多色免疫組織化學(xué)技術(shù)在腫瘤標(biāo)志物分析中的研究進(jìn)展

摘要 多色免疫組織化學(xué)（Multiplex immunohistochemistry， mIHC）技術(shù)是一種新型多靶點(diǎn)病理組織染色、成像及分析技術(shù)。該技術(shù)通過(guò)在單張組織切片上檢測(cè)多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平及空間分布，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的表型、組成、形態(tài)及細(xì)胞間相互作用機(jī)理的全面解析。近年來(lái)， mIHC 技術(shù)被成功應(yīng)用于腫瘤免疫研究領(lǐng)域，為腫瘤的診斷和治療開(kāi)辟了新的途徑。本文從近年開(kāi)發(fā)的mIHC 檢測(cè)技術(shù)出發(fā)，針對(duì)不同類型mIHC技術(shù)的檢測(cè)原理及其特點(diǎn)進(jìn)行了詳細(xì)闡述，重點(diǎn)討論了新型mIHC 檢測(cè)技術(shù)在腫瘤標(biāo)志物及腫瘤微環(huán)境檢測(cè)等領(lǐng)域中的應(yīng)用，并對(duì)mIHC 在腫瘤免疫診斷和治療領(lǐng)域的應(yīng)用前景和發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞 多色免疫組織化學(xué)；熒光多色標(biāo)記；腫瘤診斷；循環(huán)熒光成像；評(píng)述

2018 年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)分別授予了美國(guó)得州大學(xué)免疫學(xué)家詹姆斯·艾利森（James P Allison）教授和日本京都大學(xué)本庶佑（Tasuku Honjo）教授，以表彰他們發(fā)現(xiàn)“負(fù)性免疫調(diào)節(jié)”治療癌癥的療法。這徹底顛覆了以往人類對(duì)抗腫瘤的策略，標(biāo)志著腫瘤免疫治療進(jìn)入了一個(gè)新的歷史階段。目前上市的腫瘤免疫治療藥物雖然效果很好，但是存在價(jià)格高、整體應(yīng)答率較低以及部分患者的不良反應(yīng)較大等缺點(diǎn)。以免疫檢查點(diǎn)PD-1/PD-L1 單抗為例，其在腫瘤治療中的臨床整體應(yīng)答率僅有20%～30%，無(wú)法實(shí)現(xiàn)有針對(duì)性的靶向用藥，造成醫(yī)療資源浪費(fèi)，限制了其在腫瘤治療中的應(yīng)用[1-3]。腫瘤免疫微環(huán)境（Tumorimmune microenvironment， TIME）生物標(biāo)志物與免疫治療反應(yīng)息息相關(guān)。因此，治療腫瘤的關(guān)鍵是制定針對(duì)不同病人的個(gè)體化腫瘤精準(zhǔn)免疫治療方案。然而。由于TIME 呈現(xiàn)明顯腫瘤異質(zhì)性，而且面臨多種細(xì)胞類型并存、各種細(xì)胞因子相互作用以及免疫抑制的復(fù)雜狀況，依賴于對(duì)單一標(biāo)志物的檢測(cè)難以全面、深入和精準(zhǔn)地描繪TIME 的全貌[4-9]。為了實(shí)現(xiàn)腫瘤精準(zhǔn)免疫治療，亟需開(kāi)發(fā)高效且精準(zhǔn)的免疫組織化學(xué)（免疫組化）技術(shù)用于臨床免疫診斷中腫瘤標(biāo)志物及TIME 的精準(zhǔn)檢測(cè)[10-12]。

目前，采用多色免疫組織化學(xué)（Multiplex immunohistochemistry， mIHC）技術(shù)對(duì)免疫組織化學(xué)標(biāo)志物及腫瘤微環(huán)境檢測(cè)的總結(jié)性文章已有報(bào)導(dǎo)，如Tan 等[13]介紹了幾種已經(jīng)臨床應(yīng)用的mIHC 技術(shù)，詳細(xì)比較了mIHC 聯(lián)合熒光免疫檢測(cè)法（Immunofluorescence， IF）、芯片細(xì)胞術(shù)、基于DNA 條形碼的mIHC/IF、多重IHC/IF 分析方案以及三維（3D）成像等mIHC 技術(shù)在免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry， IHC）標(biāo)志物檢測(cè)中的差異。但是，該文并沒(méi)有對(duì)一些新開(kāi)發(fā)的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行介紹。Wilson 等[14]對(duì)通過(guò)mIHC 研究TIME 時(shí)的數(shù)據(jù)預(yù)處理、質(zhì)量控制和分析方法等方面進(jìn)行了綜述，側(cè)重于分析過(guò)程和數(shù)據(jù)處理的介紹。Hoyt 等[15]介紹了多重免疫熒光技術(shù)（Multiplex immunofluorescence， mIF）的原理、技術(shù)方法以及檢測(cè)數(shù)據(jù)的優(yōu)化分析過(guò)程，并探討了其臨床應(yīng)用潛力。迄今為止，針對(duì)最新開(kāi)發(fā)的mIHC 及其創(chuàng)新點(diǎn)、局限性和應(yīng)用潛力等方面的綜述性文章還未見(jiàn)報(bào)道。本文詳細(xì)闡述了近十年發(fā)展起來(lái)的mIHC 技術(shù)的檢測(cè)原理、創(chuàng)新點(diǎn)以及不足之處，重點(diǎn)討論了這些檢測(cè)技術(shù)在免疫組織化學(xué)腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)等領(lǐng)域中的應(yīng)用，并展望了新型mIHC 技術(shù)在腫瘤免疫診斷中的發(fā)展前景和趨勢(shì)。

1 IHC技術(shù)

傳統(tǒng)的IHC 技術(shù)是應(yīng)用免疫學(xué)抗原-抗體反應(yīng)，對(duì)組織或細(xì)胞內(nèi)抗原或抗體等物質(zhì)進(jìn)行定性分析和定位的技術(shù)，是描述腫瘤微環(huán)境空間組學(xué)信息的常見(jiàn)手段，在臨床病理診斷中應(yīng)用廣泛。目前，發(fā)展較成熟的IHC 技術(shù)是使用酶或熒光標(biāo)記的抗體對(duì)福爾馬林固定且石蠟包埋的樣本（Formalin-fixed andparrffin-embedded， FFPE）進(jìn)行染色。該方法能標(biāo)記1～3 種抗體，但不能完整地反映IHC 腫瘤標(biāo)志物的種類及進(jìn)行TIME 的檢測(cè)，導(dǎo)致患者錯(cuò)失可能的精準(zhǔn)化免疫治療機(jī)會(huì)。雖然該方法可采用多種抗體標(biāo)記及連續(xù)切片技術(shù)提高對(duì)多種組分和多個(gè)方位的檢測(cè)能力，但連續(xù)切片并不能在完全相同的細(xì)胞層面進(jìn)行解析，增加了漏檢機(jī)率，還會(huì)丟失空間位置信息，不利于待檢蛋白質(zhì)的精準(zhǔn)定位，費(fèi)時(shí)費(fèi)力且需消耗大量的樣本。

2 mIHC技術(shù)

近年來(lái)，隨著IHC 及檢測(cè)儀器的發(fā)展，研究者開(kāi)發(fā)了mIHC 技術(shù)。mIHC 是利用免疫學(xué)和細(xì)胞化學(xué)的原理，在同一張切片上同時(shí)或先后采用不同顏色的熒光素或酶促產(chǎn)物原位顯示組織或細(xì)胞內(nèi)不同大分子抗原物質(zhì)的一項(xiàng)多標(biāo)記染色技術(shù)（圖1）[16]。目前，該技術(shù)可在一張組織切片上同時(shí)完成8～20 種甚至更多種類IHC 標(biāo)志物的檢測(cè)，大大提高了抗原分型和篩選的效率。mIHC 可直接評(píng)估腫瘤和TIME 中多種細(xì)胞的表型及空間關(guān)系，精確反映TIME 的免疫狀態(tài)，不僅能節(jié)省檢測(cè)時(shí)間、提高對(duì)稀有組織標(biāo)本的利用率，更能幫助研究人員全面、深入和精準(zhǔn)地了解腫瘤局部組織和微環(huán)境信息[17-18]。根據(jù)mIHC 的檢測(cè)結(jié)果可以準(zhǔn)確了解TIME 中腫瘤抗原表達(dá)和生長(zhǎng)特征、浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞的數(shù)量、表型和功能狀態(tài)以及細(xì)胞因子種類和表達(dá)量，并依此制定針對(duì)特定腫瘤的免疫治療方案[19-20]。目前，多表位配體法[21]、連續(xù)免疫過(guò)氧化物酶標(biāo)記和清除法[22]、循環(huán)免疫熒光法[23]、多重免疫熒光法[24]、酪胺信號(hào)放大法[25]、交換反應(yīng)信號(hào)放大法[26]、數(shù)字空間分析法[27]和質(zhì)譜流式細(xì)胞成像[28]等新技術(shù)被應(yīng)用到mIHC 研究中，大大推動(dòng)了mIHC 技術(shù)的發(fā)展，使得mIHC 成為腫瘤精準(zhǔn)免疫治療、單細(xì)胞測(cè)序及TIME 研究的重要手段，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景[19-20]。

2.1 多表位配體技術(shù)

常用的商業(yè)化染料（如eFluor 和AmCyan 等）的熒光發(fā)射譜較寬，染料之間有光譜重疊，導(dǎo)致可同時(shí)識(shí)別的熒光探針數(shù)量有限。為提高分析通量，研究人員發(fā)展了多種基于不同熒光信號(hào)移除技術(shù)的多色循環(huán)免疫熒光成像方法。多表位配體法（Multiepitope ligand cartography， MELC）是一種基于高通量熒光顯微鏡實(shí)現(xiàn)對(duì)亞細(xì)胞水平蛋白標(biāo)志物識(shí)別和量化的方法。MELC 首先采用熒光標(biāo)記抗體選擇性結(jié)合組織樣品中的蛋白標(biāo)志物，通過(guò)熒光成像實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白標(biāo)志物空間位置的選擇性標(biāo)記，得到熒光圖像后，通過(guò)光漂白去除熒光標(biāo)記物，再應(yīng)用另一組標(biāo)記抗體對(duì)相應(yīng)分子定位成像[16]。重復(fù)多次該步驟可得到多種蛋白標(biāo)志物分子定位圖（圖2）[21]。Eckhardte 等[29]運(yùn)用該技術(shù)標(biāo)記單一組織切片中的主要目標(biāo)細(xì)胞，檢測(cè)淋巴或骨髓中各種細(xì)胞活性及分化狀態(tài)。該方法有望用于研究轉(zhuǎn)基因小鼠自身免疫性腦脊髓炎病變或評(píng)估人類多發(fā)性硬化癥治療潛在靶點(diǎn)的藥物反應(yīng)性。但是，該方法用于檢測(cè)鑒別不同細(xì)胞類型時(shí)，存在難以保持抗體染色質(zhì)量的一致性和檢測(cè)有效性的問(wèn)題。

為了進(jìn)一步拓展MELC 在蛋白標(biāo)志物檢測(cè)中的應(yīng)用范圍， Holzarth 等[30]使用MELC 闡明和量化基質(zhì)細(xì)胞間的異質(zhì)性，實(shí)現(xiàn)了對(duì)基質(zhì)細(xì)胞和造血細(xì)胞的多重空間分析。該研究成功使用多達(dá)100 個(gè)熒光標(biāo)記物對(duì)同一組織切片中的蛋白標(biāo)志物進(jìn)行染色，并進(jìn)一步通過(guò)圖像處理和圖像精確疊加分析了蛋白標(biāo)志物的表達(dá)。此外， MELC 還被用于繪制固定細(xì)胞或組織中的多種蛋白質(zhì)圖譜[21，31]。然而，逐個(gè)區(qū)域光漂白掃描操作效率較低、耗時(shí)長(zhǎng)，還存在殘余背景信號(hào)干擾等問(wèn)題。此外，易被光漂白的熒光分子并不適用于熒光成像研究，而光學(xué)穩(wěn)定性強(qiáng)的熒光標(biāo)簽又難被光漂白，該矛盾制約了MELC 技術(shù)的廣泛使用。

2.2 連續(xù)免疫過(guò)氧化物酶標(biāo)記和清除技術(shù)

弗吉尼亞大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系的Glass等[22]開(kāi)發(fā)了一種連續(xù)免疫過(guò)氧化物酶標(biāo)記和清除法（Sequentialimmuneoperoxidase labeling and erasing， SIMPLE）。采用該技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)多種抗原，利用醇溶性過(guò)氧化物酶底物3-氨基-9-乙基咔唑（9-Ethylcarbazol-3-amine， AEC）標(biāo)記抗原分子， AEC 與抗原分子結(jié)合并在有機(jī)溶劑中產(chǎn)生紅色沉淀；清除沉淀，抗體在酸化的高錳酸鹽中洗脫，再進(jìn)行下一輪染色，達(dá)到多重標(biāo)記的目的（圖3）[32]。在小鼠或人的FFPE 組織切片中進(jìn)行多抗原共定位時(shí)，使用AEC 組織染色成像后，在乙醇中去除AEC 沉淀，再在酸化的KMnO4 溶液（0.15 mol/L KMnO4， 0.01 mol/L H2SO4）中洗脫抗體，對(duì)組織進(jìn)行下一輪染色，在1 個(gè)組織切片中可同時(shí)顯示至少5 種蛋白標(biāo)記物。該研究采用包含38 例頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的組織芯片揭示了淋巴、髓系細(xì)胞密度和人類乳頭狀瘤病毒載量與患者預(yù)后情況密切相關(guān)。SIMPLE 法的優(yōu)勢(shì)是在組織樣本數(shù)量有限的條件下能重復(fù)多次對(duì)相同細(xì)胞或組織中的多種抗原進(jìn)行分析，不足之處在于使用酸化的KMnO4 洗脫液除去結(jié)合的抗體時(shí)可能破壞組織完整性，導(dǎo)致局部組織退化、成像質(zhì)量降低，并且只局限于5 個(gè)熒光循環(huán)通道，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)[22，32]。

2.3 循環(huán)免疫熒光技術(shù)

循環(huán)免疫熒光技術(shù)（Cyclic immunofluorescence， CycIF）是一種使用傳統(tǒng)熒光顯微鏡進(jìn)行多重免疫熒光成像的方法，將常見(jiàn)熒光標(biāo)記物與抗體結(jié)合，通過(guò)連續(xù)的4～6 通道組織成像獲得相應(yīng)蛋白標(biāo)志物的成像圖。該方法使用H2O2 氧化熒光標(biāo)記物來(lái)淬滅熒光團(tuán)，實(shí)現(xiàn)對(duì)抗體的標(biāo)記-淬滅-再標(biāo)記過(guò)程，可構(gòu)建多達(dá)30 個(gè)通道的熒光成像圖。與抗體標(biāo)記剝離方法不同， CycIF 的反應(yīng)條件較溫和且易于標(biāo)準(zhǔn)化。美國(guó)哈佛醫(yī)學(xué)院的Sorger 研究組[33]使用多種抗體固定和標(biāo)記COLO858 黑色素瘤細(xì)胞，通過(guò)標(biāo)記-淬滅-再標(biāo)記的循環(huán)免疫熒光法構(gòu)建了15 通道連續(xù)熒光成像，在同一組織中實(shí)現(xiàn)了多種蛋白標(biāo)志物的檢測(cè)（圖4）。

然而，該方法存在熒光團(tuán)失活、信號(hào)不足、染色不均勻以及細(xì)胞易丟失等問(wèn)題。在CycIF 的基礎(chǔ)上， Sorger 研究組[34]進(jìn)一步發(fā)展了組織循環(huán)免疫熒光法（Tissue-based cyclic immunofluorescence， t-CycIF），對(duì)固定在載玻片上的FFPE 標(biāo)本進(jìn)行多重免疫熒光成像。t-CycIF 可對(duì)不同正常組織和腫瘤組織中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)、腫瘤抗原和免疫標(biāo)記物進(jìn)行定量分析。與CycIF 不同的是， t-CycIF 解決了CycIF 無(wú)法在同一切片上檢測(cè)蛋白標(biāo)志物的難題，可標(biāo)記來(lái)自人體的正常和腫瘤組織樣本中的60 余種蛋白質(zhì)。與其它IHC 方法相比， CycIF 使用易標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)試劑和儀器，價(jià)格低廉，檢測(cè)成本低于傳統(tǒng)的免疫熒光法，因此更適用于高通量分析和篩選。但是， t-CycIF 存在檢測(cè)細(xì)胞易丟失、循環(huán)通道少和分析周期長(zhǎng)等問(wèn)題[23，35]。

2.4 多重免疫熒光技術(shù)

在單個(gè)組織標(biāo)本中僅通過(guò)顯微鏡表征蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和DNA 分子的數(shù)量限制了對(duì)健康和疾病生物學(xué)基礎(chǔ)的理解。Gerdes 等[36]建立了多重免疫熒光法（Multiplexed immunofluorescence， MxIF），可在FFPE 中對(duì)多種分析物進(jìn)行定量分析，并對(duì)單細(xì)胞或亞細(xì)胞中的蛋白標(biāo)志物進(jìn)行表征。該方法首先在熒光染料結(jié)合抗體標(biāo)記組織前采集組織背景熒光，待染料淬滅后，使用新的抗體重新標(biāo)記組織獲取新的熒光成像圖，重復(fù)多次后可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞和亞細(xì)胞多靶點(diǎn)的定量分析。利用此方法對(duì)747 例結(jié)直腸癌患者的61 種蛋白標(biāo)識(shí)物的原位成像及共定位進(jìn)行分析，深度揭示了腫瘤的異質(zhì)性。MxIF 的技術(shù)特點(diǎn)是開(kāi)發(fā)了滅活熒光溶液，可在15 min 內(nèi)有效消除菁基染料熒光。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)滅活熒光溶液處理5 min 后， Cy3 和Cy5 的熒光強(qiáng)度分別降低了60%和80%；處理15 min 后，熒光信號(hào)強(qiáng)度降低到初始強(qiáng)度的2%以下。MxIF 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，可檢測(cè)分析物的數(shù)量不止60 種，并未達(dá)到該方法的檢測(cè)上限?？傮w而言，該技術(shù)克服了目前熒光顯微成像技術(shù)的一些局限性，解決了標(biāo)準(zhǔn)免疫熒光方法中隨著分析物數(shù)量的增加對(duì)細(xì)胞的定量檢測(cè)、共定位等分子特征難以進(jìn)行分析的難題，此外，該方法還可應(yīng)用于腫瘤以外的組織或細(xì)胞成像研究[24，37-38]。但是， MxIF 采用H2O2 洗脫以清除熒光信號(hào)的方法，存在耗時(shí)長(zhǎng)且抗原表位易損傷的風(fēng)險(xiǎn)，仍然有很大的改進(jìn)空間。

2.5 酪胺信號(hào)放大技術(shù)

酪胺信號(hào)放大技術(shù)（Tyramide signal amplification， TSA）是一類利用辣根過(guò)氧化物酶（Horseradishperoxidase， HRP）對(duì)靶蛋白或核酸進(jìn)行高密度原位標(biāo)記的檢測(cè)方法。TSA 方法的原理是利用酪胺鹽在HRP 催化和H2O2 作用下形成共價(jià)鍵結(jié)合位點(diǎn)，產(chǎn)生大量的酶促產(chǎn)物[39-40]。該產(chǎn)物可與周圍的蛋白殘基（包括色氨酸、組氨酸和酪氨酸殘基）結(jié)合，從而在抗原-抗體結(jié)合部位產(chǎn)生大量的生物素沉積，再與隨后加入的鏈霉親和素-HRP/熒光基團(tuán)結(jié)合，經(jīng)多次循環(huán)放大，可以結(jié)合大量的酶分子或熒光基團(tuán)[41-42]，使其檢測(cè)信號(hào)得到幾何級(jí)放大（圖5）[25]。Pienta 研究組[41]利用TSA 對(duì)轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌患者腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞進(jìn)行鑒別，系統(tǒng)分析了細(xì)胞表型和免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)性，深入了解疾病成因，為臨床決策提供了參考。

TSA 中每個(gè)反應(yīng)體系僅有單一抗體，因此不存在抗體交叉以及一抗、二抗種屬的匹配問(wèn)題，克服了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)不同種屬抗體選擇的限制[43]。此外， TSA 將流式細(xì)胞術(shù)與IHC 獲得的信息相結(jié)合，通過(guò)在一個(gè)組織切片上進(jìn)行高通量、高分辨率識(shí)別和準(zhǔn)確的圖像分析，能夠揭示各種細(xì)胞類型之間的關(guān)系，這使得TSA 在腫瘤免疫治療領(lǐng)域、探索腫瘤細(xì)胞與其微環(huán)境之間的相互作用和設(shè)計(jì)組合治療方法等方面具有良好的應(yīng)用潛力。同時(shí)， TSA 技術(shù)具有極強(qiáng)的敏感度，可檢測(cè)極微量的目的抗原，并且能極大地降低抗體的用量。但是，該方法最多只能同時(shí)分析7 種抗體，分析單個(gè)樣本需要15～20 h， 僅染色標(biāo)記就需要6～8 h，并且無(wú)法避免非特異性信號(hào)的干擾[25，44]。

2.6 交換反應(yīng)信號(hào)放大技術(shù)

熒光原位雜交技術(shù)（Fluorescence in situ hybridization， FISH）是將熒光基團(tuán)連接到探針上，利用熒光標(biāo)記的特定核酸序列與細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的靶DNA 或RNA 分子雜交，通過(guò)在熒光顯微鏡下觀察熒光信號(hào)來(lái)確定與探針雜交后被染色的細(xì)胞或細(xì)胞器的形態(tài)和分布，或觀察結(jié)合了熒光探針的DNA 或RNA 分子在染色體及其它細(xì)胞器中定位的方法。在FISH 的基礎(chǔ)上，為了解決高效采樣和連續(xù)檢測(cè)的問(wèn)題，研究者開(kāi)發(fā)了一種新的方法即交換反應(yīng)信號(hào)放大法（Signal amplification by exchange reaction， SABER）（圖6）[45]。

SABER 技術(shù)通過(guò)DNA 條形碼標(biāo)記的抗體和引物交換反應(yīng)產(chǎn)生的正交DNA 結(jié)合物實(shí)現(xiàn)高度多重信號(hào)放大，可以同時(shí)分析十幾種靶標(biāo)物質(zhì)。SABER 法的基本原理是DNA 的兩條核酸鏈之間可以通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)形成DNA 雙鏈，通過(guò)設(shè)計(jì)合適的輔助探針即可使整條鏈不斷地自組裝雜交連接形成長(zhǎng)鏈的DNA 串聯(lián)體，此DNA 串聯(lián)體可作為信號(hào)放大的載體。與傳統(tǒng)的FISH 技術(shù)相比， SABER 的信號(hào)放大是獨(dú)立可編碼的，無(wú)需原位酶參與反應(yīng)，通過(guò)與多個(gè)帶有熒光團(tuán)的核酸結(jié)合以實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大。該方法在組織檢測(cè)中具有獨(dú)立調(diào)節(jié)、高效靶向的優(yōu)點(diǎn)。哈佛大學(xué)的Kishi 等[46]使用該方法在固定的腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織中將RNA 和DNA 的FISH 信號(hào)放大5～450 倍，將SABER 與膨脹顯微鏡相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了快速、多通道和高分辨率組織成像，為蛋白質(zhì)的擴(kuò)增成像提供了一個(gè)高效的平臺(tái)。該技術(shù)是通過(guò)12～16 種靶向標(biāo)記物實(shí)現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)放大的引物交換反應(yīng)，并且過(guò)程高度可控。然而，該方法需要大量核酸標(biāo)記的抗體，操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)且檢測(cè)費(fèi)用較高[26]。

2.7 數(shù)字空間分析技術(shù)

數(shù)字空間分析技術(shù)（Digital spatial profiling， DSP）是一種對(duì)FFPE 樣品中蛋白質(zhì)或RNA 多重空間分析的方法[27]。DSP 是將現(xiàn)代基因組檢測(cè)技術(shù)、光化學(xué)和微流體采樣相結(jié)合，將經(jīng)典的IHC 和原位雜交技術(shù)結(jié)合發(fā)展而成的可進(jìn)行基因組和蛋白質(zhì)組多重解析分析的集成系統(tǒng)[47]。Beechem 研究組[47]使用該方法分析了淋巴組織、免疫組織、結(jié)腸和直腸腫瘤中多達(dá)44 種蛋白質(zhì)和96 個(gè)基因的空間分布。DSP平臺(tái)的工作原理如圖7 所示，寡核苷酸鏈通過(guò)對(duì)紫外光敏感且可光裂解的連接基團(tuán)與抗體或RNA 雜交探針偶聯(lián)。將抗體或探針與石蠟包埋的組織共同孵育，使之與蛋白質(zhì)或RNA 充分結(jié)合后，使用可編程數(shù)字微鏡設(shè)備引導(dǎo)紫外光精確照射所檢測(cè)的區(qū)域（Region of interest， ROI），將寡核苷酸標(biāo)簽與抗體解偶聯(lián)，樣本可再次使用。最后采用nCounter 儀器對(duì)寡核苷酸條形碼進(jìn)行計(jì)數(shù)和數(shù)字定量，形成組織形態(tài)的數(shù)字化圖像。該研究組已對(duì)約1400 個(gè)基因和5000 個(gè)探針進(jìn)行了復(fù)雜的數(shù)字信號(hào)處理和基因圖譜測(cè)試，并且檢測(cè)數(shù)量上還有提升空間。DSP 平臺(tái)和nCounter 平臺(tái)結(jié)合，可同時(shí)對(duì)40 多種蛋白質(zhì)和5000 種RNA 進(jìn)行分析。該方法對(duì)組織樣本的傷害極小，臨床樣本經(jīng)DSP 分析后不僅可再次用于其它分析，還可長(zhǎng)期保存，以便后續(xù)的溯源或用于后續(xù)研究分析。該方法也可基于熒光標(biāo)記自動(dòng)對(duì)組織中的稀有細(xì)胞類型、任意形狀或尺寸的區(qū)域進(jìn)行分析，甚至可對(duì)單個(gè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，為臨床患者的診斷和預(yù)后提供依據(jù)。2020 年， Farren 等[48]將nCounter 與DSP 技術(shù)聯(lián)用，以胰腺癌FFPE 樣本為研究對(duì)象，針對(duì)4 種臨床治療策略選取了24 例樣本，首先利用nCounter 表達(dá)譜技術(shù)探尋不同治療方法之間基因表達(dá)的差異，再通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)基因組、蛋白質(zhì)種類、分子復(fù)合物以及EnrichR 分析啟動(dòng)子進(jìn)行分析，并采用DSP 技術(shù)分析了胰腺癌微環(huán)境中各種免疫相關(guān)蛋白標(biāo)記物的數(shù)量和空間分布在不同治療方法中的變化。DSP 技術(shù)將表達(dá)譜的多重定量信息與組織原位信息整合，可在1 張石蠟組織切片上實(shí)現(xiàn)多達(dá)上百種蛋白和上千種mRNA 的原位共分析，將組織病理學(xué)、腫瘤免疫與表達(dá)譜完美結(jié)合，在腫瘤微環(huán)境研究、腫瘤異質(zhì)性與腫瘤免疫研究中有顯著優(yōu)勢(shì)。然而， DSP 只能獲取目標(biāo)區(qū)域的多重信息，缺少圖像信息，對(duì)細(xì)胞的空間分布只能提供有限的信息，并且DSP 單次分析區(qū)域較小、光照效率低以及耗時(shí)較長(zhǎng)的缺點(diǎn)限制了其應(yīng)用范圍。

DSP 與SABER 這兩種方法是利用核酸堿基相互組合產(chǎn)生的數(shù)以萬(wàn)計(jì)的編碼區(qū)分不同抗體及其對(duì)應(yīng)的蛋白。DSP 和SABER 可一步標(biāo)記需要觀測(cè)的所有抗體，并對(duì)各個(gè)抗體逐一進(jìn)行核酸解碼識(shí)別。此外，還可采用循環(huán)熒光成像的方式，通過(guò)核酸互補(bǔ)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合或核酶降解的方式移除帶有熒光信號(hào)的編碼核酸，實(shí)現(xiàn)重復(fù)免疫熒光染色。這兩種核酸編碼的方法較前面幾種信號(hào)移除方法更溫和有效，但成本和消耗時(shí)間方面并不具有優(yōu)勢(shì)。

2.8 質(zhì)譜流式細(xì)胞成像技術(shù)

質(zhì)譜流式細(xì)胞成像技術(shù)（Imaging mass cytometry， IMC）是一種已商業(yè)化的成像技術(shù)，其中代表性工作之一是Nolan 研究組[49]關(guān)于質(zhì)譜細(xì)胞儀（Mass cytometry， CyTOF）的研究。CyTOF 通過(guò)重金屬同位素標(biāo)記抗體或探針，并利用質(zhì)譜細(xì)胞儀對(duì)標(biāo)記樣品進(jìn)行檢測(cè)，得到了詳細(xì)的細(xì)胞表面或內(nèi)部的信號(hào)數(shù)據(jù)。該技術(shù)對(duì)單細(xì)胞表型和功能性蛋白的研究具有重要意義。CyTOF 技術(shù)繼承了傳統(tǒng)流式細(xì)胞技術(shù)的高速分析能力，同時(shí)還具備質(zhì)譜檢測(cè)的高分辨率特性，已成為流式細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域的一個(gè)全新發(fā)展方向。與傳統(tǒng)的流式細(xì)胞技術(shù)相比，該方法具有上百個(gè)相對(duì)獨(dú)立的分析通道，可準(zhǔn)確鑒別不同原子質(zhì)量的金屬同位素，并具備多樣化的數(shù)據(jù)處理方式，可對(duì)樣品進(jìn)行深入分析[28]。

在CyTOF 研究基礎(chǔ)上， Nolan 研究組[50]進(jìn)一步發(fā)展了多重離子束成像技術(shù)（Multiplexed ion beamimaging， MIBI）。該技術(shù)首先使用40～100 種不同金屬標(biāo)記的抗體對(duì)腫瘤組織切片染色，金屬標(biāo)記物被高能量束電離成次級(jí)離子，次級(jí)離子被送入質(zhì)譜成像儀進(jìn)行檢測(cè)。以MIBItracker 軟件作為組織樣本成像的分析工具，實(shí)現(xiàn)了腫瘤切片中多種標(biāo)志物的可視化共定位分析，彌補(bǔ)了CyTOF 技術(shù)在分析細(xì)胞表型與空間位置關(guān)系中應(yīng)用的局限。其中， CyTOF 和MIBI 都已有商業(yè)化儀器，可同時(shí)分析100 種腫瘤標(biāo)志物，并具有較高的靈敏度。但是，該方法需要制備用于質(zhì)譜檢測(cè)的標(biāo)記抗體，在檢測(cè)過(guò)程中需要額外使用流式細(xì)胞儀，并且只能進(jìn)行小區(qū)域的樣本分析，因此不能很好地對(duì)整個(gè)切片做出客觀評(píng)價(jià)。此外，該方法對(duì)檢測(cè)樣本中的細(xì)胞邊界界定不清晰，成像圖中單個(gè)像素可能包含不止1 個(gè)細(xì)胞的信號(hào)。隨著免疫診斷腫瘤標(biāo)志物的不斷發(fā)現(xiàn)，該方法的診斷時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，因此這類技術(shù)不適合在臨床上大規(guī)模應(yīng)用。

3 總結(jié)與展望

在腫瘤免疫治療的時(shí)代，雖然傳統(tǒng)的IHC/IF 仍是檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的主要手段，但受到組織樣本有限、染色過(guò)程冗長(zhǎng)費(fèi)力、數(shù)據(jù)采集及分析系統(tǒng)落后等因素的限制。隨著對(duì)腫瘤發(fā)病機(jī)理的認(rèn)識(shí)逐漸深刻，迫切需要實(shí)施腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療。mIHC 成像技術(shù)不僅可實(shí)現(xiàn)特定的多種蛋白標(biāo)志物的檢測(cè)，得到細(xì)胞組成和空間排列的全面信息，還可反映腫瘤微環(huán)境中的免疫狀態(tài)，在臨床檢測(cè)和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有強(qiáng)大的應(yīng)用潛力。未來(lái)，還需要對(duì)mIHC 成像技術(shù)進(jìn)行更多的探索，以及嚴(yán)格的大規(guī)模驗(yàn)證研究。

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