過氧化氫在水稻鎘耐受及吸收分配中的作用機(jī)理

摘要： 【目的】研究鎘（Cd） 脅迫下不同濃度過氧化氫（H2O2） 對(duì)水稻幼苗生長、根系發(fā)育及活性氧、Cd 含量的影響，闡明H2O2 在水稻Cd 耐受和吸收分配中的作用機(jī)理?！痉椒ā坎捎盟嘣囼?yàn)方法，供試材料為粳型水稻（Oryza sativa L.，ZH11）。在水稻營養(yǎng)液中添加10 μmol/L CdCl2 進(jìn)行Cd 脅迫，同時(shí)分別添加0、20、80 μmol/LH2O2 溶液，以正常營養(yǎng)液培養(yǎng)為對(duì)照（CK）。處理1 天后取根系鮮樣測定水稻幼苗內(nèi)源H2O2、超氧陰離子含量；處理30 天后，測定水稻幼苗倒二葉的SPAD 值、株高、根系形態(tài)、干物質(zhì)重、Cd2+含量，提取根表鐵膜及亞細(xì)胞組份。為驗(yàn)證外源H2O2 在Cd 脅迫中的作用，設(shè)置了H2O2 清除劑碘化鉀（KI） 添加試驗(yàn)，對(duì)水稻幼苗進(jìn)行10 μmol/L CdCl2+20 μmol/L KI 和20 μmol/L KI 處理。處理20 天時(shí)，測定水稻幼苗倒二葉的SPAD 值和株高。從CK 和10 μmol/L CdCl2、10 μmol/L CdCl2+20 μmol/L H2O2 處理1 天的水稻根中提取總RNA?！窘Y(jié)果】Cd 脅迫下，水稻生長受到抑制，外源添加H2O2 顯著緩解了水稻Cd 脅迫，且隨著濃度增加緩解效果減弱，但添加KI 加劇Cd 脅迫造成的抑制作用。20 μmol/L H2O2 處理下，水稻株高較無H2O2 處理增加了35.1%，倒二葉SPAD 值提高了50.5%，地上部和根部干重分別顯著提高227.1% 和339.0%，根系形態(tài)參數(shù)（總根長、根表面積、根體積、根尖數(shù)） 顯著增加。Cd 脅迫導(dǎo)致水稻幼苗根中超氧陰離子含量顯著增加，外源添加H2O2 可以顯著降低超氧陰離子含量。外源H2O2 通過下調(diào)OsNRAMP5 的表達(dá)水平，降低水稻對(duì)Cd 的吸收，根和地上部中Cd 離子含量均顯著下降。此外，H2O2 處理促進(jìn)水稻根表鐵膜的形成，吸附較多的Cd 離子在根表，抑制了Cd 從根表向根內(nèi)的轉(zhuǎn)移。在根內(nèi)，H2O2 處理上調(diào)了果膠的合成和果膠甲酯酶基因表達(dá)水平，促進(jìn)了細(xì)胞壁中Cd 的區(qū)隔化，降低了細(xì)胞質(zhì)中Cd 含量，從而減輕Cd 的細(xì)胞毒性?！窘Y(jié)論】外源添加適宜水平的H2O2 可降低O+2造造成的氧化損傷，同時(shí)下調(diào)OsNRAMP5 的表達(dá)水平，減少水稻對(duì)Cd 的吸收。外源H2O2 還可促進(jìn)水稻根表形成鐵膜，抑制Cd2+從根表向根內(nèi)的轉(zhuǎn)移，促進(jìn)細(xì)胞壁中Cd 的區(qū)隔化，干擾細(xì)胞質(zhì)中Cd 的移動(dòng)，從而減輕Cd 的細(xì)胞毒性，提高水稻抗Cd 脅迫能力。但外源高水平H2O2 緩解水稻Cd 脅迫的效果大幅減弱，這可能與其抑制根表鐵膜的形成有關(guān)。

關(guān)鍵詞： 水稻； 活性氧； 過氧化氫； 鎘吸收； 細(xì)胞壁修飾

鎘（Cd） 不是植物生長發(fā)育所必需的元素，但其易被根系吸收并向地上部運(yùn)輸積累[1]。植物地上部積累的Cd 通過食物鏈進(jìn)入人體，危害人體健康導(dǎo)致多種疾病[2]。植物積累的Cd 會(huì)增大細(xì)胞膜的通透性，降低葉綠素和類胡蘿卜素含量及抗氧化酶活性，導(dǎo)致植物光合作用減弱，植株生長受抑制[3?6]。Cd 主要通過破壞生物分子官能團(tuán)和電子傳遞鏈導(dǎo)致活性氧（reactive oxygen species， ROS） 的積累，造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷、膜脂質(zhì)過氧化，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致植物死亡[7?8]。

Cd 與其他植物必需的微量金屬元素具有相似的理化性質(zhì)，主要通過其他必需金屬元素（如Fe2 +、Mn2+和Zn2+） 的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入植物根系 [9]。OsIRT1 在根系中受缺鐵誘導(dǎo)表達(dá)，促進(jìn)Cd 的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)[10]。OsNRAMP1 參與水稻對(duì)Cd 的吸收和運(yùn)輸[ 1 1 ? 1 2 ]。OsNRAMP5 是一個(gè)參與水稻根系Cd 和錳（Mn） 吸收的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，敲除之后能減少水稻對(duì)Cd 的吸收[13?14]。OsCd1 屬于MFS 超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是水稻根系Cd吸收的主要促進(jìn)因子，參與水稻籽粒Cd 積累[15]。

根對(duì)Cd 的耐受和積累與Cd 和細(xì)胞壁結(jié)合的能力密切相關(guān)[16]。研究表明，細(xì)胞壁通過阻止Cd 進(jìn)入根細(xì)胞來提高植物對(duì)Cd 的耐受性[17]。細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠組成，其中果膠是細(xì)胞壁與重金屬結(jié)合的主要成分[18?19]。細(xì)胞壁中的果膠甲酯酶（PME） 可以水解果膠中的甲酯基，釋放甲醇并降低甲酯化程度，增加游離羥基（―OH） 和羧基（―COOH）的數(shù)量，從而有助于結(jié)合更多的Cd 離子[20?21]。

過氧化氫（H2O2） 是ROS 代謝的產(chǎn)物，它既是一種強(qiáng)氧化劑，對(duì)體內(nèi)正常分子產(chǎn)生破壞作用，同時(shí)它也是重要的信號(hào)分子，調(diào)控植物的生長和環(huán)境適應(yīng)性[22?23]。植物體內(nèi)ROS 爆發(fā)產(chǎn)生的H2O2 是植物病原體防御反應(yīng)和植物適應(yīng)非生物脅迫的重要信號(hào)[24?25]。H2O2 在低濃度水平時(shí)作為信號(hào)分子，促進(jìn)種子萌發(fā)、氣孔開放，提高葉綠素含量，延緩衰老[26]，改善植物在逆境脅迫下的生長發(fā)育情況和抗氧化防御能力[27]。干旱和鹽脅迫下，H2O2 預(yù)處理提高了植物細(xì)胞內(nèi)過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX） 等的活性，從而提高了植物對(duì)滲透脅迫的耐受性和抗鹽脅迫能力[28?29]。低溫脅迫下，H2O2 （0.1 mmol/L） 處理提高了CAT、超氧化物歧化酶（SOD） 的活性，促進(jìn)了番茄植株的生長和光合效率，保護(hù)植物免受低溫脅迫[30]。

在重金屬脅迫中，H2O2 通過增強(qiáng)過氧化物酶（POD）、CAT、SOD 和APX 等抗氧化酶的活性，減少活性氧的積累來保護(hù)水稻的光合活性免受砷（As）毒害[31]，提高番茄對(duì)銅（Cu） 脅迫的耐性[27]。鋁（Al）脅迫下，外源低濃度H2O2 作為信號(hào)分子，通過抑制H2O2 合成相關(guān)酶的活性，降低細(xì)胞壁中H2O2 含量，從而減少木質(zhì)素的沉積以及鋁離子在水稻根尖的積累，緩解鋁毒引起的木質(zhì)化作用[32?33]。大量的研究發(fā)現(xiàn)，Cd 脅迫導(dǎo)致植物體內(nèi)積累大量的ROS，造成植物細(xì)胞受到氧化損傷。外源添加低濃度H2O2 可以提高脅迫環(huán)境下植物的抗氧化脅迫能力，然而關(guān)于外源H2O2 處理緩解Cd 毒害及影響植物對(duì)Cd 吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)的報(bào)道較少。

本研究通過水培研究了Cd 脅迫下外源H2O2 對(duì)水稻（Oryza sativa L.，ZH11） 幼苗生長、細(xì)胞脂膜過氧化、細(xì)胞Cd 吸收轉(zhuǎn)運(yùn)特征的影響，探討外源H2O2 緩解水稻幼苗Cd 毒性的機(jī)制，為水稻的安全高效生產(chǎn)提供理論和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料和試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)材料為水稻“中花11 號(hào)”（Oryza sativa L.，ZH11）。水稻種子在0.05% （V/V） 的咪鮮胺中破除休眠14 h，用自來水沖洗干凈，置于去離子水中在37℃ 黑暗條件下浸泡，24 h 后將種子放置在濕潤的信封袋中進(jìn)行催芽。將露白發(fā)芽的水稻種子播于含水稻營養(yǎng)液的96 孔塑料板中，置于植物生長溫室中正常培養(yǎng)。幼苗長至1 葉1 心時(shí)，挑選長勢整齊、形態(tài)良好的幼苗進(jìn)行水培。將莖底部用裁剪好的海綿小心包住并固定于育苗板上，定植于裝有6 L 營養(yǎng)液（pH=5.8） 的8 L 水培盆中，盆外圍裹黑色膠帶以減少營養(yǎng)液中藻類生長。將水培盆置于溫室中培養(yǎng)，保持相對(duì)濕度60%，恒溫26℃，光照周期為16 h 光照、8 h 黑暗，光照強(qiáng)度300 μmol/（m2·s） 的生長環(huán)境，每3 天更換1 次營養(yǎng)液。

幼苗培養(yǎng)至2 葉1 心時(shí)進(jìn)行處理，以正常營養(yǎng)液培養(yǎng)為對(duì)照，記為CK；6 L 的營養(yǎng)液中加入600 μL濃度為100 mmol/L 的CdCl2 溶液，營養(yǎng)液中CdCl2的終濃度為10 μmol/L，記為Cd；在CdCl2 脅迫下外源添加20、80 μmol/L H2O2，添加方式為：分別在6 L的營養(yǎng)液中加入1200、4800 μL 濃度為100 mmol/L的H2O2 溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用），營養(yǎng)液中H2O2 的終濃度分別為20、80 μmol/L，分別記為20 H2O2、80 H2O2。處理1 天后取根系鮮樣測定水稻幼苗內(nèi)源H2O2 和O-2含量；處理30 天后測定水稻植株高度、生物量、Cd 離子含量等指標(biāo)，選擇倒二葉測定SPAD 值。

為驗(yàn)證H2O2 在Cd 脅迫中的作用，設(shè)置了H2O2清除劑碘化鉀（KI） 添加試驗(yàn)[ 3 4 ]，對(duì)水稻幼苗進(jìn)行10 μmol/L CdCl2+20 μmol/L KI 和20 μmol/L KI 處理，6 L 的營養(yǎng)液中加入1200 μL 濃度為100 mmol/L的KI 溶液，營養(yǎng)液中KI 的終濃度為20 μmol/L，處理20 天時(shí)測定株高和倒二葉的SPAD 值。

轉(zhuǎn)錄組樣品制備：水稻在正常條件下培養(yǎng)3 天后，進(jìn)行10 μmol/L CdCl2、10μmol/L CdCl2+20 μmol/LH2O2 處理，以僅營養(yǎng)液培養(yǎng)為對(duì)照。處理1 天后取大小相對(duì)一致的根系置于液氮中，一個(gè)根系為1 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 生長指標(biāo)的測定

用直尺測量幼苗莖基部至頂端葉尖的長度，即為株高。選取水稻幼苗完全展開的倒二葉，利用SPAD儀（SPAD-502 Chlorophyll Meter Model， Konica Minolta，Japan） 測定葉片SAPD 值。選取7 株完整的水稻幼苗植株，采用根系掃描儀器（MRS-9600TFU2L， MICROTEK，China） 和萬深LA-S 根系圖像分析系統(tǒng)分別對(duì)根系總長、根系表面積、根體積和根尖數(shù)進(jìn)行掃描分析，測定根系形態(tài)。用純水清洗根系3 次，吸水紙吸干根系表面水分后，將地上部和根部分別放入信封中進(jìn)行105℃ 殺青30 min，75℃ 烘干至恒重，得到地上部、根部干重。

1.3 水稻幼苗根部抗氧化系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)測定

H2O2 使用過氧化氫含量檢測試劑盒（Abbikne，USA） 檢測，超氧陰離子（ ） 使用超氧陰離子含量試劑盒（Abbikne， USA） 檢測。水稻幼苗根鮮樣加入提取液進(jìn)行冰浴勻漿，離心后取上清液待測，按照試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作。

1.4 根表鐵膜的提取和測定

根表鐵膜的提取采用連二亞硫酸鈉?檸檬酸鈉?碳酸氫鈉提取法（DCB 法）。取整株根系用去離子水清洗3 次，并用紙吸干表面水分，然后將根系浸沒于45 mL 的DCB 提取液中（包含40 mL 的0.27 mol/L檸檬酸鈉，5 mL 的0.11 mol/L 碳酸氫鈉，3 g 連二亞硫酸鈉）[35]。在25℃、180 r/min 的條件下振蕩3 h 后過濾，稀釋后用ICP 質(zhì)譜儀（NexION 350X， Perkin-Elmer， America） 測定離子含量。同時(shí)上述的根系用去離子水清洗3 次，烘干至恒重，稱重。鐵膜離子濃度=鐵膜的離子含量/根干重，根表向根內(nèi)的Cd2+轉(zhuǎn)移系數(shù)=根內(nèi)Cd2+含量/根表Cd2+含量。

1.5 離子含量的測定

將地上部和去除鐵膜后的根部烘干樣粉碎，加入HNO3∶HClO4 （5∶1， V/V） 混合溶液消化，定容稀釋一定倍數(shù)后用ICP-MS 質(zhì)譜儀（NexION350X，PerkinElmer， America） 測定Cd 離子含量[36]。根向地上部的Cd2+轉(zhuǎn)移系數(shù)=地上部Cd2+含量/根內(nèi)Cd2+含量。

1.6 亞細(xì)胞組分的提取

采用差速離心法提取亞細(xì)胞組分[37]。提取液成分包含二硫蘇糖醇（DTT） 1 mmol/L，蔗糖250 mmol/L，Tris-HCl （pH=7.5）。將0.5 g 水稻鮮樣加入8 mL 提取液進(jìn)行冰浴勻漿。得到的勻漿以6000 ×g 離心10 min，殘?jiān)M成為細(xì)胞壁，濾液以20000 ×g 離心45 min，所得顆粒為細(xì)胞器，濾液為可溶性部分。所有步驟均在4℃ 下進(jìn)行，兩次離心的沉淀都烘干稱重。以HNO3∶HClO4 （5∶1， V/V） 混合溶液消煮各部分，隨后定容稀釋，待測。

1.7 果膠的提取及糖醛酸含量的測定

果膠的提取參照Yang 等[38]的方法，取0.01 g 冷凍干燥的細(xì)胞壁放入離心管中，加入含有1.5 mL 0.1%NaBH4 （pH=4） 的0.5% 醋酸銨緩沖液，在沸水浴中煮1 h，13200 r/min 離心10 min，取上清液于干凈的離心管中，重復(fù)此步驟1 次，合并兩次所得上清液即為果膠成分。采用硫酸?苯酚比色法測定果膠糖醛酸含量[39]。取600 μL 果膠提取物加入3 mL 的98%H2SO4 （含0.0125 mol/L Na2B4O7），100℃ 水浴5 min。冷卻至室溫后，加入60 μL 的0.15% 間羥基聯(lián)苯（用0.5% NaOH 溶解），室溫、黑暗條件下反應(yīng)30min。在520 nm 處測定吸光度，果膠濃度用半乳糖醛酸當(dāng)量表示。

1.8 轉(zhuǎn)錄組測序及數(shù)據(jù)分析

總RNA 的提取使用RNAiso? Plus 試劑（TakaraBio， Japan），從CK、10 μmol/L CdCl2、10 μmol/LCdCl2+ 20 μmol/L H2O2 處理1 天的根中提取。測序平臺(tái)使用Illumina Hi Seq 2500 平臺(tái)上的轉(zhuǎn)錄組測序（Denovo Biotechnology Co， USA）。使用TopHat 2.0.8將干凈的讀數(shù)映射到水稻參考基因（RGAP 7.0），并使用每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的碎片（FPKM）方法對(duì)基因表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。差異表達(dá)基因?yàn)殄e(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（1 discovery rate， FDR） 小于0.05且差異表達(dá)倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C） 大于2 的基因。

1.9 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，重復(fù)3 次。試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用 Microsoft Excel 2010 進(jìn)行整理，利用SPSS 26.0（Chicago， America） 軟件進(jìn)行單因素方差分析 （onewayANOVA），用Duncan 檢驗(yàn)（Plt;0.05 為差異顯著） 進(jìn)行處理間的差異顯著性分析，柱狀圖采用Graph Pad Prism 8.0.2 制作，熱圖采用聯(lián)川生物云平臺(tái)制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd 脅迫下外源H2O2 對(duì)水稻幼苗生長和生物量的影響

如圖1 所示，Cd 脅迫強(qiáng)烈抑制了水稻生長。Cd 處理下水稻株高、SPAD 值、地上部干重、根干重相對(duì)于CK 顯著降低（Plt;0.05）。而外源添加H2O2后緩解了Cd 對(duì)水稻生長發(fā)育的抑制作用。與Cd 脅迫的水稻相比，H2O2 處理顯著提高了水稻幼苗的株高，增幅為13.7%～35.1%，倒二葉的SPAD 較Cd脅迫下提高了50.5%～165.9%。不同濃度H2O2 下植株地上部和根部干重較Cd 脅迫下均提高，但影響程度不一致，20 μmol/L H2O2 處理下地上部和根部干重顯著提高，增幅分別為227.1%～339.0%；而80 μmol/L H2O2 處理影響不顯著。

2.2 添加H2O2 清除劑（KI） 對(duì)水稻生長的影響

單獨(dú)添加K I 處理的水稻幼苗株高顯著低于CK 處理但高于Cd 脅迫處理，SPAD 差異不顯著，說明抑制水稻體內(nèi)H2O2 的產(chǎn)生會(huì)抑制水稻幼苗的生長。Cd 脅迫下，添加H2O2 清除劑進(jìn)一步顯著降低了水稻幼苗株高和SPAD 值（圖2，Plt;0.05）。

2.3 Cd 脅迫下外源H2O2 對(duì)水稻幼苗根系形態(tài)的影響

由圖3 可以看出，Cd 脅迫下，水稻根系發(fā)育受到抑制，總根長、根表面積、根體積、根尖數(shù)相較于CK 顯著下降（Plt;0.05）。20 μmol/L H2O2 處理下總根長、根表面積、根體積、根尖數(shù)較Cd 處理顯著提高（Plt;0.05），而80 μmol/L H2O2 處理下僅總根長顯著提高，其他指標(biāo)沒有顯著變化（圖3）。說明外源添加低濃度H2O2 可以改變水稻幼苗的根系形態(tài)，減輕Cd 毒害。

2.4 Cd 脅迫下外源H2O2 對(duì)水稻內(nèi)源H2O2 和含量的影響

由圖4 可知，與CK 相比，Cd 脅迫下水稻幼苗根部中O-2含量顯著提高（Plt;0.05），H2O2 含量沒有顯著差異。外源添加20 μmol/L H2O2 后，內(nèi)源H2O2 和O-2含量較Cd 脅迫下顯著下降，特別是O-2含量下降了34.2%。在80 μmol/L H2O2 水平下，O-2含量較Cd脅迫下顯著降低，降幅為29.6%，而H2O2 含量沒有顯著變化。

2.5 Cd 脅迫下外源H2O2 對(duì)水稻Cd 吸收、運(yùn)輸?shù)挠绊?/p>

如圖5-A 所示，外源添加H2O2 后水稻幼苗根中的Cd 離子含量較Cd 脅迫下顯著降低（Plt;0.05），降幅為31.2%～34.5%。同時(shí)，地上部中的Cd 離子含量在添加H2O2 之后也較Cd 脅迫下顯著降低，降幅為24.2%～39.2% （圖5-B）。但H2O2 對(duì)Cd 轉(zhuǎn)移系數(shù)沒有顯著影響（圖5-C）。說明外源添加H2O2 可能通過影響水稻幼苗根部對(duì)Cd 離子的吸收來降低根部和地上部中的Cd 離子含量，不影響根部Cd 向地上部的轉(zhuǎn)移。

2.6 Cd 脅迫下外源H2O2 對(duì)水稻Cd 吸收基因的影響

如圖6 所示，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明，Cd 脅迫下OsIRT1、OsNRAMP1 和OsNRAMP5 的表達(dá)水平較CK 處理顯著下降，而OsCd1 的表達(dá)水平顯著提高（Plt;0.05）。外源添加H2O2 后，OsIRT1 的表達(dá)水平較Cd 脅迫下顯著提高，而OsCd1 和OsNRAMP5 的表達(dá)水平較Cd 脅迫下顯著下降，OsNRAMP1 的表達(dá)水平?jīng)]有受到影響。以上結(jié)果表明H2O2 調(diào)控了Cd 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)水平，特別是抑制了Cd 吸收關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因OsNRAMP5 的表達(dá)水平。

2.7 Cd 脅迫下外源H2O2 對(duì)水稻根表鐵膜形成的影響

外源添加H2O2 后，水稻根表出現(xiàn)明顯的黃色鐵膜（圖7-A）。外源添加20、80 μmol/L H2O2 的根表Cd 濃度均顯著高于Cd 處理（圖7-B）；20 μmol/LH2O2 處理根表Fe 濃度顯著高于Cd 處理，而80 μmol/LH2O2 處理與Cd 處理無顯著差異（圖7-C）。Cd 從根表向根內(nèi)的轉(zhuǎn)移系數(shù)在外源添加H2O2 之后顯著降低（圖7-D）。說明H2O2 能促進(jìn)根表鐵膜的形成，增強(qiáng)對(duì)Cd 的吸附能力，因而抑制了其向根內(nèi)的轉(zhuǎn)移。

2.8 外源H2O2 對(duì)水稻幼苗根部亞細(xì)胞組分Cd 濃度的影響

為探究Cd 的亞細(xì)胞分布，將水稻根部進(jìn)行分級(jí)提取細(xì)胞壁、細(xì)胞器、可溶性部分，并測定各部分的Cd2+濃度。Cd 脅迫下，外源添加H2O2 后，細(xì)胞壁、細(xì)胞器和可溶性部分中的Cd2+濃度均顯著降低（圖8-A～C，Plt;0.05）。Cd 脅迫下，Cd 離子大量積累在可溶性部分中，其次是細(xì)胞壁、細(xì)胞器，添加20 μmol/L H2O2 之后，可溶性部分中Cd 占比降低，而細(xì)胞壁中的Cd 占比顯著增加（圖8-D）。

2.9 外源H2O2 對(duì)細(xì)胞壁果膠糖醛酸和果膠甲酯酶基因的影響

果膠是細(xì)胞壁結(jié)合Cd 的主要成分，為了探究外源H2O2 對(duì)細(xì)胞壁果膠濃度的影響，對(duì)細(xì)胞壁進(jìn)行分級(jí)提取，測定果膠糖醛酸濃度。Cd 處理下，細(xì)胞壁中的果膠糖醛酸濃度與對(duì)照組相比沒有顯著差異，而外源添加H2O2 之后，細(xì)胞壁果膠糖醛酸的濃度較Cd 脅迫下顯著升高（圖9-A），說明外源H2O2 促進(jìn)了果膠的合成。為了探究H2O2 對(duì)水稻根系細(xì)胞壁果膠甲酯酶和擴(kuò)展蛋白的合成是否有影響，對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行分析。如圖9-B 所示，Cd 脅迫下，外源添加H2O2后，顯著上調(diào)了 OsPME14、OsPME40、 OsEXPA3、OsEXPA8、OsEXPA10 的表達(dá)水平。說明H2O2 通過上調(diào)果膠甲酯酶表達(dá)水平，促進(jìn)果膠的去甲酯化作用；而擴(kuò)展蛋白的表達(dá)水平在H2O2 處理下也顯著提高，說明擴(kuò)展蛋白可能參與了水稻細(xì)胞壁的修飾過程。

3 討論

ROS 是植物有氧代謝的副產(chǎn)物，但同時(shí)也作為信號(hào)物質(zhì)控制植物的生長過程[22]。重金屬脅迫導(dǎo)致ROS 大量積累，從而破壞細(xì)胞膜、葉綠體的結(jié)構(gòu)，引起脂質(zhì)過氧化，破壞植物正常的生理生化環(huán)境[40?41]。ROS 有多種類型，包含了O-2H2O2、單線態(tài)氧和羥基自由基[42]。O-2的化學(xué)性質(zhì)活潑，具有很強(qiáng)的氧化能力，通常對(duì)植物細(xì)胞膜造成氧化損傷，引起核酸及蛋白質(zhì)變性[ 4 3 ]。H2O2 是一種氧化性較弱的活性氧，高濃度時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷，而低濃度的H2O2 處理則可以改善植物幼苗的生長狀況、根系形態(tài)、光合能力和代謝狀態(tài)，緩解逆境脅迫產(chǎn)生的生長抑制[27， 44?45]。本研究結(jié)果表明，外源添加H2O2 有效緩解Cd 脅迫對(duì)水稻幼苗的生長抑制和葉片失綠，提高水稻幼苗的株高、根和地上部干重（圖1），在20 μmol/L H2O2 處理下，水稻幼苗的根長、根表面積、根體積和根尖數(shù)均顯著提高；80 μmol/L H2O2 水平下，除根長外其他指標(biāo)沒有顯著變化（圖3）。以上結(jié)果表明外源添加低濃度的H2O2 可以緩解Cd 的毒害作用，而高濃度H2O2 的緩解效果不顯著，這可能是由于H2O2 具有信號(hào)和氧化性的雙重作用。

低濃度的H2O2 作為信號(hào)分子，通過提高抗氧化酶的活性，減少細(xì)胞氧化損傷，提高植物對(duì)非生物脅迫的耐受力[28?29]。本研究中，與對(duì)照相比，Cd 脅迫誘導(dǎo)了O-2的產(chǎn)生，表明細(xì)胞出現(xiàn)了氧化脅迫。外源添加20 μmol/L H2O2 后，O-2含量顯著降低（圖4-B），說明外源H2O2 可以緩解水稻根系細(xì)胞膜過氧化程度，且低濃度H2O2 效果更好。Cd 脅迫下添加H2O2清除劑后，水稻幼苗的生長受到嚴(yán)重抑制（圖2），可能是由于H2O2 清除劑降低了抗氧化酶活性，導(dǎo)致O-2的積累。在植物受到非生物脅迫時(shí)，外源低濃度H2O2 可能通過增強(qiáng)SOD、APX、CAT 等抗氧化脅迫相關(guān)酶活性，降低內(nèi)源活性氧的積累；而添加H2O2抑制劑會(huì)抑制植物中APX、CAT 等酶的活性，降低植物對(duì)脅迫環(huán)境的抗性[46?48]。

OsNRAMP5 是介導(dǎo)水稻根系吸收Cd 的主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[49]。本研究中，Cd 脅迫下外源添加H2O2 后顯著抑制了OsNRAMP5 的表達(dá)水平，導(dǎo)致水稻對(duì)Cd 的吸收減弱，根和地上部中Cd 離子含量均顯著下降（圖5-A、B，圖6-D）。此外，外源添加H2O2 促進(jìn)水稻根系表面形成鐵膜， 根表F e 濃度顯著提高，OsIRT1 的表達(dá)上調(diào)（圖6-A，圖7-C）。有研究表明鐵膜的形成會(huì)誘導(dǎo)水稻的缺鐵響應(yīng)，上調(diào)OsIRT1 的表達(dá)水平[50]，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。鐵膜是由于水稻泌氧在根表形成的鐵氧化物，由于其疏松多孔的特性和富含羥基等多種官能團(tuán)，具有阻滯有害金屬離子進(jìn)入根系的屏障作用[51]。Cd 脅迫下，水稻根表形成的鐵膜可以有效地把Cd 阻擋在根外，減少根系對(duì)Cd的吸收，降低Cd 毒害[52?53]。本研究結(jié)果表明，H2O2處理提高了根表Cd 的濃度，根表向根內(nèi)的Cd2+轉(zhuǎn)移系數(shù)較Cd 脅迫下顯著降低（圖7-B、D）。因此，H2O2 促進(jìn)了根表鐵膜的形成，將較多的Cd 離子吸附在根表面[36]，從而降低了根系對(duì)Cd 離子、鐵離子的吸收。

細(xì)胞壁對(duì)Cd 的區(qū)隔化是植物降低細(xì)胞Cd 毒性的重要途徑，本研究中，外源H2O2 處理降低了水稻根系可溶性部分中的Cd 含量占比，將更多的Cd 固定在細(xì)胞壁中（圖8），從而減輕了細(xì)胞質(zhì)中Cd 的毒害作用。研究表明，H2O2 促進(jìn)水稻根系細(xì)胞壁果膠的生物合成和去甲基化，釋放細(xì)胞壁果膠與Cd 結(jié)合的相關(guān)基團(tuán)，從而增強(qiáng)水稻根系細(xì)胞壁與Cd 的結(jié)合能力，降低根系Cd 的毒害[54?55]。本研究中，外源H2O2 顯著提高了細(xì)胞壁果膠糖醛酸的含量（圖9-A）。果膠甲酯酶 （PME） 通過水解果膠中的甲酯基，降低果膠的甲酯化程度[20]。有報(bào)道指出，OsPME12參與了鋁誘導(dǎo)的細(xì)胞壁修飾[56]。擴(kuò)展蛋白 （EXPA） 是一種引起植物細(xì)胞壁松弛的蛋白質(zhì)，在植物細(xì)胞伸展及細(xì)胞壁修飾的生命活動(dòng)中起著關(guān)鍵作用[57]。本研究中外源添加H2O2 后，與果膠去甲酯化相關(guān)基因OsPME14、OsPME40 及與細(xì)胞壁修飾相關(guān)的細(xì)胞壁松弛蛋白基因OsEXPA3、OsEXPA8、OsEXPA10 的表達(dá)水平上調(diào) （圖9-B）。因此，H2O2 通過促進(jìn)細(xì)胞壁果膠的合成和去甲酯化作用，提高了細(xì)胞壁對(duì)Cd 的結(jié)合能力。

4 結(jié)論

Cd 脅迫導(dǎo)致水稻體內(nèi)產(chǎn)生大量O-2，造成水稻幼苗生長抑制。外源添加適宜水平H2O2 可降低O-2造成的氧化損傷，同時(shí)下調(diào)OsNRAMP5 的表達(dá)水平，減少水稻對(duì)Cd 的吸收。外源H2O2 還可促進(jìn)水稻根表形成鐵膜，抑制Cd2+從根表向根內(nèi)的轉(zhuǎn)移，促進(jìn)細(xì)胞壁中Cd 的區(qū)隔化，干擾細(xì)胞質(zhì)中Cd 的移動(dòng)，從而減輕Cd 的細(xì)胞毒性，提高水稻抗Cd 脅迫能力。但外源高水平H2O2 緩解水稻Cd 脅迫的效果大大減弱，可能與其抑制根表鐵膜的形成有關(guān)。

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