紫檀芪抗H2O2誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞肥大

[摘要]"目的"探討紫檀芪（pterostilbene，PTE）對H2O2誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞肥大的影響。方法"培養(yǎng)H9C2心肌細(xì)胞，使用50μmol/L的H2O2誘導(dǎo)心肌肥大，隨機(jī)將其分為對照組（control組，C組）、心肌肥大組（hypertrophy組，H組）和心肌肥大+PTE組（H+PTE組）。干預(yù)48h后，采用細(xì)胞免疫熒光法檢測H9C2心肌細(xì)胞表面積，采用蛋白免疫印跡法檢測p62和p-mTOR蛋白表達(dá)。結(jié)果"與C組比較，H組心肌細(xì)胞的表面積顯著增大，p62表達(dá)顯著升高，p-mTOR/mTOR表達(dá)顯著降低（Plt;0.05）。與H組比較，H+PTE組心肌細(xì)胞的表面積顯著減小，p62表達(dá)顯著降低，p-mTOR/mTOR表達(dá)顯著升高（Plt;0.05）。結(jié)論"PTE通過抑制mTOR信號通路調(diào)節(jié)自噬進(jìn)而減輕H2O2誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞肥大。

[關(guān)鍵詞]"紫檀芪；自噬；H2O2；心肌細(xì)胞肥大

[中圖分類號]"R542.2""""""[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]"A""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.15.006

Pterostilbene"against"H2O2-induced"hypertrophy"of"H9C2"cardiomyocytes

YANG"Zijian1，"WANG"Jiapu1，"2

1.Department"of"Cardiology，"Shanxi"Cardiovascular"Hospital，"Taiyuan"030024，"Shanxi，"China;"2.Central"Laboratory，"Shanxi"Cardiovascular"Hospital，"Taiyuan"030024，"Shanxi，"China

[Abstract]"Objective"To"investigate"effects"of"pterostilbene"（PTE）"on"H2O2-induced"hypertrophy"of"H9C2"cardiomyocytes."Methods"H9C2"cardiomyocytes"were"cultured"in"DMEM，"cardiomyocyte"hypertrophy"model"was"created"by"using"50"μmol/L"H2O2，"and"they"were"randomly"divided"into"control"group"（group"C），"cardiac"hypertrophy"group"（group"H）"and"cardiac"hypertrophy"+"PTE"group"（group"H+PTE）."After"48"hours"of"intervention，"surface"area"of"H9C2"cardiomyocytes"was"detected"by"using"cellular"immunofluorescence，"protein"p62"and"p-mTOR"expression"were"detected"by"using"Western"blot."Results"Compared"with"group"C，"surface"area"of"cardiomyocytes"and"expression"of"p62"significantly"increased"in"group"H，"and"expression"of"p-mTOR/mTOR"significantly"decreased"in"group"H"（Plt;0.05）."Compared"with"group"H，"surface"area"of"cardiomyocytes"and"expression"of"p62"significantly"decreased"in"group"H+PTE，"and"expression"of"p-mTOR/mTOR"significantly"increased"in"group"H+PTE"（Plt;0.05）."Conclusion"PTE"alleviates"H2O2-induced"hypertrophy"in"H9C2"cardiomyocytes"by"regulating"autophagy"through"inhibition"of"mTOR"signaling"pathway.

[Key"words]"Pterostilbene;"Autophagy;"Hydrogen"peroxide;"Cardiomyocyte"hypertrophy

心肌細(xì)胞肥大是一個(gè)或可逆轉(zhuǎn)的病理生理過程。越來越多的研究集中在尋找具有生物活性的小分子上，以期能逆轉(zhuǎn)這一過程。作為一種具有多種生物學(xué)活性的非黃酮類多酚化合物，紫檀芪（pterostilbene，PTE）在心肌梗死、心肌缺血再灌注等方面具有顯著的心臟保護(hù)作用[1-4]。本研究擬在H2O2誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞肥大模型上觀察PTE的影響及可能機(jī)制。

1""材料與方法

1.1""主要材料

H9C2心肌細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。α肌動蛋白、PTE和H2O2購自Sigma"Aldrich公司，mTOR、p-mTOR和GAPDH購自Abcam公司。

1.2""實(shí)驗(yàn)分組及處理

H9C2心肌細(xì)胞用10%胎牛血清DMEM液在37℃"5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。隨機(jī)將其分為對照組（control組，C組）、心肌肥大組（hypertrophy組，H組）和心肌肥大+PTE組（H+PTE組）。提前48h加入50μmol/L的H2O2干預(yù)獲得細(xì)胞肥大模型，50μmol/L的PTE預(yù)先加入干預(yù)[5-6]。

1.3""細(xì)胞免疫熒光法檢測細(xì)胞表面積

H9C2心肌細(xì)胞接種于24孔板，密度3×104個(gè)，37℃"5%CO2培養(yǎng)箱孵育貼壁，30%"H2O2處理48h，或與50μmol/L的PTE共孵育48h后磷酸鹽緩沖液洗板，加入4%多聚甲醛固定，10%山羊血清室溫避光封閉30min棄掉，加入抗α肌動蛋白抗體靜置孵育4℃過夜，第2天磷酸鹽緩沖液洗板，加FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠免疫球蛋白G室溫孵育2h后棄去，磷酸鹽緩沖液洗板，DAPI避光染核，磷酸鹽緩沖液洗滌3次吸干，封片劑封片，熒光倒置顯微鏡觀察拍照。

1.4""蛋白免疫印跡法檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)

使用RIPA提取液，加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，4℃勻漿，取上清，BSA法定量，10%"SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，5%"BSA封閉1h，加一抗anti-p62抗體、anti-mTOR抗體、anti-p-mTOR抗體和內(nèi)參anti-GAPDH抗體4℃搖床過夜，1×TBST洗膜3次后加入二抗，1×TBST洗膜3次后增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法發(fā)光，BIO-RAD凝膠成像儀曝光，Image"Lab分析條帶灰度值。

1.5""統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS"21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2""結(jié)果

2.1""PTE減輕H2O2誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞肥大

三組心肌細(xì)胞的表面積情況見圖1。與C組比較，H組心肌細(xì)胞的表面積顯著增大（Plt;0.05），提示H2O2誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞肥大，與H組比較，H+PTE組心肌細(xì)胞的表面積顯著減?。≒lt;0.05），提示PTE可阻止H2O2誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞進(jìn)一步肥大。

2.2""PTE通過調(diào)節(jié)自噬減輕H2O2誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞肥大

三組心肌細(xì)胞的p62、p-mTOR表達(dá)見圖2。與C組比較，H組心肌細(xì)胞的p62表達(dá)顯著升高，p-mTOR/mTOR表達(dá)顯著降低（Plt;0.05），提示H2O2誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞肥大是通過自噬增強(qiáng)達(dá)成。與H組比較，H+PTE組心肌細(xì)胞的p62表達(dá)顯著降低，p-mTOR/mTOR表達(dá)顯著升高（Plt;0.05），提示PTE延緩自噬的累積，具有自噬調(diào)節(jié)作用。

3""討論

心肌細(xì)胞肥大是心力衰竭發(fā)生和發(fā)展的重要一環(huán)。抑制心肌細(xì)胞肥大、延緩心力衰竭發(fā)生是目前治療心力衰竭的方法之一。PTE作為一種生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定高效的生物利用度[7]；相關(guān)文獻(xiàn)多涉及動物實(shí)驗(yàn)，主要集中在心肌梗死、缺血/再灌注損傷和心力衰竭的心肌保護(hù)[2-4，8-9]。前期研究發(fā)現(xiàn)PTE具有抵抗壓力超負(fù)荷大鼠早期心肌肥厚的作用，與文獻(xiàn)中PTE改善大鼠心肌肥厚的作用結(jié)果類似[10]。

PTE在細(xì)胞水平上的表現(xiàn)證實(shí)，PTE可抵抗缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡[6]。本研究通過采用H2O2干預(yù)獲得心肌細(xì)胞肥大模型，并通過細(xì)胞免疫熒光法測量H9C2心肌細(xì)胞表面積后發(fā)現(xiàn)，使用低濃度外源性的H2O2干預(yù)可獲得心肌細(xì)胞肥大模型[5]。在PTE干預(yù)之后心肌細(xì)胞表面積顯著縮小，提示PTE可減輕H2O2誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞肥大。

自噬介導(dǎo)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心力衰竭和心肌肥厚[5，11-12]。自噬蛋白p62增加即自噬通量的增加[13]。本研究通過免疫抑制實(shí)驗(yàn)檢測自噬相關(guān)蛋白p62的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，H9C2心肌細(xì)胞肥大早期p62表達(dá)上調(diào)，提示自噬參與H2O2誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞肥大，呈現(xiàn)p62依賴性，與文獻(xiàn)結(jié)果一致[14]。H+PTE組心肌細(xì)胞的p62表達(dá)較H組顯著下降，提示PTE通過調(diào)節(jié)p62依賴性自噬減輕H2O2誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞肥大。此外，PTE通過mTOR信號激活自噬[15]。本研究還發(fā)現(xiàn)，H組心肌細(xì)胞的p-mTOR/mTOR較C組顯著下降，當(dāng)給予PTE干預(yù)后出現(xiàn)上調(diào)，提示PTE調(diào)節(jié)自噬是通過抑制mTOR信號通路達(dá)成，進(jìn)而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

綜上所述，PTE通過調(diào)節(jié)自噬減輕H2O2誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞肥大，其機(jī)制與抑制mTOR信號有關(guān)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

[參考文獻(xiàn)]

[1] SHAO"Y"Y，"WANG"X"Q，"ZHOU"Y，"et"al."Pterostilbene"attenuates"RIPK3-dependent"hepatocyte"necroptosis"in"alcoholic"liver"disease"via"SIRT2-mediated"NFATc4"deacetylation[J]."Toxicology，"2021，"461："152923.

[2] 趙瑋，"吳悠揚(yáng)，"林叢，"等."紫檀芪對急性心肌梗死大鼠心肌功能、心肌纖維化和炎癥反應(yīng)的作用及對Notch1/eIF3a信號通路的影響[J]."中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，"2020，"25（5）："498–504.

[3] XIONG"X"W，"LU"W"H，"ZHANG"K"H，"et"al."Pterostilbene"reduces"endothelial"cell"apoptosis"by"regulation"of"the"Nrf2-mediated"TLR-4/MyD88/NF-"kappaB"pathway"in"a"rat"model"of"atherosclerosis[J]."Exp"Ther"Med，"2020，"20（3）："2090–2098.

[4] 付華君，"宋文英，"田俊斌，"等."紫檀芪通過調(diào)控細(xì)胞自噬對抗大鼠心肌缺血/再灌注損傷[J]."陜西中醫(yī)，"2022，"43（10）："1342–1346.

[5] WANG"J"P，"CHI"R"F，"WANG"K，"et"al."Oxidative"stress"impairs"myocyte"autophagy，"resulting"in"myocyte"hypertrophy[J]."Exp"Physiol，"2018，"103："461–472.

[6] 劉峰，"董少紅，"吳美善，"等."紫檀芪通過PI3K-AKT信號途徑抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡[J]."中國醫(yī)藥科學(xué)，"2016，"6（21）："38–41.

[7] SONG"L，"CHEN"T"Y，"ZHAO"X"J，"et"al."Pterostilbene"prevents"hepatocyte"epithelial-mesenchymal"transition"in"fructose-induced"liver"fibrosis"through"suppressing"miR-34a/Sirt1/p53"and"TGF-β1/Smads"signalling[J]."Br"J"Pharmacol，"2019，"176（11）："1619–1634.

[8] YU"Z"X，"WANG"S"H，"ZHANG"X"Y，"et"al."Pterostilbene"protects"against"myocardial"ischemia/reperfusion"injury"via"suppressing"oxidative/nitrative"stress"and"inflammatory"response[J]."Int"Immunopharmacol，"2017，"43："7–15.

[9] RAFACHO"B"P"M."Pterostilbene"after"acute"myocardial"infarction："Effect"on"heart"and"lung"tissues[J]."Arq"Bras"Cardiol，"2022，"118（2）："446–447.

[10] 董文婷，"尚福軍，"郭錦，"等."紫檀芪灌胃對大鼠心肌肥厚的改善作用及其分子機(jī)制[J]."山東醫(yī)藥，"2022，"62（5）："25–29.

[11] WANG"J"P，"CHI"R"F，"LIU"J，"et"al."The"role"of"endogenous"reactive"oxygen"species"in"cardiac"myocyte"autophagy[J]."Physiol"Res，"2018，"67："31–40.

[12] WANGnbsp;J"P."Progress"in"the"study"of"cardiomyocyte"autophagy"in"the"course"of"heart"failure[J]."Horiz"Acad，"2023，"4："31–35.

[13] 謝志平."自噬——生物學(xué)與疾病方法卷[M]."3版."北京："科學(xué)出版社，"2021.

[14] JIANG"Y"M，"ZHOU"Y，"XU"W"X，"et"al."Induction"of"Sestrin2"by"pterostilbene"suppresses"ethanol-triggered"hepatocyte"senescence"by"degrading"CCN1"via"p62-"dependent"selective"autophagy[J]."Cell"Biol"Toxicol，"2023，"39（3）："729–749.

[15] HE"J"L，"DONG"X"H，"LI"Z"H，"et"al."Pterostilbene"inhibits"reactive"oxygen"species"production"and"apoptosis"in"primary"spinal"cord"neurons"by"activating"autophagy"via"the"mechanistic"target"of"rapamycin"signaling"pathway[J]."Mol"Med"Rep，"2018，"17（3）："4406–4414.

（收稿日期：2023–08–13）

（修回日期：2023–09–16）