SmZIP11 基因過(guò)表達(dá)增強(qiáng)楊樹對(duì)重金屬的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)

摘要： 【目的】利用木本植物修復(fù)重金屬污染土壤是經(jīng)濟(jì)、安全、有效的方法。研究鋅鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中SmZIP11 基因表達(dá)對(duì)吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)重金屬的影響，為重金屬污染土壤植物修復(fù)提供重要的基因資源?！痉椒ā坎捎灭z頭柳（Salix matsudana var. matsudana f. umbraculifera Rehd.） 無(wú)性系一年生幼苗進(jìn)行水培試驗(yàn)。幼苗在正常營(yíng)養(yǎng)液中生長(zhǎng)60 天后進(jìn)行重金屬脅迫處理，重金屬處理包括：200 μmol/L ZnSO4、100 μmol/L CuSO4 和100 μmol/L CdSO4。在重金屬處理0、1、4、7、14 和21 天時(shí)，取根、莖和葉組織樣品提取RNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR （quantitative real-time PCR， qRT-PCR） 測(cè)定SmZIP11 的表達(dá)水平。利用葉盤法將提取的SmZIP11 基因轉(zhuǎn)入銀灰楊（Populus × canescens） 中，經(jīng)卡那霉素抗性篩選共得到8 個(gè)過(guò)表達(dá)SmZIP11 基因的轉(zhuǎn)化楊樹株系（OEs）。選擇SmZIP11 基因表達(dá)水平較高的3 個(gè)轉(zhuǎn)基因株系和野生型株系（WT） 于重金屬脅迫營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)14 天后，測(cè)定根、莖、葉生物量和重金屬含量，計(jì)算耐受性指數(shù)和轉(zhuǎn)移系數(shù)?！窘Y(jié)果】SmZIP11 基因編碼區(qū)序列長(zhǎng)度為1053 bp，編碼351 個(gè)氨基酸，分子量為37.71 kDa，含有9 個(gè)保守的跨膜結(jié)構(gòu)域，該基因編碼的蛋白定位于細(xì)胞膜。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，饅頭柳SmZIP11 與楊柳科的親緣關(guān)系最近，與大戟科、錦葵科、傘形科植物的ZIP11 親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。qRT-PCR 結(jié)果表明，在Zn、Cu 和Cd 脅迫下，饅頭柳莖和葉片中的SmZIP11 比對(duì)照顯著上調(diào)；在Cd 和Zn 脅迫下，根、莖和葉片中該基因的表達(dá)量都顯著提高。在轉(zhuǎn)基因楊樹中，SmZIP11 基因顯著增強(qiáng)了植株對(duì)Zn 和Cu 的耐受性，促進(jìn)了Cd 從根系向莖中轉(zhuǎn)移，以及Zn 向葉片中轉(zhuǎn)移，同時(shí)將Cu 富集在根部。與WT 相比，OE7 株系對(duì)Zn 的耐受指數(shù)和地上部Zn 的含量及轉(zhuǎn)移系數(shù)都顯著提高?！窘Y(jié)論】饅頭柳SmZIP11 基因增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因楊樹對(duì)Cu 和Zn 的耐受性，并提高了從根系向地上部轉(zhuǎn)移Cd 和Zn 的能力，為植物修復(fù)土壤重金屬污染提供了基因資源和理論指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞： 饅頭柳； SmZIP11 基因； 重金屬脅迫； 功能分析

據(jù)《全國(guó)土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》[1]和《2020 年全國(guó)生態(tài)環(huán)境質(zhì)量簡(jiǎn)況》[2]，重金屬是目前影響農(nóng)用地土壤環(huán)境質(zhì)量的重要污染物，污染面廣且擴(kuò)展迅速，是優(yōu)先監(jiān)測(cè)和控制的土壤污染物。一般來(lái)說(shuō)，密度大于4.5 g/cm3 的金屬元素稱為重金屬，大部分重金屬不易被分解，具有一定的累積效應(yīng)[3]。土壤中的重金屬來(lái)源途徑多樣，如大氣沉降、養(yǎng)殖廢水灌溉[4]、污泥再次利用、有機(jī)肥和化肥的施用等[5]。目前，國(guó)家已把修復(fù)重金屬污染列入“十四五”全國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村科技發(fā)展規(guī)劃（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部，農(nóng)科教發(fā)〔2021〕13 號(hào)），并成為我國(guó)“十四五”期間的重要工作之一。

木本植物具有龐大的樹冠和發(fā)達(dá)的根系，能有效地吸收土壤中的重金屬，在重金屬污染修復(fù)中具有較大潛力[6]。例如，美洲黑楊（Populus deltoids） 和蒿柳（Salix viminalis） 已被用于治理土壤鎘污染[7?8]。近年來(lái)，450 種灌木柳中已有10 種被試用于土壤重金屬污染植物修復(fù)中[9]，以灌木柳為主。

土壤中的重金屬被植物根吸收，部分儲(chǔ)存在根系，部分轉(zhuǎn)運(yùn)到木質(zhì)部導(dǎo)管中，在細(xì)胞壁和液泡中被隔離和解毒。因此，重金屬的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、區(qū)隔化和解毒是木本植物修復(fù)土壤重金屬污染的關(guān)鍵過(guò)程。重金屬離子的吸收和在細(xì)胞內(nèi)的平衡由植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)控，運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白都是典型的膜蛋白，屬于不同的植物金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，可以在組織水平或器官水平起作用[ 1 0 ]。鋅鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（zincregulatedtransporter and iron-regulated transporter-likeprotein， ZIP） 是一類金屬轉(zhuǎn)運(yùn)體，幾乎所有的ZIP 蛋白都含有8 個(gè)以上的跨膜結(jié)構(gòu)域和類似的膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，其中的氨基和羧基末端均位于質(zhì)膜外表面[11]。絕大多數(shù)的ZIP 蛋白長(zhǎng)度為309～476 個(gè)氨基酸，第III 和IV 跨膜結(jié)構(gòu)域之間的“可變區(qū)”的長(zhǎng)度不同造成了氨基酸數(shù)目的不同，也決定了其對(duì)金屬離子的專一性。ZIPs 可變區(qū)的金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域富含組氨酸（His），它可以作為重金屬的結(jié)合位點(diǎn)[12]。在水稻中，OsZIP1 參與土壤中Zn 的吸收，OsZIP4、OsZIP5、OsZIP7 和OsZIP8 則參與了鋅在地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)或分配[13?15]。OsZIP9 蛋白定位于水稻根外皮和內(nèi)皮，是水稻中鋅的重要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在缺鋅條件下，OsZIP9蛋白有助于水稻對(duì)鋅的吸收[16]。雖然已有大量有關(guān)ZIP 家族蛋白參與Zn、Fe 和Cd 等元素的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和分配的研究，但主要集中在擬南芥和水稻等草本植物中，較少針對(duì)用于土壤重金屬污染修復(fù)的木本植物。

灌木柳是重金屬高效吸收和高積累的木本植物。例如，杞柳（S. integra） 對(duì)鉛脅迫有很強(qiáng)的耐受性，被認(rèn)為是尾礦鉛鋅固定植物的潛在候選物種[17]。蒿柳（S. viminalis） 和黃花柳（S. caprea） 可以降低土壤中Cd、Zn 和Cu 的濃度[18]。柳樹（Salix spp.） 生長(zhǎng)速度快、適應(yīng)性強(qiáng)、無(wú)性繁殖容易、生物量大，具有很高的重金屬吸收能力[19]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，饅頭柳（S. matsudana var. matsudana f. umbraculiferaRehd.） 是一種高鎘積累和耐鎘的喬木[20?21]。在鎘脅迫的旱柳和饅頭柳的根系中，有8 個(gè)ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）、3 個(gè)黃色條紋蛋白（YSLs）、4 個(gè)ZIPs 和1 個(gè)天然抗性相關(guān)巨噬蛋白（NRAMP） 基因，僅在Cd 脅迫處理下的饅頭柳根系中上調(diào)表達(dá)，可能參與了饅頭柳根系對(duì)Cd 吸收、向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)和積累[20]，這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能需要進(jìn)一步研究。本研究對(duì)ZIPs 家族成員中SmZIP11 的基因長(zhǎng)度、蛋白結(jié)構(gòu)、表達(dá)部位、轉(zhuǎn)運(yùn)功能等進(jìn)行了預(yù)測(cè)與分析，為利用生物技術(shù)培育高抗和高積累的木本植物，修復(fù)土壤重金屬污染提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

試驗(yàn)材料為饅頭柳無(wú)性系，保存于中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所苗圃。取饅頭柳一年生枝條（約15 cm），在12 L 的塑料盆中進(jìn)行水培培養(yǎng)[22]。塑料盆中加入1/2 霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液[23]，pH 值控制在6.0 左右，持續(xù)充氣，營(yíng)養(yǎng)液每3 天更換1 次。光周期16 h/8 h，室溫23℃～25℃，空氣濕度為50%～60%[21]。預(yù)培養(yǎng)60 天后選取生長(zhǎng)一致的60 株無(wú)性系扦插苗，分為4 組，15 株為1 組，每3 株移栽于2 L 的黑色塑料桶中，作為1 個(gè)處理時(shí)間點(diǎn)的3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共20 盆。其中3 組分別進(jìn)行以下3 種重金屬處理：200 μmol/L ZnSO4、100 μmol/LCuSO4 和100 μmol/L CdSO4；另外1 組繼續(xù)用1/2 霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)作為對(duì)照。在培養(yǎng)1、4、7、14 天和21 天時(shí)分別取樣，采集根、莖和葉的樣品迅速用液氮速凍，保存于?80℃ 超低溫冰箱備用。

1.2 RNA 的提取

使用RNA prep Pure Plant Plus 試劑盒（DP441，天根生物科技有限公司，北京，中國(guó)） 提取饅頭柳的根、莖、葉的RNA。評(píng)估RNA 的完整性：1.0% （W/V）瓊脂糖凝膠電泳，并使用N a n o D r o p 2 0 0 0 分光光度計(jì)測(cè)定濃度。

1.3 SmZIP11 基因克隆

利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲取SmZIP11 基因序列，運(yùn)用Primer3 Input （http：//frodo.wi.mit.edu） 在線軟件，設(shè)計(jì)引物（表1），由浙江尚亞生物技術(shù)有限公司合成。利用PrimeScript? III 1st Strand cDNA SynthesisKit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，北京，中國(guó)） 合成cDNA 第一鏈。以饅頭柳根系、莖和葉片混合cDNA 為模板，通過(guò)PCR 進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL：2×Phanta Max Master Mix （DyePlus） 高保真DNA 聚合酶12.5 μL，上下游引物各1 μL （10 μmol/L），cDNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。取10 μLPCR 產(chǎn)物利用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其長(zhǎng)度。將基因長(zhǎng)度正確的DNA 凝膠片段利用DNA 凝膠回收試劑盒（杭州Axygen，中國(guó)） 進(jìn)行回收。連接T 載體，轉(zhuǎn)化TOP10 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，送至浙江尚亞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 SmZIP11 基因生物信息學(xué)分析

本研究通過(guò)TMHMM 軟件（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM） 分析SmZIP11 蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)域；用SWISS-MODEL （https：//swissmodel.expasy.org/） 預(yù)測(cè)SmZIP11 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；利用DNAMAN 軟件計(jì)算SmZIP11 的分子量；從網(wǎng)站NCBI （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/） 和擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.arabidopsis.org/） 檢索并下載與SmZIP11 相似度較高的17 個(gè)物種氨基酸序列；利用DNAMAN 軟件比對(duì)相似序列，確定ZIP11 相對(duì)保守區(qū)域；通過(guò)MEGA X 中Neighbor-joining （NJ）phylogenetic tree 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，其中bootstrap測(cè)試重復(fù)1000 次；利用在線軟件Wo LF PSORTⅡ（https：//wolfpsort.hgc.jp/） 預(yù)測(cè)SmZIP11 蛋白亞細(xì)胞定位。

1.5 SmZIP11 基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR （qRT-PCR）

為了探索SmZIP11 在不同組織中的表達(dá)水平，使用qRT-PCR 技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。利用Prime Script TMRT Master Mix （RR036，寶生物，大連，中國(guó)） 合成cDNA 第一鏈，分別利用去離子水5 倍稀釋根、莖、葉cDNA。根據(jù)獲得的SmZIP11 基因cDNA 序列，采用在線軟件Primer3.0 （http：//frodo.wi.mit.edu） 設(shè)計(jì)qRT-PCR 引物 （表1）。qRT-PCR 反應(yīng)體系（RR420，寶生物，大連，中國(guó)） 為20 μL：cDNA 2 μL，上下游引物各0.4 μL，SYBR?Premix Ex TaqTM 10 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 6.8 μL。其擴(kuò)增條件為預(yù)變性95℃，30 s；變性95℃，5 s；退火60℃，30 s；40 個(gè)循環(huán)。Ct 值使用7300 Real TimePCR 系統(tǒng)（Applied Biosystems，CA，USA） 測(cè)定。為了使表達(dá)水平正常化，將內(nèi)源基因DnaJ 作為內(nèi)參基因[24]。每個(gè)樣品進(jìn)行4 次技術(shù)重復(fù)。

1.6 亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建

根據(jù)SmZIP11 序列設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)引物（表1）。通過(guò)同源重組的方法構(gòu)建亞細(xì)胞定位重組載體，用Xba I 和Kpn I 對(duì)植物表達(dá)載體PBI121-GFP 的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切體系為50 μL：10×QuickCut GreenBuffer 10 μL，Xba I 和Kpn I 各1 μL，質(zhì)粒5 μL，ddH2O 33 μL，設(shè)置酶切溫度為37℃，在恒溫水浴鍋中酶切2～3 h，凝膠電泳檢測(cè)其是否酶切完全，進(jìn)行切膠回收。

利用同源重組酶將目的基因擴(kuò)增片段純化產(chǎn)物與酶切后的載體連接。10 μL 體系：回收DNA 片段2 μL、雙酶切后的pBI121-GFP 載體3 μL、2 ×Ezmax? Universal CloneMix 5 μL。在37℃ 下溫育15 min 后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入TOP10 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，均勻的涂布于50 μg/mL 卡那霉素的LB 固體培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。挑取單克隆菌落，液體培養(yǎng)并使用含有酶切位點(diǎn)引物（ S m Z I P 1 1 - p B I 1 2 1 - F 和SmZIP11-pBI121-R）（表1） 進(jìn)行PCR 檢測(cè)，選擇條帶大小正確的菌液送至浙江尚亞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。提取測(cè)序結(jié)果正確的陽(yáng)性菌擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101 感受態(tài)細(xì)胞。挑取農(nóng)桿菌單克隆在180 r/min 28℃ 搖床振蕩培養(yǎng)至OD6000.6～0.8。

選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好、健壯的3～4 周齡本氏煙草幼苗（由林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供），轉(zhuǎn)化前澆透水并置于光照下培養(yǎng)使氣孔充分張開。挑選平整的葉片，避開葉脈注射。使用核marker （p2300-35S-H2B-mCherry） 和膜marker（pm-rb CD3-1008） 作為對(duì)照。注射完的煙草做好相應(yīng)的標(biāo)記后暗培養(yǎng)12 h，隨后培養(yǎng)室光照培養(yǎng)2 天[25]。使用激光共聚焦掃描顯微鏡（Zeiss LSM900，德國(guó)） 觀察熒光蛋白定位情況。

1.7 植物表達(dá)載體構(gòu)建

植物表達(dá)載體構(gòu)建采用Gateway 技術(shù)。設(shè)計(jì)引物SmZIP11-pDONR222-F、SmZIP11-pDONR222-R （表1） 進(jìn)行目的基因PCR 擴(kuò)增。入門質(zhì)粒的構(gòu)建：純化的PCR 產(chǎn)物首先連接到pDONR222 載體（Invitrogen，Carlsbad，USA），進(jìn)行Gateway?BPClonase 反應(yīng)。反應(yīng)體系為3 μL：PCR 回收產(chǎn)物2 μL，pDONR222 0.4 μL，BP ClonaseTMⅡEnzymeMix 0.6 μL。連接后對(duì)入門質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

植物表達(dá)載體為p K 2 G W 7 . 0。LR 反應(yīng)：將pDONR222-SmZIP11（BP 質(zhì)粒） 與植物表達(dá)載體pK2GW7.0 進(jìn)行LR 反應(yīng)。反應(yīng)體系為5 μL：BP 質(zhì)粒1 μL，表達(dá)載體pK2GW7.0 1 μL，TE buffer 1 μL，LR ClonaseTMⅡEnzyme Mix 1 μL，LR reaction buffer1 μL。測(cè)序正確，得到植物表達(dá)載體pK2GW7.0-SmZIP11。

1.8 楊樹遺傳轉(zhuǎn)化

將構(gòu)建好的pK2GW7.0-SmZIP11 植物表達(dá)載體按照葉盤法[26]轉(zhuǎn)化銀灰楊（Populus × canescens）。轉(zhuǎn)化苗長(zhǎng)至3 cm 左右時(shí)，取0.1 g 左右的葉片，用CTAB法提取再生植株葉片中基因組DNA，并作為模板進(jìn)行兩次PCR 擴(kuò)增，以提高PCR 檢測(cè)的準(zhǔn)確性，第一次PCR 擴(kuò)增所用引物為根據(jù)SmZIP11 的克隆基因序列所設(shè)計(jì)的引物SmZIP11-F 和SmZIP11-R；第二次PCR 擴(kuò)增所用引物為NPTII 基因的特異引物NPTIIF和NPTII-R （表1）。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)其片段大小。用PCR 鑒定的陽(yáng)性植株進(jìn)一步通過(guò)qRT-PCR 鑒定SmZIP11 的表達(dá)量。選取3 個(gè)表達(dá)水平較高的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

將生根后的WT 和轉(zhuǎn)基因株系移栽到通氣的1/2 霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液中[27]，每3 天更換1 次。培養(yǎng)60 天后，在1/2 霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液中用200 μmol/L ZnSO4、100 μmol/L CuSO4 和100 μmol/L CdSO4 分別處理14 天，4 次生物學(xué)重復(fù)，取根、莖和葉稱重。進(jìn)一步測(cè)定轉(zhuǎn)基因楊樹中的重金屬含量。將根浸泡在20 mmol/L EDTA 中30 min，用去離子水徹底清洗。所有樣品在65℃ 下干燥，直到恒重。干燥的樣品在研磨機(jī)（Tissuelyser-48，JINGXIN，上海，中國(guó)） 中研磨成細(xì)粉，稱取研磨樣品至少0.2 g 在微波加速反應(yīng)系統(tǒng)（CEM，Matthews，NC，美國(guó)） 中在120℃～190℃ 下用65% HNO3 和30% H2O2 的混合物（比例為6：1 v/v） 消解。隨后，將樣品轉(zhuǎn)移至容量瓶，定容至25 mL，過(guò)濾。重金屬含量采用電感耦合等離子體光學(xué)發(fā)射光譜（ICP-OES，icap-7400，ThermoFisher，美國(guó)） 測(cè)定[20]，方法參考GB5009.268—2016。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

1.9.1 qRT-PCR 數(shù)據(jù)分析

計(jì)算SmZIP11 基因的相對(duì)表達(dá)水平，對(duì)于分析SmZIP11 基因在不同重金屬脅迫下不同組織中的表達(dá)量，將對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量（y 軸“relative expression”） 設(shè)定為1。用2?ΔΔCt 法計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平[28]。

1.9.2 耐受性指數(shù)

計(jì)算植物耐受性指數(shù)，判斷植物受重金屬脅迫程度。耐受性指數(shù)=（脅迫處理器官干重）/（對(duì)照器官干重）[29]。

1.9.3 轉(zhuǎn)移系數(shù)

轉(zhuǎn)移系數(shù)代表根部向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)的能力。植物體內(nèi)Zn、Cd、Cu 從根向葉或莖的轉(zhuǎn)移系數(shù)（TF） 表達(dá)式為：TF=地上部Zn、Cd、Cu 濃度/根系中Zn、Cd、Cu 濃度[20]。

以上數(shù)據(jù)采用SAS 統(tǒng)計(jì)軟件包（version 9.3，SAS Institute，Cary，NC） 進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。處理間差異采用最小顯著性差異（LSD） 檢驗(yàn)，概率水平為0.05[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 SmZIP11 基因克隆及生物信息學(xué)分析

以饅頭柳根、莖和葉混合cDNA 為模板，通過(guò)PCR 擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的條帶（約1050 bp）（圖1A），經(jīng)測(cè)序后確認(rèn)饅頭柳SmZIP11 基因，包含1053 bp 完整的開放閱讀框，編碼351 個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為5.441，分子量為37.71 kDa。TMHMM 軟件分析表明SmZIP11 蛋白含有9 個(gè)保守的跨膜結(jié)構(gòu)域（圖1B）。SWISS-MODEL 預(yù)測(cè)的SmZIP11 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)含有9 個(gè)螺旋（圖1C）。此外，與其他5 個(gè)物種的ZIP11 蛋白氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，都含有9個(gè)保守的跨膜結(jié)構(gòu)域（圖1D）。由此可見，SmZIP11蛋白含有ZIP 的保守結(jié)構(gòu)域，屬于ZIP 家族成員。

2.2 同源性分析

將饅頭柳、紫紅柳、擬南芥、胡楊、毛果楊等17個(gè)物種的ZIP 基因氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)（圖2）。利用NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得其他相似性高的物種的氨基酸序列，通過(guò)MEGA X 中Neighbor-joining （NJ）phylogenetic tree 構(gòu)建饅頭柳與其它物種ZIP11 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹，顯示同一科的植物物種聚在一起。SmZIP11 蛋白首先與紫紅柳聚在一類，親緣關(guān)系最近，再與楊柳科的其他3 種楊樹聚在一個(gè)小分支上。與大戟科、錦葵科、傘形科植物的ZIP11 親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。此外，與AtZIP11 氨基酸序列相似性為7 9 . 1 %，與S p Z I P 1 1 氨基酸序列相似性為96.59%，屬于ZIP 亞家族。綜合系統(tǒng)發(fā)育樹和蛋白結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明SmZIP11 是ZIP 蛋白家族的成員。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量分析

對(duì)饅頭柳不同組織中SmZIP11 基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析，結(jié)果（圖3） 表明，SmZIP11 基因在饅頭柳根、莖、葉中的表達(dá)受Cd、Zn 和Cu 調(diào)控。在根系中，Cu 處理后，SmZIP11 表達(dá)量有所下降（圖3A）；Cd 處理后SmZIP11 表達(dá)呈先上升后下降的趨勢(shì)，在第4 天時(shí)達(dá)到高峰（圖3B）；Zn 處理7 天以內(nèi)，SmZIP11 的表達(dá)水平?jīng)]有升高，14 天之后劇烈上升（圖3C）。在莖中，Cu 處理使SmZIP11 表達(dá)量緩慢上升，處理2 1 天時(shí)達(dá)到高峰（圖3 D ）；C d 脅迫時(shí)SmZIP11 表達(dá)量雖然有所上升，但是只在處理7 天時(shí)其表達(dá)水平達(dá)到對(duì)照的2 倍（圖3E）；而Zn 脅迫強(qiáng)烈誘導(dǎo)了該基因的表達(dá)，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，處理4 天時(shí)達(dá)到高峰，為對(duì)照的50 倍（圖3F）。在葉片中，3 種重金屬處理都顯著誘導(dǎo)了SmZIP11的表達(dá)，但是趨勢(shì)有所不同；Cu 處理1 天就達(dá)到了高峰，隨后逐漸下降（圖3G）；Cd 處理下SmZIP11的表達(dá)表現(xiàn)出緩慢上升的趨勢(shì)，14 天時(shí)最高（圖3H）；Zn 處理21 天內(nèi)，其表達(dá)量一直上升（圖3I）。 綜上所述，SmZIP11 響應(yīng)多種重金屬脅迫，在不同組織中對(duì)不同的重金屬響應(yīng)時(shí)間不同。

2.4 亞細(xì)胞定位分析

為確定SmZIP11 蛋白的表達(dá)位置， 分別將pBI121-GFP 空載體質(zhì)粒與pBI121-SmZIP11-GFP 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入GV3101 農(nóng)桿菌中，用不帶針頭的注射器將2 種帶有共轉(zhuǎn)膜marker 和核marker 侵染菌液從本氏煙草葉片的下表皮緩緩注入，做好標(biāo)記?？蛰d體用共轉(zhuǎn)膜marker 和核marker 作為陽(yáng)性對(duì)照，重組質(zhì)粒用膜marker 作為對(duì)照。培養(yǎng)兩天后，使用LSM 900 激光共聚焦顯微鏡觀察并保存試驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果（圖4） 顯示，對(duì)照GFP 蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞膜中均有分布，而pBI121-SmZIP11-GFP 融合蛋白在細(xì)胞膜處有明顯的綠色熒光信號(hào)，與膜marker的紅色熒光信號(hào)完全重疊，證明SmZIP11 蛋白定位于細(xì)胞膜。

2.5 轉(zhuǎn)基因楊樹鑒定

通過(guò)轉(zhuǎn)化銀灰楊，經(jīng)卡那霉素抗性篩選到了8株轉(zhuǎn)化植株。采用SmZIP11 引物PCR 鑒定轉(zhuǎn)基因植株，1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物的大小，擴(kuò)增出1053 bp 的特異條帶（圖5A）。此外，用NPTII引物擴(kuò)增出494 bp 的特異條帶（圖5B），片段大小與預(yù)期結(jié)果相同，說(shuō)明表達(dá)載體已經(jīng)成功轉(zhuǎn)化至銀灰楊。實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果顯示，編號(hào)OE2、OE7、OE8的3 個(gè)轉(zhuǎn)基因楊樹株系表達(dá)量較高（圖5C），將這3 個(gè)株系組培苗擴(kuò)繁，用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.6 轉(zhuǎn)基因楊樹耐性指數(shù)測(cè)定

為了進(jìn)一步研究SmZIP11 在轉(zhuǎn)基因楊樹中吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)重金屬的生物學(xué)功能，將3 個(gè)轉(zhuǎn)基因楊樹株系和WT 以水培的方式用3 種重金屬分別進(jìn)行脅迫14 天，測(cè)定不同組織的生物量（圖6）。Cu 和Cd 脅迫降低了轉(zhuǎn)基因株系和野生株系的生物量，而Zn 脅迫提高了轉(zhuǎn)基因株系的生物量。Cu 和Cd 脅迫下3 個(gè)轉(zhuǎn)基因株系根、莖、葉的生物量降幅均小于野生型楊樹株系。在Zn 脅迫下，OE7 植株的根、莖、葉生物量的增幅顯著高于其他株系（圖6A，6B，6C）。Cu 和Zn 脅迫明顯提高了3 個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的耐性指數(shù)，且Zn 脅迫的提升幅度顯著高于Cu 脅迫。Cd 脅迫顯著降低了3 個(gè)轉(zhuǎn)基因株系葉和莖的耐性指數(shù)。OE7 植株根、莖和葉中的Zn 耐受性指數(shù)均顯著高于其他2 個(gè)株系，其他兩個(gè)株系的Zn 耐受性指數(shù)在根和莖中與WT 相比也顯著提高，在葉片中差異不顯著。SmZIP11 基因?qū)u 和Zn 有一定的耐性作用，提高了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)重金屬的耐受性，尤其是對(duì)Zn的耐受性更強(qiáng)（圖6D，6E，6F）。

2.7 重金屬轉(zhuǎn)移系數(shù)測(cè)定

為了研究SmZIP11 在轉(zhuǎn)基因楊樹中對(duì)不同重金屬的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，分別對(duì)脅迫前后的根、莖和葉組織進(jìn)行Cd、Cu 和Zn 的含量測(cè)定（圖7）。重金屬脅迫下的轉(zhuǎn)基因株系和WT 株系根、莖、葉中的Cd、Cu 和Zn 含量顯著高于非脅迫處理（圖7A，7C，7E），且轉(zhuǎn)基因楊樹根、莖和葉中的Cd 含量均顯著高于野生型楊樹（圖7A）；Zn 元素是植物本身必需微量元素，轉(zhuǎn)基因楊樹Zn 含量只在葉片中比WT 顯著增加，維持根系及莖中Zn 含量穩(wěn)態(tài)（圖7E）；Cu 在根中的含量高于葉片和莖，很少轉(zhuǎn)移到地上部（圖7C）。轉(zhuǎn)基因植株中Cd、Cu 和Zn 的濃度普遍升高，表明SmZIP11 基因通過(guò)根系促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)Cd、Cu和Zn 的吸收。通過(guò)分析重金屬轉(zhuǎn)移系數(shù)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)Cu 向地上部分的轉(zhuǎn)移能力無(wú)顯著提高（圖7D）；OE7 和OE8 兩個(gè)植株對(duì)Cd 向莖的轉(zhuǎn)移能力顯著提高（圖7B）；3 個(gè)轉(zhuǎn)基因植株均對(duì)Zn 向葉片的轉(zhuǎn)移能力顯著提高（圖7F）。以上結(jié)果表明SmZIP11基因可能提高了轉(zhuǎn)基因楊樹向地上部運(yùn)輸Cd 和Zn金屬離子的能力。

綜上所述，SmZIP11 促進(jìn)了Cu 的吸收并富集在根部，增強(qiáng)了Cd 和Zn 從根系向地上部分的轉(zhuǎn)運(yùn)作用，對(duì)改善Cd 和Zn 污染地區(qū)的生物修復(fù)研究具有一定的意義。

3 討論

ZIP 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白普遍存在于植物、細(xì)菌、真菌和人類中[30]，迄今為止對(duì)植物ZIP 家族成員的功能研究集中在ZIP1～ZIP9，對(duì)其他成員的研究非常有限。植物ZIP 家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白預(yù)計(jì)有6～9 個(gè)或者更多的跨膜結(jié)構(gòu)域（α-螺旋），其中8 個(gè)是最普遍的形式，跨膜結(jié)構(gòu)域IV 中有鋅鐵轉(zhuǎn)運(yùn)家族蛋白最保守的部分，C 和N 端位于質(zhì)膜結(jié)構(gòu)兩側(cè)[31]。分子量從33.1 到51.4 kDa不等，具有322 到478 個(gè)氨基酸不等，等電點(diǎn)值在5.31～8.92。研究發(fā)現(xiàn)，ZIP 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在不同物種間具有很好的保守性和相似的理化性質(zhì)[ 3 2 ]。在蘋果（Malus domestica） 和玉米（Zea mays） 基因組中分別鑒定出了18 和12 個(gè)ZIP 成員，多數(shù)含有8 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域[33?34]，比較特殊的是ZmZIP12 最多有13 個(gè)TM 結(jié)構(gòu)域，可能與結(jié)合的底物運(yùn)出質(zhì)膜有關(guān)。本研究結(jié)果表明饅頭柳中SmZIP11 基因，編碼351 個(gè)氨基酸，含有9 個(gè)保守的跨膜結(jié)構(gòu)域，該基因編碼的蛋白定位于細(xì)胞膜。SmZIP11 的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與已知5 個(gè)物種的ZIP 家族其他基因成員相似?？傊?，SmZIP11 含有ZIP 的保守結(jié)構(gòu)域，屬于典型的ZIP家族成員。

目前研究表明，ZIP 基因家族是一類調(diào)節(jié)植物離子吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，參與金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)的ZIP 家族成員主要有ZNT1、IRT1、ZIP1、ZIP2、ZIP3、ZIP4、ZIP6 等[ 3 5 ]，具有轉(zhuǎn)運(yùn)多種陽(yáng)離子如Cd2+、Cu2+、Fe2+、Mn2+和Zn2+等的能力[10]。ZIP11 基因在植物吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)重金屬中的作用報(bào)道較少，目前我們也只獲得了水稻（Oryza sativa） OsZIP11、枳殼（Poncirus trifoliate） PtZIP11 和煙草（Nicotianatabacum） NtZIP11 的一些基本信息[36?39]。本研究分析了Cd、Zn 和Cu 脅迫下的SmZIP11 基因在不同組織中（根、莖、葉） 的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，植株受到重金屬Cd、Cu 和Zn 脅迫時(shí)SmZIP11在葉片和莖中顯著上調(diào)表達(dá)，所有組織中受Cd 和Zn 誘導(dǎo)。這一結(jié)果與煙草中NtZIP11 基因表現(xiàn)基本相同，當(dāng)高鋅脅迫時(shí)，煙草葉片中NtZIP11 顯著性上調(diào)，但在根的頂端和基部未檢測(cè)到；隨著煙草植株年齡的增長(zhǎng)，NtZIP11 在根和葉中的表達(dá)豐度增加[37]；擬南芥生態(tài)型AhZIP6-1 在莖中表達(dá)更高，而AhZIP6-2 在根中表達(dá)更高[40]。與煙草不同的是，在水稻中，缺Fe 誘導(dǎo)下，根和地上部OsZIP11 表達(dá)水平顯著升高，但在缺Zn 和Cu 的情況下則不然。這表明OsZIP11 功能可能與水稻中鐵的獲取或積累有關(guān)[38]；同時(shí)在擬南芥的AtZIP11 研究中發(fā)現(xiàn)，Zn 限制條件下AtZIP11 轉(zhuǎn)錄水平在地上部中有所增加，其可能在缺鋅狀態(tài)下促進(jìn)了擬南芥對(duì)鋅的獲取[41]；另外玉米ZIP 基因家族包含12 個(gè)成員，ZmZIP11 在玉米旗葉中表達(dá)量較高，可能對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)鋅有一定的作用[33]。存在以上這些差異可能是由于物種、ZIP 蛋白結(jié)構(gòu)和在各植物中實(shí)施的功能不同有關(guān)。

我國(guó)優(yōu)質(zhì)耕地資源短缺，需對(duì)重金屬污染土壤進(jìn)行修復(fù)再次利用。土壤重金屬污染嚴(yán)重，需通過(guò)植物將土壤中的重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)并存儲(chǔ)到地上部，減少土壤中重金屬含量[42]。試驗(yàn)中，在Zn、Cu 和Cd 處理下，轉(zhuǎn)基因楊樹中各離子濃度與對(duì)照組相比顯著升高，表明SmZIP11 基因?qū)χ参镂罩亟饘倏赡苡写龠M(jìn)作用。SmZIP11 基因的過(guò)表達(dá)賦予了植物對(duì)重金屬的耐受性，實(shí)驗(yàn)組中根、莖、葉的耐性指數(shù)均對(duì)Zn 和Cu 有不同程度的升高，尤其對(duì)Zn 離子。此外研究表明ZIP 家族基因?qū)n、Fe、Cd 等金屬離子具有轉(zhuǎn)運(yùn)作用[43]，同樣SmZIP11 基因也具備相類似的功能，轉(zhuǎn)基因植株將Cu 富集于根部；將Cd 向莖中轉(zhuǎn)移，Zn 向葉片中轉(zhuǎn)移。在擬南芥中AtZIP11 是鋅的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，并且可以與鐵離子結(jié)合[44]。相比較而言，ZIP 家族成員對(duì)Zn 更加親和，雖然轉(zhuǎn)運(yùn)Cd、Cu 等，但是對(duì)其不具有專一性[45]。NtZIP11 的主要作用是高鋅濃度時(shí)負(fù)責(zé)煙草葉片細(xì)胞對(duì)鋅的吸收，并且依賴于NtWAK2 衍生的信號(hào)[ 3 6 ? 3 7 ]，但是N t Z I P 1 1 不參與C d 和F e 轉(zhuǎn)運(yùn)。在枳殼中，PtZIP11 被認(rèn)為與Mn 轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，而與Zn 或Fe 轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)關(guān)[39]。OsZIP11 是水稻生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中鐵獲取所必需的[38]。在本研究中，SmZIP11 不僅受Zn 脅迫誘導(dǎo)，還提高了對(duì)Zn 的耐性，促進(jìn)了向葉片的轉(zhuǎn)移。因此對(duì)ZIP 基因作物進(jìn)行基因改造有助于Zn 等重金屬污染地區(qū)植物修復(fù)。本研究結(jié)果對(duì)SmZIP11 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的鑒定以及功能進(jìn)行了驗(yàn)證，利用這些信息，通過(guò)轉(zhuǎn)基因或標(biāo)記輔助選擇來(lái)設(shè)計(jì)高生物量超積累型作物，為植物修復(fù)品種篩選提供了新思路，對(duì)調(diào)控饅頭柳對(duì)重金屬的耐受性具有重要意義。

4 結(jié)論

鐵鋅運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白ZIPs 家族成員中的SmZIP11 基因定位于細(xì)胞膜，當(dāng)植株受到重金屬脅迫時(shí)，SmZIP11基因在植物體內(nèi)表達(dá)上調(diào)，尤其在根、莖和葉片中受Cd 和Zn 脅迫顯著上調(diào)。轉(zhuǎn)SmZIP11 基因楊樹較野生型顯示了更高的吸收和運(yùn)轉(zhuǎn)Zn 和Cd 的能力，并提高了對(duì)Cd、Zn、Cu 脅迫的耐受能力。因此，SmZIP11 基因是提高楊樹重金屬修復(fù)能力的基因。

參 考 文 獻(xiàn)：

[ 1 ]生態(tài)環(huán)境部、國(guó)土資源部. 全國(guó)土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)[EB/OL].（2014-04-17）[2023-12-02]. https：//www.mee.gov.cn/gkml/sthjbgw/qt/201404/t20140417_270670.htm.

Ministry of Ecology and Environment， Ministry of Land andResources of the People’s Republic of China. National soil pollutionsurvey bulletin[EB/OL]. （2014-04-17）[2023-12-02]. https：//www.mee.gov.cn/gkml/sthjbgw/qt/201404/t20140417_270670.htm.

[ 2 ] 孫劍鑫. 2020年全國(guó)生態(tài)環(huán)境質(zhì)量簡(jiǎn)況（一）[J]. 環(huán)境經(jīng)濟(jì)， 2021，（7）： 8?9.

Sun J X. Overview of national ecological environment quality in2020[J]. Environmental Economics， 2021， （7）： 8?9.

[ 3 ]朱臻， 楊相東， 徐章倩， 等. 農(nóng)作物葉片對(duì)大氣沉降重金屬的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)和積累機(jī)制[J]. 植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)， 2021， 27（2）： 332?345.

Zhu Z， Yang X D， Xu Z Q， et al. Foliar uptake， translocation andaccumulation of heavy metals from atmospheric deposition incrops[J]. Journal of Plant Nutrition and Fertilizers， 2021， 27（2）：332?345.

[ 4 ]劉源， 崔二蘋， 李中陽(yáng)， 等. 養(yǎng)殖廢水灌溉下施用生物質(zhì)炭和果膠對(duì)土壤養(yǎng)分和重金屬遷移的影響[J]. 植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)， 2018，24（2）： 424?434.

Liu Y， Cui E P， Li Z Y， et al. Migration of nutrient and heavy metalsimpacted by biochar and pectin under the irrigation with livestockwastewater[J]. Journal of Plant Nutrition and Fertilizers， 2018， 24（2）：424?434.

[ 5 ]楊旭， 余垚， 李花粉， 等. 我國(guó)與歐美化肥重金屬限量標(biāo)準(zhǔn)的比較和啟示[J]. 植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)， 2019， 25（1）： 149?156.

Yang X， Yu Y， Li H F， et al. Comparison of heavy metal limits forchemical fertilizers in China， EU and US and enlightenments[J].Journal of Plant Nutrition and Fertilizers， 2019， 25（1）： 149?156.

[ 6 ]Bhat S A， Bashir O， Haq S A U， et al. Phytoremediation ofheavy metals in soil and water： An eco-friendly， sustainable andmultidisciplinary approach[J]. Chemosphere， 2022， 303： 134788.

[ 7 ]Kuzovkina Y A， Volk T A. The characterization of willow （Salix L.）varieties for use in ecological engineering applications： Co-ordinationof structure， function and autecology[J]. Ecological Engineering，2009， 35（8）： 1178?1189.

[ 8 ]Thijs S， Witters N， Janssen J， et al. Tobacco， sunflower and highbiomass src clones show potential for trace metal phytoextraction ona moderately contaminated field site in Belgium[J]. Frontiers in PlantScience， 2018， 9： 1879.

[ 9 ]Tozsér D， Magura T， Simon E. Heavy metal uptake by plant parts ofwillow species： A meta-analysis[J]. Journal of Hazardous Materials，2017， 336： 101?109.

[10]Yang Z， Yang F， Liu J L， et al. Heavy metal transporters： Functionalmechanisms， regulation， and application in phytoremediation[J].Science of the Total Environment， 2022， 809： 151099.

[11]Kambe T， Hashimoto A， Fujimoto S. Current understanding of ZIPand ZnT zinc transporters in human health and diseases[J]. Cellularand Molecular Life Sciences， 2014， 71（17）： 3281?3295.

[12]Milner M J， Seamon J， Craft E， Kochian LV. Transport properties ofmembers of the ZIP family in plants and their role in Zn and Mnhomeostasis[J]. Journal of Experimental Botany， 2013， 64（1）：369?381.

[13]Yang X， Huang J， Jiang Y， et al. Cloning and functional identificationof two members of the ZIP （Zrt， Irt-like protein） gene family in rice（Oryza sativa L.）[J]. Molecular Biology Reports， 2009， 36（2）： 281?287.

[14]Lee S， Kim S A， Lee J， et al. Zinc deficiency-inducible OsZIP8encodes a plasma membrane-localized zinc transporter in rice[J].Molecules and Cells， 2010， 29： 551?558.

[15]Lee S， Jeong H J， Kim S A， et al. OsZIP5 is a plasma membrane zinctransporter in rice[J]. Plant Molecular Biology， 2010， 73： 507?517.

[16]Huang S， Sasaki A， Yamaji N， et al. The ZIP transporter familymember OsZIP9 contributes to root zinc uptake in rice underzinc-limited conditions[J]. Plant Physiology， 2020， 183（3）： 1224?1234.

[17]Shi X， Wang S F， Sun H J， et al. Comparative of Quercus spp.and Salix spp. for phytoremediation of Pb/Zn mine tailings[J].Environmental Science and Pollution Research， 2017， 24（4）：3400?3411.

[18]Landberg T， Greger M. Phytoremediation using willow in industrialcontaminated soil[J]. Sustainability， 2022， 14（14）： 8449.

[19]楊衛(wèi)東， 陳益泰. 不同杞柳品種對(duì)鎘 （Cd） 吸收與忍耐的差異[J]. 林業(yè)科學(xué)研究， 2008， 21（6）： 857?861.

Yang W D， Chen Y T. Differences in uptake and tolerance to cadmiumin varieties of Salix integra[J]. Forest Research， 2008， 21（6）： 857?861.

[20]Han X， Zhang Y， Yu M， et al. Transporters and ascorbate–glutathionemetabolism for differential cadmium accumulation and tolerance intwo contrasting willow genotypes[J]. Tree Physiology， 2020， 40（8）：1126?1142.

[21]Yu M， Zhuo R Y， Li S C， et al. Molecular insights into ligninbiosynthesis on cadmium tolerance： Morphology， transcriptome andproteome profiling in Salix matsudana[J]. Journal of HazardousMaterials， 2022， 441： 129909.

[22]Watson C， Pulford I， Riddell-Black D. Heavy metal toxicityresponses of two willow （Salix） varieties grown hydroponically：Development of a tolerance screening test[J]. EnvironmentalGeochemistry and Health， 1999， 21： 359?364.

[23]Chen S X， Chen J J， Lu Z C， et al. Genome-wide identification ofpleiotropic drug resistance （pdr） transporters in Salix purpurea andexpression analysis in response to various heavy metal stresses[J].Agronomy， 2023， 13（9）： 2330.

[24]Zhang Y X， Han X J， Chen S S， et al. Selection of suitable referencegenes for quantitative real-time PCR gene expression analysis in Salixmatsudana under different abiotic stresses[J]. Scientific Reports，2017， 7（1）： 40290.

[25]Sun H J， Uchii S， Watanabe S， Ezura H. A highly efficienttransformation protocol for Micro-Tom， a model cultivar fortomato functional genomics[J]. Plant and Cell Physiology，2006， 47（3）： 426?431.

[26]Zhou H J， Song X Q， Wei K L， et al. Growth-regulating factor 15 isrequired for leaf size control in Populus[J]. Tree Physiology， 2019，39（3）： 381?390.

[27]Yu M， He Z Q， Li S C， et al. SpHsfA4c from Sedum plumbizincicolaenhances Cd tolerance by the AsA-GSH pathway in transgenicPopulus x canescens[J]. Agronomy-Basel， 2023 13（3）： 760.

[28]Zou J H， Wang G， Ji J， et al. Transcriptional， physiological andcytological analysis validated the roles of some key genes linked Cdstress in Salix matsudana Koidz[J]. Environmental and ExperimentalBotany， 2017， 134： 116?129.

[29]Yang W D， Zhao F L， Zhang X C， et al. Variations of cadmiumtolerance and accumulation among 39 Salix clones： Implications forphytoextraction[J]. Environmental Earth Sciences， 2015， 73（7）：3263?3274.

[30]Gaither L A， Eide D J. Eukaryotic zinc transporters and theirregulation[J]. Biometals， 2001， 14（3/4）： 251?270.

[31]Guerinot M L. The ZIP family of metal transporters[J]. Biochimica etBiophysica Acta， 2000， 1465（1/2）： 190?198.

[32]Vatansever R， ?zyi?it ? ?， Filiz E. Comparative and phylogeneticanalysis of zinc transporter genes/proteins in plants[J]. TurkishJournal of Biology， 2016， 40（3）： 600?611.

[33]Mondal T K， Ganie S A， Rana M K， Sharma T R. Genome-wideanalysis of zinc transporter genes of maize （Zea mays）[J]. PlantMolecular Biology Reporter， 2014， 32： 605?616.

[34]Ma X C， Liu H， Cao H R， et al. Genome-wide analysis of zinc- andiron-regulated transporter-like protein family members in apple andfunctional validation of ZIP10[J]. Biometals， 2019， 32（4）： 657?669.

[35]曹玉巧， 聶慶凱， 高云， 等. 植物中鎘及其螯合物相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白研究進(jìn)展[J]. 作物雜志， 2018， （3）： 15?24.

Cao Y Q， Nie Q K， Gao Y， et al. The studies on cadmium and itschelate related transporters in plants[J]. Crops， 2018， （3）： 15?24.

[36]Weremczuk A， Papierniak A， Kozak K， et al. Contribution ofNtZIP1-like， NtZIP11 and a WAK-pectin based mechanism to theformation of Zn-related lesions in tobacco leaves[J]. Environmentaland Experimental Botany， 2020， 176： 104074.

[37]Kozak K， Papierniak A， Barabasz A， et al. NtZIP11， a new Zntransporter specifically upregulated in tobacco leaves by toxic Znlevel[J]. Environmental and Experimental Botany， 2019， 157： 69?78.

[38]Zhao Y N， Li C， Li H， et al. OsZIP11 is a trans-Golgi-residingtransporter required for rice iron accumulation and development[J].Gene， 2022， 836： 146678.

[39]Fu X Z， Zhou X， Xing F， et al. Genome-wide identification， cloningand functional analysis of the zinc/iron-regulated transporter-likeprotein （ZIP） gene family in trifoliate orange （Poncirus trifoliata L.Raf.）[J]. Frontiers in Plant Science， 2017， 8： 588.

[40]Spielmann J， Ahmadi H， Scheepers M， et al. The two copies of thezinc and cadmium ZIP6 transporter of Arabidopsis halleri havedistinct effects on cadmium tolerance[J]. Plant Cell and Environment，2020， 43（9）： 2143?2157.

[41]Kr?mer U， Talke I N， Hanikenne M. Transition metal transport[J].Febs Letters， 2007， 581（12）： 2263?2272.

[42]Pence N S， Larsen P B， Ebbs S D， et al. The molecular physiology ofheavy metal transport in the Zn/Cd hyperaccumulator Thlaspicaerulescens[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America， 2000， 97（9）： 4956-4960.

[43]Ma?Ser P， Thomine S， Schroeder J I， et al. Phylogenetic relationshipswithin cation transporter families of Arabidopsis[J]. Plant Physiology，2001， 126（4）： 1646?1667.

[44]楊啟慧. 擬南芥鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ZIP11的功能鑒定[D]. 內(nèi)蒙古呼和浩特： 內(nèi)蒙古大學(xué)碩士學(xué)位論文， 2021.

Yang Q H. Functional identification of zinc transporter ZIP11 inArabidopsis thaliana[D]. Hohhot， Inner Mongolia： MS Thesis ofInner Mongolia University， 2021.

[45]孟璐， 孫亮， 譚龍濤. 水稻鋅鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ZIP基因家族研究進(jìn)展[J].遺傳， 2018， 40（1）： 33?43.

Meng L， Sun L， Tan L T. Progress in ZIP transporter gene family inrice[J]. Genetics， 2018， 40（1）： 33?43.

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2021YFD2200201）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31872168）。