR-204-5p 在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中的作用及其對膀胱癌生物學(xué)行為的影響和下游的相關(guān)信號因子的機(jī)制仍然未知。因此，在膀胱癌中miR-204-5p的內(nèi)在機(jī)制和潛在靶基因的深入研究仍迫在眉睫。

本研究從表達(dá)和細(xì)胞功能兩方面研究了miR-204-5p對膀胱癌的影響。此外，還利用轉(zhuǎn)錄組測序和生物信息學(xué)方法預(yù)測了RAB22A為miR-204-5p 的靶基因，并研究了 miR-204-5p/RAB22A的作用機(jī)制。總之，本課題為miR-204-5p在膀胱癌中的分子機(jī)制提供了新的視角，并為基于該機(jī)制的潛在治療策略提供了參考。

1 材料和方法

1.1 材料及試劑

正常人尿路上皮細(xì)胞系SV-HUC-1在含有10%胎牛血清的F-12K培養(yǎng)基中培養(yǎng)，膀胱癌細(xì)胞系T24、J82和5637細(xì)胞在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。RPMI 1640培養(yǎng)基、F-12K培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素抗體和胰蛋白酶（Gibco）。

1.2組織樣本

膀胱癌組織和癌旁組織取自蚌埠醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2017年12月～2020年12月的36例膀胱癌患者，患者均知情同意。他們均未接受術(shù)前放療或術(shù)前化療。所有標(biāo)本均按照倫理和法律標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行處理，通過蚌埠醫(yī)科大學(xué)倫理審核（倫理批號：倫科批字［2022］第324號）。

1.3 生物信息學(xué)分析

從TCGA 數(shù)據(jù)庫（//https：//www. cancer.gov/tcga）下載與BLCA相關(guān)的差異表達(dá)miRNA數(shù)據(jù)集，生存分析、臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析、單因素和多因素Cox分析，用到的包主要包括如下：survival，survminerclusterProfiler、org.Hs.eg.db等。

1.4 過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

含有 miR-204-5p 和RAB22A過表達(dá)構(gòu)建體的質(zhì)粒由吉瑪公司（中國上海）生產(chǎn)。細(xì)胞按照生產(chǎn)商的方案進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將細(xì)胞分為inhibitor-NC組、miR-204-5pinhibitor 組、mimics-NC 組、miR-204-5p mimics 組、miR-204-5p mimics+OE-NC組和miR-204-5p mimics+OE-RAB22A。

1.5 qRT-PCR測定

使用 Trizol 試劑從組織和細(xì)胞中分離出總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA）。在95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性20 s，60 ℃ 退火 20 s，共40 個循環(huán)后，用2-ΔΔCt法計(jì)算目標(biāo)基因的相對表達(dá)量。引物設(shè)計(jì)使用引物5.0設(shè)計(jì)的引物，由吉瑪公司（中國上海）合成生產(chǎn)（表1）。

1.6 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（KeyGEN Biotech）進(jìn)行CCK-8檢測，以評估轉(zhuǎn)染對細(xì)胞增殖的影響。用96孔板培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后48 h收獲的細(xì)胞，懸液100 μL/孔。每個轉(zhuǎn)染組設(shè)3個重復(fù)孔。在上述條件下培養(yǎng)細(xì)胞，在細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束前4 h每孔加入10 μL的CCK-8。24 h/次測量光密度值A(chǔ)450nm，直至72 h，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.7 Transwell小室法

細(xì)胞以2.0×106/mL 的濃度在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在24孔板中插入Transwell小室，小室裝入200 μL懸浮液，基底側(cè)小室裝入600 μL含20% FBS的培養(yǎng)基。24 h 后，移除腔室，用4%多聚甲醛固定穿透膜的細(xì)胞20 min，然后用0.1%結(jié)晶紫染色15 min。每張膜隨機(jī)選取5個區(qū)域進(jìn)行計(jì)數(shù)（放大倍數(shù)×20）。用于侵襲試驗(yàn)的 Transwell 室預(yù)先加入Matrigel膠，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)

通過FITC Annexin V染色檢測細(xì)胞凋亡。獲取細(xì)胞并用冰冷的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）清洗，用 FITCAnnexin V 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（BD Pharmingen）進(jìn)行染色，使用 FACScan 儀器（Beckman Coulter）分析細(xì)胞，并使用 WinMDI 2.9 測量數(shù)據(jù)。

1.9 轉(zhuǎn)錄組測序分析

收集轉(zhuǎn)染mimics-NC和miR-204-5p-mimics 后的T24 細(xì)胞，每組各3 個樣本，TRIzol 試劑分離總RNA，Nanodrop分光光度計(jì)檢測RNA樣品的純度、濃度和完整性，進(jìn)行文庫構(gòu)建，加入Fragmentation Buffer 將mRNA進(jìn)行隨機(jī)打斷，以mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成第1 條cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第2條cDNA鏈，利用AMPure XP 磁珠純化cDNA，純化的雙鏈cDNA再進(jìn)行末端修復(fù)、加A 尾并連接測序接頭，然后用AMPure XP磁珠進(jìn)行片段大小選擇，最后通過PCR富集得到cDNA文庫，不同文庫按照目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量進(jìn)行混合，用Illumina平臺進(jìn)行測序。

1.10 Western blotting

收集細(xì)胞，用 NP-40緩沖液提取總蛋白，進(jìn)行 SDSPAGE分析。用放射免疫沉淀測定緩沖液（50 mmol/LTris-HCl，pH 7.4，150 mmol/L NaCl，1% Triton X-100，1% 脫氧膽酸鈉，0.1% SDS，正釩酸鈉，氟化鈉，EDTA和亮普?。┭心ゼs20 mg的組織。在每個孔中加入總量為20 μg 的蛋白質(zhì)。在10%或12% SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離蛋白質(zhì)。使用 Image J 軟件對蛋白質(zhì)水平進(jìn)行量化。

1.11 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

構(gòu)建RAB22A野生型及突變型質(zhì)粒，將細(xì)胞接種于6 孔板中，分別或同時(shí)轉(zhuǎn)染RAB22A 野生型質(zhì)粒、RAB22A 突變型質(zhì)粒、mimics-NC 和 miR-204-5pmimics ，用雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒檢測各組熒光素酶活性。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

基因表達(dá)數(shù)據(jù)經(jīng)過對數(shù)轉(zhuǎn)換和歸一化處理后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并使用R軟件3.6.2和Perl 語言包繪制圖表。SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件和GraphPad Prism9 用于分析和處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)差異，Plt;0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MiR-204-5p 在膀胱癌中表達(dá)上調(diào)，且與臨床預(yù)后呈正相關(guān)

TCGA數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果顯示miR-204-5p低表達(dá)患者的中位生存期明顯高于miR-204-5p 高表達(dá)患者（Plt;0.05，圖1A），Wilcoxon 符號秩檢驗(yàn)分析了臨床病理特征與 miR-204-5p 之間的關(guān)系（Plt;0.05，圖1B～F），單因素Cox分析分析表明，miR-204-5p表達(dá)與不良OS顯著相關(guān)（P=0.030017），其他與生存不良有關(guān)的臨床病理變量包括年齡、T 期和M期，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05，圖1G）。多因素Cox分析分析表明，miR-204-5p 基因表達(dá)與不良OS 顯著相關(guān)（P=0.0079）。其他方面與生存不良有關(guān)的臨床病理變量包括年齡和N期，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05，圖1H）。qRT-PCR 表明miR-204-5p 在膀胱癌組織中的表達(dá)量上調(diào)（Plt;0.05，圖2A）。與正常尿路上皮細(xì)胞 SV-HUC-1 相比，3 種膀胱癌細(xì)胞系（T24、J82、5637）中 miR-204-5p 的表達(dá)也有所上升（Plt;0.05，圖2B）。

2.2 miR-204-5p對膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

轉(zhuǎn)染 miR-204-5p mimics 后，與對照組相比，T24細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)（圖3A，Plt;0.01）。與對照組相比，過表達(dá)miR-204-5p 導(dǎo)致T24 細(xì)胞凋亡率下降（Plt;0.05，圖3B）。過表達(dá)miR-204-5p 增強(qiáng)了T24 的遷移和侵襲能力（Plt;0.05，圖3C），敲低miR-204-5p 后則相反（Plt;0.05，圖3）。

2.3 miR-204-5p和RAB22A的靶向關(guān)系

通過3個在線數(shù)據(jù)庫分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有123個基因在3 個數(shù)據(jù)庫中均顯示受miR-204-5p 靶向調(diào)控，并且RAB22A的表達(dá)受miR-204-5p 靶向負(fù)性調(diào)控，兩者之間存在結(jié)合位點(diǎn)（Plt;0.05，圖4A～C）。qRT-PCR 和Western blotting 結(jié)果表明，在過表達(dá)miR-204-5p 后，RAB22A的表達(dá)量明顯降低（Plt;0.05，圖4D～F）。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)的結(jié)果同樣證明miR-204-5p 與RAB22A之間存在結(jié)合位點(diǎn)（Plt;0.05，圖5）。

2.4 MiR-204-5p 靶向RAB22A對膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響

過表達(dá)RAB22A后，與單純過表達(dá)miR-204-5p相比，T24細(xì)胞的增殖能力減弱（Plt;0.05，圖6A）。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，過表達(dá)RAB22A 后，T24 細(xì)胞凋亡率上升（Plt;0.05，圖6B）。同樣過表達(dá)RAB22A部分逆轉(zhuǎn)了miR-204-5p 增強(qiáng)的細(xì)胞遷移和侵襲能力（Plt;0.05，圖6C）。

3 討論

膀胱癌是一種常見的人類惡性疾病，起源于膀胱內(nèi)表面的上皮細(xì)胞，以發(fā)病率高、死亡率高、發(fā)病率高和預(yù)后差而聞名［1， 3］。據(jù)估計(jì)，全球每年新發(fā)膀胱癌病例超過42萬例，因膀胱癌死亡的人數(shù)超過16萬，尤其是在男性和生活在不發(fā)達(dá)國家的人群中［17］。盡管近年來出現(xiàn)了多種新的診斷和治療方法，包括經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)、根治性膀胱切除術(shù)、化療、放療和免疫療法，但膀胱癌，尤其是肌層浸潤性膀胱癌的5 年生存率（lt;60%）仍然很低，因此深入了解驅(qū)動惡性腫瘤的潛在分子機(jī)制將有利于當(dāng)前和未來的治療。

miRNA具有組織特異性表達(dá)模式，在大多數(shù)癌癥中其表達(dá)往往失調(diào)。許多miRNA在大多數(shù)癌癥中發(fā)揮致癌基因或抑癌基因的作用，具體取決于癌癥組織類型［18］。miR-204-5p通過靶向HER2 抑制胃癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移［19］，miR-204-5p 在乳腺癌中被表觀遺傳沉默［20］，這些表明miR-204-5p-5p 具有抑制腫瘤的功能。miR-204-5p對不同腫瘤的不同甚至相反作用可能是由其多個靶基因造成的，在膀胱癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中的功能仍有待進(jìn)一步確定。因此本研究以miR-204-5p為研究對象證明了miR-204-5p在膀胱癌組織和細(xì)胞中上調(diào)，高級別的膀胱癌患者miR-204-5p表達(dá)明顯優(yōu)于低級別的膀胱癌患者，并且與膀胱癌患者的不良預(yù)后相關(guān)。通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了miR-204-5p在膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡中的作用。結(jié)果顯示，miR-204-5p 在體外促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力，抑制凋亡。以上結(jié)果表明miR-204-5p在膀胱癌中高表達(dá)并促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

而miR-204-5p 作為一種促癌因子，其對膀胱癌的調(diào)控機(jī)制仍然未知，其游的靶向分子和作用機(jī)制需要進(jìn)一步的挖掘。RAB22A屬于Ras超家族，其編碼基因位于染色體20q13.32。RAB22A 是腦中Ras 相關(guān)蛋白（Rabs）GTPase 亞家族的一部分，屬于小GTP 結(jié)合蛋白［21］。Zhou 等［22］報(bào)道，RAB22A參與了內(nèi)細(xì)胞途徑的多個水平，質(zhì)膜受體的組成受內(nèi)細(xì)胞循環(huán)和內(nèi)細(xì)胞攝取的調(diào)控。抑制RAB22A功能的小干擾RNA會阻斷內(nèi)吞載體對轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和主要組織相容性復(fù)合體-I（MHC）-I 的再循環(huán)［23］。內(nèi)吞失調(diào)是多種癌癥的特征［24， 25］，因此，RAB22A異常表達(dá)可能與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)。我們對過表達(dá)miR-204-5p的膀胱癌細(xì)胞的進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，測序結(jié)果表明，在過表達(dá)miR-204-5p后RAB22A的表達(dá)顯著下調(diào)，并且在具有miR-204-5p 堿基結(jié)合位點(diǎn)的3個在線生物信息學(xué)分析中，miR-204-5p存在于RAB22A的3'UTR區(qū)域。同時(shí)，分子生物學(xué)和雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-204-5p和RAB22A之間的靶向關(guān)系。在此基礎(chǔ)上，再次進(jìn)行了拯救實(shí)驗(yàn)，證明RAB22A過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-204-5p對膀胱癌的腫瘤促進(jìn)作用，即miR-204-5p通過負(fù)調(diào)節(jié)RAB22A來促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。

本研究也存在一些不足之處：miR-204-5p 以及RAB22A的下游是否存在其他的調(diào)控機(jī)制，通過何種信號通路來促進(jìn)膀胱癌的進(jìn)展；本研究的實(shí)驗(yàn)對象僅針對膀胱癌細(xì)胞，仍需通過在體實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-204-5p 對膀胱癌的調(diào)控作用。

綜上，本研究建立了膀胱癌細(xì)胞中miR-204-5p 與RAB22A之間的功能聯(lián)系，并表明miR-204-5p 可通過靶向RAB22A來促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。本研究為了解miRNAs 在促進(jìn)膀胱癌中的機(jī)制提供了新的視角。因此，靶向miR-204-5p 可能是未來診斷和治療膀胱癌的一種有前景的策略。