木薯多孔淀粉基止血粉的止血性能及生物相容性研究

摘要 酶改性淀粉在可生物降解止血材料的應(yīng)用中表現(xiàn)出巨大潛力。本研究利用α-淀粉酶和糖化酶的水解作用得到木薯多孔淀粉（ECS），并通過負(fù)載鈣離子和單寧酸制備木薯多孔淀粉基止血粉（ECS-Ca-T）。利用掃描電子顯微鏡（SEM）、紅外（FTIR）光譜、X 射線衍射（XRD）和比表面積分析儀（BET）對ECS 及其止血粉的微觀結(jié)構(gòu)、孔徑分布、結(jié)晶結(jié)構(gòu)和成分進(jìn)行了詳細(xì)分析。通過溶血實(shí)驗(yàn)和創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)探究了ECSCa-T 的生物相容性，通過體外凝血測試、大鼠創(chuàng)傷止血實(shí)驗(yàn)探究ECS-Ca-T 的止血性能，并考察了ECS-Ca-T的生物降解性。結(jié)果表明， ECS-Ca-T 具有較好的止血效果、生物相容性和可降解性。與市售顆粒止血粉相比， ECS-Ca-T 在大鼠斷尾持續(xù)性出血和肝臟損傷止血方面具有優(yōu)勢，止血時(shí)間分別縮短了4.86 min 和8.6 s，并能夠在5 s 內(nèi)實(shí)現(xiàn)大鼠背部肌肉組織的快速止血；同時(shí)，在傷口愈合過程中， ECS-Ca-T 不會對機(jī)體造成不良影響，在第7 天降解達(dá)到94.5%。

關(guān)鍵詞 木薯多孔淀粉；鈣離子；單寧酸；止血；生物相容性

控制出血在醫(yī)療保健中具有重要意義。輕微傷口引起的出血通常通過先天止血機(jī)制即可控制，但較大的創(chuàng)面造成的持續(xù)性出血或者難以壓迫的傷口需要借助其它止血方法或材料緩解[1]。因此，復(fù)雜出血情況處置的需求推動了止血材料的發(fā)展。

具有止血特性的新型材料的研發(fā)一直備受關(guān)注，以降低與出血相關(guān)的死亡率。淀粉是一種來源于植物的多糖，因其具有優(yōu)異的生物相容性、生物可降解性和低免疫原性[2]，成為止血材料的理想原料。迄今為止，研究人員已開發(fā)出多種形式的淀粉基止血材料，包括淀粉基海綿[3]、水凝膠[4]和顆粒。淀粉基止血凝膠具有明顯的膨脹性和粘附性，能迅速止血并保持傷口濕潤。然而，水凝膠制備條件復(fù)雜，在反應(yīng)中需添加較多化學(xué)試劑，因此具有潛在毒性。Yang 等[5]制備了具有大孔結(jié)構(gòu)和良好機(jī)械性能的雙功能凝血海綿，以控制大量和不可壓縮的出血。當(dāng)壓縮的海綿接觸血液時(shí)，通過填塞效應(yīng)膨脹以控制出血，但膨脹的海綿也會對傷口產(chǎn)生額外的壓力損傷[1]。止血顆粒和粉末可用于多種類型的創(chuàng)傷，包括深度不同和形狀不規(guī)則的傷口[1]。多孔淀粉（Porous starch， PS）具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)、高孔隙率和較快的吸水速率[6]，已被廣泛用作吸附劑、催化劑和其它分子的有效載體。利用PS 優(yōu)異的分子篩效應(yīng)，可通過濃縮凝血因子快速實(shí)現(xiàn)止血[7]；此外， PS 具有高度的生物可降解性，可被人體組織酶促分解為麥芽糖和葡萄糖低聚糖。PS 固有的生物安全性、制備簡單和可長保存期的特性，使其成為最有吸引力的止血材料之一。

目前，研究人員主要對玉米多孔淀粉基止血材料進(jìn)行了廣泛研究，以玉米多孔淀粉為載體，負(fù)載陽離子、親水基團(tuán)和多種促凝物質(zhì)如氨甲環(huán)酸[8]、鈣離子[9]和凝血酶[10]等。玉米多孔淀粉主要通過α-淀粉酶和糖化酶對玉米淀粉的水解作用獲得。木薯淀粉與玉米淀粉同為A 型淀粉[11]，對淀粉酶表現(xiàn)出較高的敏感性，但關(guān)于酶水解對木薯淀粉的影響方面的研究較少，也缺乏對木薯多孔淀粉在止血材料中的應(yīng)用研究。因此，探究木薯淀粉在醫(yī)用止血方面的應(yīng)用，可充分發(fā)發(fā)揮木薯淀粉的應(yīng)用價(jià)值。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，木薯淀粉顆粒經(jīng)淀粉酶水解后能顯著縮短凝血時(shí)間?；诖?，本研究通過α-淀粉酶和糖化酶水解得到木薯多孔淀粉（酶解木薯淀粉， enzymatic porous cassava starch， ECS），并以ECS 為載體，負(fù)載鈣離子和單寧酸制備止血材料，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探究ECS 基止血材料的止血性能、生物相容性和可降解性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

SU8100 冷場發(fā)射掃描電鏡（SEM，日本Hitachi 公司）；IS10 傅里葉紅外光譜儀（FTIR，美國Nicolet 公司）；ASAP2460 全自動比表面積及孔隙度分析儀（BET，美國Micromeritics 公司）；D2 PHASER X 射線衍射儀（XRD，德國Bruker-AXS 公司）；T-6V 紫外-可見分光光度計(jì)（南京菲勒儀器有限公司）。

木薯原淀粉購于廣西紅楓淀粉有限公司；豬抗凝全血、大鼠富血小板血漿（PRP）購于廣州鴻泉生物技術(shù)有限公司；α-淀粉酶（來源于Bacillus subtilis， 4000 U/g）和糖化酶（來源于Aspergillus niger，100000 U/mL）購于上海源葉生物科技有限公司；乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒和磷酸緩沖液（PBS，pH = 7.4）購于上海碧云天生物科技有限公司；TegadermTM 膜購于明尼蘇達(dá)礦業(yè)制造（上海）國際貿(mào)易有限公司；市售云南白藥（YunNan）顆粒止血粉（云南白藥集團(tuán)股份有限公司）；單寧酸、CaCl2、十二水合磷酸氫二鈉和一水合檸檬酸購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；雄性SD 大鼠（SPF 級，體重200～250 g）購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司（合格證號：SYXK（蘇）2021-0056）。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 木薯多孔淀粉基止血粉顆粒的制備

稱取39.9 g 十二水合磷酸氫二鈉和8.8 g 一水合檸檬酸，用去離子水溶解并定容至1 L， 配制成磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液（pH = 5.4）。參考文獻(xiàn)[12]的方法，將18 g 木薯原淀粉分散在60 mL 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH = 5.4）中并振蕩。混合物在60 ℃下預(yù)熱30 min， 然后加入100 U/g （干基淀粉）α-淀粉酶和200 U/g （干基淀粉）糖化酶反應(yīng)16 h， 結(jié)束后，離心收集沉淀，洗滌并在?80 ℃下冷凍8 h， 然后冷凍干燥得到ECS。參考文獻(xiàn)[13]的方法，將10 g ECS 分散在40 mL 10% （m/V） CaCl2 溶液中攪拌4 h， 使ECS 負(fù)載Ca2+，離心收集沉淀，洗滌，并在?80 ℃下冷凍8 h， 干燥，得到負(fù)鈣ECS（ECS-Ca）。參考文獻(xiàn)[14]的方法，將10 g ECS-Ca 分散在40 mL 5% （m/V） 單寧酸溶液中攪拌4 h， 使ECS-Ca 負(fù)載單寧酸分子，離心收集沉淀，洗滌并在?80 ℃下冷凍8 h， 干燥后再經(jīng)60Co 滅菌，得到ECS 基止血粉（ECS-Ca-T）。

1.2.2 結(jié)構(gòu)表征

利用SEM 觀察顆粒的表面形態(tài)，并通過Nano Measure 1.2 軟件分析顆粒的微米級孔徑分布。利用FTIR 分析每個(gè)樣品的官能團(tuán)。利用BET 在–196 ℃下吸附氮?dú)?，測定樣品的比表面積和孔徑分布，根據(jù)BET （Brunauer-Emmett-Teller）方程計(jì)算比表面積，并使用BJH （Barrett-Joyner-Halenda）法分析納米級孔體積和孔徑分布。利用XRD 測試樣品的晶體結(jié)構(gòu)，采用MDI Jade 5.0 軟件分析結(jié)果。

1.2.3 體外凝血性能

（1） 血液凝固時(shí)間（BCT）的測定參考文獻(xiàn)[15-16]的方法，稱取10 mg 止血粉樣品于5 mL 離心管中，于37 ℃水浴中預(yù)熱5 min。加入1 mL 豬抗凝全血， 37 ℃保溫3 min， 然后加入100 μL 0.2 mol/LCaCl2 溶液，并立即計(jì)時(shí)。為了判斷血漿是否凝固，每隔10 s 傾斜一次試管，以血漿完全失去流動性的時(shí)間為凝固時(shí)間。未作任何處理的抗凝全血為空白對照組。每個(gè)樣品測試3 次。

（2） 血液凝固指數(shù)（BCI）的測定依據(jù)文獻(xiàn)[16]的方法，稱取5 mg 止血粉樣品置于離心管中，向5 mL 抗凝血中添加500 μL 0.2 mol/L CaCl2 溶液以引發(fā)抗凝全血的活化，立即向離心管中加入100 μL 活化的血液，將離心管置于37 ℃水浴中孵育。分別在0.5、1、2、3、5、7 和9 min 共7 個(gè)時(shí)間點(diǎn)向管中加入8 mL 去離子水，孵育5 min， 然后分別取200 μL 稀釋的血紅蛋白，通過紫外-可見分光光度計(jì)記錄樣品在540 nm 處的吸收值。BCI 按照公式（1）計(jì)算：

1.2.4 體內(nèi)止血性能

通過異氟烷維持大鼠麻醉，異氟烷濃度為2%～2.5%，流量為500～700 mL/min。麻醉成功后，將大鼠平放在實(shí)驗(yàn)臺上，取橡皮筋固定四肢，每只大鼠均進(jìn)行以下3 項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。（1）大鼠斷尾止血將大鼠尾巴用碘伏和酒精消毒，然后在大鼠尾部距末端2 cm 處，用剪刀一次性剪斷大鼠尾部，切口自出血3 s 后擦去血液，立即將尾部創(chuàng)口插入裝有止血粉的離心管中，并啟動秒表計(jì)時(shí)，每隔30 s 觀察創(chuàng)口是否止血，用濾紙輕輕接觸創(chuàng)口，若濾紙上未留下血跡，說明止血成功，從啟動計(jì)時(shí)到止血成功所用的時(shí)間為止血時(shí)間[17]?？瞻讓φ战M為斷尾后不做任何處理的大鼠。（2）大鼠背部皮膚切除并止血取電動剪毛器剔除大鼠背部毛發(fā)備皮（以脊柱為中線，兩側(cè)備皮面積分別為4 cm×5 cm）， 然后用碘伏和酒精消毒，待皮膚稍干后利用活檢打孔器切除大鼠脊柱兩側(cè)直徑約為1 cm 圓形區(qū)域皮膚，并用組織鑷將圓孔內(nèi)皮膚提起，利用組織剪尖頭刺一孔洞，深至筋膜層，并沿孔洞將圓形區(qū)域內(nèi)皮膚切除制造創(chuàng)口，然后用止血粉止血，記錄止血時(shí)間[18]。空白對照組為皮膚切除后不作任何處理的大鼠。（3）肝臟損傷實(shí)驗(yàn)用碘伏和酒精對大鼠腹部消毒，然后在腹部正中切一長約2 cm 的縱行切口，用無菌紗布制作一次性洞巾鋪在創(chuàng)口上，輕輕擠壓腹部暴露肝臟，肝左（右）葉先后從切口被擠出，用生理鹽水無菌紗布拖住并固定肝左（右）葉，在肝葉表面用刀片制造線型創(chuàng)面，長1 cm、深5 mm， 切口自由出血3 s 后立即擦去血液，平鋪適量止血粉，加蓋2 張2 cm×2 cm 濾紙，并按壓，啟動秒表計(jì)時(shí)。每隔30 s 揭開一張濾紙觀察止血情況，直至出血停止，以不加壓3 min 內(nèi)無鮮紅血液滲出為完全止血標(biāo)準(zhǔn)，記錄完全止血時(shí)間[17]?？瞻讓φ战M為肝臟損傷后不作任何處理的大鼠。

1.2.5 溶血率（HI）測試

將8 mL 抗凝血加入到含10 mL 生理鹽水的試管中獲得血液稀釋液。將100 mg 止血粉樣品浸入45 mL 生理鹽水中，于37 ℃孵育24 h， 獲得樣品浸提液。

參考國家標(biāo)準(zhǔn)方法[19]，將浸提液混勻，取10 mL 浸提液至新的試管中，陽性對照組為10 mL 生理鹽水，陰性對照組為10 mL 去離子水。將全部試管放入37 ℃水浴中預(yù)熱30 min， 然后每管添加200 μL 稀釋血液，混勻，繼續(xù)于37 ℃保溫孵育1 h， 每30 min 顛倒試管2 次。800 r/min 離心5 min， 取上清液測定545 nm 處吸收值。HI 按照公式（2）計(jì)算：

1.2.6 血小板和紅細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[14]并稍作修改進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。（1）血小板粘附能力將新鮮大鼠富血小板血漿（PRP）稀釋至2×108 cell/mL，取100 μL 稀釋的PRP 懸液加入到5 mg 止血粉樣品中，于37 ℃孵育30 min， 棄去上清液，并使用PBS 將未粘附的血小板去除，將混合物轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，按照LDH 檢測試劑盒提供的測試方法測定粘附的血小板數(shù)量。（2）血小板粘附狀態(tài)將PRP 用等體積的PBS 稀釋，取500 μL稀釋的PRP 懸液加入10 mg 止血粉樣品，在37 ℃下孵育30 min 后，用PBS 輕輕地清洗未被粘附的血小板；將粘附血小板的樣品放在PBS 中超聲振蕩清洗10 min， 用2.5%戊二醛-PBS 溶液固定樣品，并通過梯度乙醇脫水后，用SEM 觀察樣品粘附血小板的情況。（3）紅細(xì)胞粘附能力10 mg 止血粉樣品與500 μL 紅細(xì)胞懸液孵育30 min， 用PBS 清洗未粘附的紅細(xì)胞，然后將樣品放置于5 mL 去離子水中超聲清洗5 min， 并使用酶標(biāo)儀測量清洗液在540 nm 處的吸收值。（4）紅細(xì)胞粘附狀態(tài)10 mg 止血粉樣品與500 μL 紅細(xì)胞懸液孵育作用30 min， 用PBS 清洗未粘附的紅細(xì)胞，用2.5%戊二醛-PBS 溶液固定樣品，并通過梯度乙醇脫水后，用SEM 觀察ECS 止血粉粘附紅細(xì)胞的情況。

1.2.7 全層皮膚缺損模型的創(chuàng)面愈合實(shí)驗(yàn)

用電動剪毛器剔除大鼠背部毛發(fā)備皮，然后用碘伏和酒精消毒，待皮膚稍干后利用活檢打孔器切除大鼠脊柱一側(cè)直徑約為1 cm 圓形區(qū)域皮膚，撒上ECS-Ca-T 并在創(chuàng)面貼上1 片市售的TegadermTM 膜，以防止掉落，空白對照組的創(chuàng)面僅貼TegadermTM 膜。在不同時(shí)間點(diǎn)（0、1、4、7、11 和14 d）觀察創(chuàng)面愈合情況并拍照[20]。切下與止血粉接觸的皮膚和筋膜組織，用4%多聚甲醛固定液進(jìn)行固定處理，隨后用梯度乙醇進(jìn)行脫水，并包埋于石蠟中。石蠟塊以5 μm 厚為單位連續(xù)切片，直到組織被發(fā)現(xiàn)。組織切片置于載玻片上，用二甲苯脫蠟，采用蘇木精和伊紅染色，通過電子顯微鏡觀察組織形態(tài)。

1.2.8 體外降解實(shí)驗(yàn)

ECS 基止血粉的體外降解實(shí)驗(yàn)是通過測定其浸沒在包含α-淀粉酶的磷酸鹽緩沖液（PBS， pH=7.4）模擬體液（1 mL 300 U/mL α-淀粉酶分散在1 L PBS）中的質(zhì)量變化進(jìn)行評估[3]。在浸沒前，稱取干燥ECS 樣品重量并記錄為M0。隨后浸沒在溶液介質(zhì)中，在37 ℃水浴搖床中振蕩，并且每天更換浸泡溶液。在特定的時(shí)間（1、2、3、4、5、6 和7 d）， 用去離子水沖洗樣品并冷凍干燥。測量每個(gè)樣品的最終重量，記為Mt。根據(jù)公式（3）計(jì)算樣品的失重率（D）：

2 結(jié)果與討論

2.1 ECS及其止血粉的結(jié)構(gòu)表征

ECS 是木薯原淀粉顆粒在低于糊化溫度下由α-淀粉酶和糖化酶共同作用下制得，其顆粒微觀形態(tài)如圖1A 和1B 所示。ECS 具有明顯的微孔和大孔結(jié)構(gòu)，并且較多顆粒存在一端有大孔的情況。ECS 表面存在均勻的凹坑，能夠降低流體的阻力，同時(shí)大孔的存在有利于快速地將液體引導(dǎo)到微孔中[21]。ECS-Ca（圖1C 和1D）和ECS-Ca-T（圖1E 和1F）的微觀結(jié)構(gòu)與ECS 基本相同，說明負(fù)載Ca2+和單寧酸未對ESC 的顆粒結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。此外，酶處理產(chǎn)生的孔隙使ECS 的比表面積增加，同時(shí)伴隨著吸附性增強(qiáng)， ECS 能夠快速吸附血液中的液體，并達(dá)到富集凝血因子的目的[13]。

利用氮吸附比表面積分析儀測定得到ECS 的比表面積為9.72 m2/g， 孔徑主要分布在3～5 nm 以及10～55 nm（圖2A）。此外，通過Nano Measure 得到ECS 微米級孔徑主要分布在約2 μm 左右（圖2B）。利用XRD 檢測ECS 及其止血粉的結(jié)晶結(jié)構(gòu)（圖2C），觀察到ECS、ECS-Ca 和ECS-Ca-T 在15°、17°、18°和23°處都存在衍射峰，表明負(fù)載Ca2+和單寧酸后ECS 的結(jié)晶結(jié)構(gòu)保持不變，仍呈現(xiàn)典型的A 型結(jié)晶結(jié)構(gòu)。采用紅外光譜檢測樣品官能團(tuán)變化（圖2D）， ECS 的紅外譜圖在3286 cm–1 存在吸收峰，在ECS-Ca 和ECS-Ca-T 中該吸收峰分別位移到3266 和3291 cm–1， 這是由于Ca2+與淀粉分子的—OH 基團(tuán)的相互作用所導(dǎo)致[9]。此外，在ECS-Ca-T 中觀察到位于1500～1600 cm–1 處的單寧酸苯部分的環(huán)拉伸峰[22]，說明單寧酸成功負(fù)載于ECS 上。

2.2 ECS基止血粉的體外凝血性能評價(jià)

通過測試全血凝固時(shí)間和全血凝固指數(shù)，探究ECS 及以其為載體所制備的止血粉的體外凝血效果。本實(shí)驗(yàn)使用豬抗凝全血，在血液中添加適量Ca2+以引發(fā)豬抗凝全血的凝血作用[23]。不同樣品的全血凝固時(shí)間如圖3A 所示，與空白組（（20.17±1.02） min）相比，測試的4 種樣品的BCT 值均顯著降低（plt;0.0001）。其中， ECS-Ca-T 的BCT 值最小，與空白組相比， ECS-Ca-T 的BCT 值下降了16.93 min， 因其負(fù)載了Ca2+和單寧酸， Ca2+作為重要的凝血因子，接觸血液即直接參與凝血途徑；單寧酸具有大量的酚羥基，對多種蛋白具有親和力[22]，可能與血小板等凝血因子具有相互作用。

BCI 是以數(shù)據(jù)的形式表示不同時(shí)間點(diǎn)的血液凝固情況，隨著凝血途徑被激活，血液凝固的部分增加，未凝固的血液在添加去離子水后由于滲透壓的變化導(dǎo)致紅細(xì)胞破裂，從而溶出血紅蛋白[24]。因此， BCI值越小的樣品，促凝血效果越好。由圖3B 可知， ECS-Ca-T 在1、2、3 和5 min 時(shí)，相對于ECS、ECS-Ca和云南白藥而言都具有較高的凝血速率。在保溫3 min 后， 4 種樣品的BCI 均快速下降，其中， ECS-Ca-T的下降速率最快，添加了ECS-Ca-T 的血液凝固的部分最多，說明在相同的保溫時(shí)間內(nèi)， ECS-Ca-T 具有較好的促凝血效果。

2.3 生物相容性分析

HI 是用于評估植入式材料的血液相容性的簡單且可靠的指標(biāo)。根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)，只有HI 低于5%的產(chǎn)品才能滿足臨床應(yīng)用中的血液安全要求[21]。ECS 及以其為載體的止血粉的HI 如圖4A 所示。經(jīng)ECS、ECS-Ca 和ECS-Ca-T 提取物處理后，離心后得到的上清液為無色澄清的溶液。本實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)樣品溶血。定量分析結(jié)果表明， ECS、ECS-Ca 和的ECS-Ca-T 的溶血率分別為1.6%、2.5%和1.5%，說明ECS及以其為載體的止血粉具有較好的生物相容性。

觀察ECS-Ca-T 作用于大鼠背部創(chuàng)面后傷口的愈合情況，以探究ECS-Ca-T 的殘留是否會對大鼠機(jī)體造成不良影響。創(chuàng)面愈合狀況如圖4C 所示， 14 d 內(nèi)均未出現(xiàn)紅腫、流膿和發(fā)炎等情況，創(chuàng)口敷止血粉后顏色變深，可能是粉末吸液后粘附于傷口并開始降解所導(dǎo)致[25]。隨著時(shí)間增加，對照組和ECS-Ca-T大鼠背部創(chuàng)口均結(jié)痂愈合，創(chuàng)面逐漸縮小。取愈合14 d 大鼠創(chuàng)口附近組織，并通過HE 染色觀察創(chuàng)面愈合情況。如圖4B 所示，空白和樣品組的皮膚組織均未見炎癥細(xì)胞，并且樣品組的上層皮膚組織較厚，說明大鼠皮膚愈合狀況良好， ECS-Ca-T 敷于創(chuàng)口后不會對組織造成不良影響。

2.4 ECS基止血粉作用于大鼠斷尾、肝損傷和背部損傷的止血實(shí)驗(yàn)

通過大鼠斷尾實(shí)驗(yàn)中的止血時(shí)間評估ECS 和ECS-Ca-T 的止血效果。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鼠斷尾后創(chuàng)面會持續(xù)出血，若不及時(shí)處理，易導(dǎo)致大鼠失血過多。如圖5A 所示，與損傷后不做任何處理的尾部傷口相比， ECS 和ECS-Ca-T 的止血時(shí)間從11.37 min 分別減至2.83 和1.87 min， 分別縮短了75.1%和83.6%；與云南白藥（6.73 min）相比， ECS-Ca-T 的止血時(shí)間縮短了4.86 min。與市售止血粉相比， ECS-Ca-T 在治療緩慢且持續(xù)性出血的創(chuàng)口方面具有明顯優(yōu)勢。

為了進(jìn)一步探究ECS 基止血粉對臟器損傷的止血效果，采用大鼠肝臟出血模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。肝臟是含有豐富血管的重要器官，肝臟破裂可以造成大出血，若不及時(shí)處理，可引起失血性休克[26]。如圖5B 所示，與空白組相比，用ECS-Ca-T 處理肝臟傷口后，止血時(shí)間從96.75 s 減至27.20 s， 縮短了71.9%。與市售止血粉（35.80 s）相比，止血時(shí)間縮短了8.60 s， 說明ECS-Ca-T能夠有效地治療大鼠肝臟出血。

通過在大鼠背部打孔，觀察ECS 和ECS-Ca-T 對背部滲血肌肉組織的止血效果。如圖5C 所示，與損傷后不做任何處理的背部創(chuàng)口相比， ECS-Ca-T 能在5 s 內(nèi)達(dá)到止血效果；但是， ECS 和ECS-Ca-T 的止血時(shí)間與云南白藥相比無顯著性差異。這可能是由于大鼠背部的出血來源為肌肉組織，雖然在短時(shí)間內(nèi)不處理創(chuàng)面會持續(xù)滲血，但出血量有限，不同的止血粉都能對傷口達(dá)到密封止血的效果。

2.5 ECS基止血粉的體外降解

血清或血漿中α-淀粉酶催化淀粉分子中的α-1，4 葡萄糖苷鍵斷裂，產(chǎn)生葡萄糖、麥芽糖及含有α-1，6糖苷鍵支鏈的糊精。胰α-淀粉酶是最重要的淀粉水解酶，分子量為40～50 kDa，與唾液淀粉酶相同，以活性狀態(tài)分泌進(jìn)入消化道[27]。除了胰腺和唾液腺之外，身體的很多組織比如腹腔中其他臟器、輸卵管、乳腺以及卵巢等都能夠產(chǎn)生淀粉酶，并且分泌進(jìn)入全身循環(huán)系統(tǒng)[28]。因此ECS 基止血粉作用于機(jī)體傷口后，遺留的部分可能被體內(nèi)淀粉酶降解。通過在模擬體液中添加適量的淀粉酶研究ECS 和ECS-Ca-T的降解性。ECS 和ECS-Ca-T 在模擬體液中的失重率見表1，在第4 天， ECS 已被完全降解；而ECS-Ca-T的降解速度相對較慢，在2 d 內(nèi)的失重率僅為31.8%，第7 天時(shí)失重率升高至94.5%。這可能是由于ECS負(fù)載Ca2+和單寧酸后，兩種物質(zhì)大量附著在ECS 顆粒的孔隙、裂縫和凹坑處，導(dǎo)致淀粉酶與顆粒的反應(yīng)位點(diǎn)減少。在降解初期， Ca2+和單寧酸附著量較大，隨著時(shí)間延長，兩者逐漸釋放至模擬體液中，在降解3 d 后，失重率顯著提高。

2.6 止血機(jī)理

圖6 展示了不同樣本對紅細(xì)胞和血小板的吸附能力。當(dāng)負(fù)載Ca2+后， ECS 對血小板和紅細(xì)胞的吸附能力顯著增強(qiáng)（圖6E 和6F），這可能是因?yàn)镃a2+有助于血漿凝固，進(jìn)而包圍更多的血細(xì)胞。在對Ca2+進(jìn)行負(fù)載的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步添加單寧酸， ECS 對血細(xì)胞的吸附能力明顯增強(qiáng)（plt;0.0001）。主要是因?yàn)閱螌幩嶂械姆恿u基可與血細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)相互作用，形成氫鍵，顯著提高ECS 的吸附效率。有報(bào)道指出，紅細(xì)胞聚集可有效地封閉傷口表面，阻止出血[29]。如圖6F 所示， ECS-Ca-T 具有出色的與紅細(xì)胞結(jié)合的能力。采用SEM 研究ECS-Ca-T 顆粒對血細(xì)胞的吸附狀況。結(jié)果顯示，大量紅細(xì)胞被緊密地粘附在一起，并在ECS-Ca-T 區(qū)域的表面聚集（圖6C 和6D）。更為關(guān)鍵的是，在ECS-Ca-T 表面觀察到血小板發(fā)生了變形，并產(chǎn)生了大量偽足（圖6A 和圖6B），這表明血小板被激活，并在止血過程中發(fā)揮作用。大孔在幫助血液迅速進(jìn)入微孔方面起到了關(guān)鍵作用，當(dāng)血液從大孔流向微孔時(shí)，孔洞的尺寸逐步縮小，從而使血液的凝固因子能夠快速聚集。因此，當(dāng)ECS-Ca-T 與傷口的表面發(fā)生接觸時(shí)，能夠迅速地從流出的血液中吸取液體，從而聚集血小板、紅細(xì)胞及其它凝血因子，加快凝血過程。

3 結(jié)論

將Ca2+和單寧酸負(fù)載于ECS 得到ECS-Ca-T 止血粉。與市售顆粒止血粉相比， ECS-Ca-T 在緩慢持續(xù)性的斷尾出血的止血過程中表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，能快速阻止大鼠肝臟大出血， ECS-Ca-T 既能通過本身的多孔結(jié)構(gòu)聚集血小板和紅細(xì)胞等凝血因子，又能通過Ca2+加速凝血過程，以及通過單寧酸對蛋白的相互作用吸引更多凝血因子，從而達(dá)到促進(jìn)生理性止血的目的。本研究對探究ECS 在止血材料中的應(yīng)用具有重要的參考意義。通過采用其它的改良方法或加入其它的凝血和抗炎因子，可以實(shí)現(xiàn)ECS 更廣泛的應(yīng)用。

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