茉莉花PAL基因家族的多基因組鑒定與表達(dá)分析

張宇航 谷夢(mèng)雅 洪雅萍 林宏政 金珊 葉乃興

摘要： ?為深入探究茉莉花PAL基因家族的功能及在香氣成分形成中的作用，本研究以福州單瓣茉莉花、雙瓣茉莉花和重瓣茉莉花基因組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，利用生物信息學(xué)方法及實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)JsPAL基因家族進(jìn)行多基因組分析。結(jié)果表明，在單瓣茉莉花、雙瓣茉莉花和重瓣茉莉花全基因組中分別鑒定出4個(gè)、1個(gè)和4個(gè)PAL家族基因，JsPAL家族成員均具有丙氨酸-絲氨酸-甘氨酸（Ala-Ser-Gly）組成的三肽活性中心。共線性分析發(fā)現(xiàn)單瓣茉莉花、重瓣茉莉花和擬南芥的PAL基因間的共線性關(guān)系與雙瓣茉莉花相比更強(qiáng)；系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析結(jié)果顯示，JsPAL基因家族分布在2個(gè)亞家族中。JsPAL基因啟動(dòng)子區(qū)域存在大量與脅迫響應(yīng)、激素響應(yīng)、光響應(yīng)和植物生長(zhǎng)相關(guān)的順式調(diào)控元件。熒光定量分析結(jié)果表明，JsPAL在茉莉花組織中存在特異性表達(dá)，多數(shù)JsPAL在花中的相對(duì)表達(dá)量高于其他組織；大多數(shù)JsPAL基因在福州單瓣茉莉花中的相對(duì)表達(dá)量高于雙瓣茉莉花；福州單瓣茉莉花中 ?SP_JsPAL2 ?、 ?SP_JsPAL4 ?、 ?MP_JsPAL1 ?和 ?MP_JsPAL3 ?在其花朵預(yù)開(kāi)放期（F3）的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他時(shí)期，雙瓣茉莉花中 ?DP_JsPAL1 ?在F3階段的相對(duì)表達(dá)量也較高； ?SP_JsPAL1 ?和 ?SP_JsPAL2 ?與2-苯乙醇和苯乙醛含量呈顯著正相關(guān)，其中 ?SP_JsPAL1 ?還與苯甲醛含量呈顯著正相關(guān)。說(shuō)明，JsPAL可能在茉莉花的發(fā)育中起重要作用， ?SP_JsPAL2 ?、 ?SP_JsPAL4 ?、 ?MP_JsPAL1 ?、 ?MP_JsPAL3 ?和 ?DP_JsPAL1 ?可能對(duì)福州單瓣茉莉花、雙瓣茉莉花的香氣成分形成具有重要的調(diào)控作用， ?SP_JsPAL1 ?可能對(duì)福州單瓣茉莉鮮靈香氣的形成具有重要作用。

關(guān)鍵詞： ?茉莉花； 苯丙氨酸解氨酶（PAL）； 表達(dá)分析； 多基因組

中圖分類號(hào)： ?S685.16 ???文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ???文章編號(hào)： ?1000-4440（2024）03-0403-12

Multi-genomic identification and expressional analysis of PAL gene family in Jasminum sambac

ZHANG Yu-hang， GU Meng-ya， HONG Ya-ping， LIN Hong-zheng， JIN Shan， YE Nai-xing

（College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University/Key Laboratory of Tea Science at Universities in Fujian Province， Fuzhou 350002， China）

Abstract： ?To deeply investigate the function of the PAL gene family in Jasminum sambac and its role in the formation of aroma components， multi-genomic analysis of JsPAL gene family was conducted by bioinformatics methods and quantitative real-time PCR technology based on the genomic data of single-petal J. sambac， double petal J. sambac and multi-petal J. sambac from Fuzhou. The results showed that four， one and four PAL family genes were identified from the whole genome of single-petal J. sambac， double petal J. sambac and multi-petal J. sambac， respectively. All members of the JsPAL family had a tripeptide active center composed of alanine-serine-glycine （Ala-Ser-Gly）. Collinearity analysis revealed that the collinear relation of PAL gene between single-petal J. sambac， multi-petal J. sambac and Arabidopsis thaliana was stronger compared with that of double-petal J. sambac. Analysis of phylogenetic tree showed that the JsPAL gene family was distributed in two subfamilies. There were many cis-regulatory elements that were related to stress response， hormone response， light response and plant growth in the promoter region of JsPAL genes. The results of fluorescence quantification analysis showed that JsPAL was specifically expressed in J. sambac tissues， and the relative expression of the majority JsPALs in flowers were higher than in other tissues. The relative expression of the majority JsPAL genes in Fuzhou single-petal J. sambac was higher than in double-petal J. sambac. The relative expressions of ??SP_JsPAL2， SP_JsPAL4， MP_JsPAL1 ??and ??MP_JsPAL3 ??in the pre-opening stage （F3） of Fuzhou single-petal J. sambac were higher than in other stages， the relative expression of ??DP_JsPAL1 ??in the F3 stage of Fuzhou double-petal Jasminum sambac was also high. ??SP_JsPAL1 ??and ??SP_JsPAL2 ??were positively correlated with 2-phenylethanol and phenylacetaldehyde contents， and ??SP_JsPAL1 ??was also positively correlated with benzaldehyde content. The results indicated that JsPALs may play an important role in flower development of J. sambac， and ??SP_JsPAL2， SP_JsPAL4， MP_JsPAL1， MP_JsPAL3 ??and ??DP_JsPAL1 ??may have important regulatory roles in the formation of aroma components in Fuzhou single-petal J. sambac and double-petal J. sambac. Moreover， ??SP_JsPAL1 ??may play an important role in the formation of fresh spirit aroma of Fuzhou single-petal J. sambac.

Key words： ?Jasminum sambac； phenylalanine ammonia-lyase （PAL）； expressional analysis； multi-genomic

茉莉花[Jasminum sambac（L.）Ait]為木樨科（Oleaceae）素馨屬（Jasminum Linn）常綠灌木，是一種典型的氣質(zhì)花，其香氣隨著花朵的盛開(kāi)而逐漸釋放[1]。茉莉花品種可以根據(jù)其花型結(jié)構(gòu)劃分為單瓣（Single-petal type of J. sanmbac）、雙瓣（Double-petal type of J. sanmbac）和重瓣（Multi-petal type of J.sanmbac）3種類型[2]。香氣是評(píng)定茉莉花品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)之一，苯丙烷類化合物是茉莉花香氣的重要組成成分，其主要包括：乙酸芐酯、苯甲酸芐酯、苯甲酸甲酯、苯甲醇及水楊酸甲酯等[3]。

苯丙氨酸解氨酶（PAL）在植物、真菌、酵母和藻類中廣泛存在。它是連接生物初級(jí)代謝和苯丙烷類代謝、催化苯丙烷類代謝第一步反應(yīng)的酶，是苯丙烷代謝的關(guān)鍵酶和限速酶[4]。PAL在植物中對(duì)香氣形成具有重要的調(diào)控作用，郭瑩等[5]鑒定矮牽?；ǘ渲械膿]發(fā)性物質(zhì)及PAL基因的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)PAL參與調(diào)控矮牽牛花香物質(zhì)的合成。王莎[6]在對(duì)美花石斛香氣成分進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)PAL基因與美花石斛香氣的產(chǎn)生密切相關(guān)。截至目前，PAL基因已經(jīng)在多個(gè)物種中被發(fā)現(xiàn)和鑒定，例如擬南芥[7]、水稻[8]、小麥[9]、玉米[10]、葡萄[11]等，這些研究結(jié)果表明PAL基因?qū)χ参锏目鼓?、抗病蟲(chóng)害、木質(zhì)化等過(guò)程均具有重要意義。此外，PAL基因在云錦杜鵑[12]、一品紅[13]等植物組織中存在特異性表達(dá)，在茉莉花中也不例外，課題組前期通過(guò)基因克隆得到JsPAL[14]和 ?JsPAL2 ?[15]基因，分析發(fā)現(xiàn)JsPAL在茉莉花花瓣和花蕾中的表達(dá)量顯著高于根、莖、葉中的表達(dá)量，并推測(cè)在茉莉花開(kāi)放過(guò)程中茉莉花香強(qiáng)度與JsPAL的表達(dá)量可能具有關(guān)聯(lián)性。

JsPAL在茉莉花苯丙烷類代謝中的作用尚不清楚，且茉莉花中的JsPAL基因數(shù)量仍不明確。福州單瓣茉莉的香氣鮮靈悠長(zhǎng)，雙瓣茉莉的香氣濃烈，重瓣茉莉的香氣較弱[16]。課題組前期利用廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)福州單瓣茉莉和雙瓣茉莉的非揮發(fā)性代謝物進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)福州單瓣茉莉和雙瓣茉莉花器官之間具有348種差異代謝物，且這些差異代謝物多富集于類黃酮生物合成通路上[17]。陳梅春等[18]研究發(fā)現(xiàn)福州單瓣茉莉香氣成分中苯甲醇含量高于雙瓣茉莉，而乙酸芐酯含量低于雙瓣茉莉。苯甲醇對(duì)茉莉花的清香香氣具有一定作用，乙酸芐酯能夠影響茉莉花香氣的馥郁程度[18]，而PAL作為苯甲醇和乙酸芐酯在苯丙烷代謝途徑中的上游基因，可能參與調(diào)控二者的生物合成。本研究基于課題組前期得到的單瓣茉莉花、雙瓣茉莉花[19]以及重瓣茉莉花基因組數(shù)據(jù)[20]鑒定出JsPAL基因家族，并利用生物信息學(xué)方法對(duì)JsPAL基因家族進(jìn)行多基因組學(xué)分析。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)，檢測(cè)JsPAL基因在福州單瓣茉莉花和雙瓣茉莉花不同開(kāi)花時(shí)期及在雙瓣茉莉花不同組織中的表達(dá)模式，并對(duì)JsPAL在福州單瓣茉莉花和雙瓣茉莉花不同開(kāi)花時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行比較，為完善JsPAL基因家族的研究及其對(duì)不同瓣型茉莉花香氣的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

以自然生長(zhǎng)狀態(tài)下的福州單瓣茉莉花（SP）和雙瓣茉莉花（DP）作為試驗(yàn)材料，于2022年7-8月取自福建農(nóng)林大學(xué)茉莉花種質(zhì)資源圃。將茉莉從花蕾期到花完全開(kāi)放的過(guò)程分為4個(gè)階段：（1）花蕾期（F1）；（2）花苞期（F2）；（3）預(yù)開(kāi)放期（似虎爪狀）（F3）；（4）開(kāi)放期（F4）。此外，取雙瓣茉莉花的根、莖、嫩葉、成熟葉和花等不同組織，作為茉莉花PAL基因家族組織表達(dá)分析的材料。以上材料設(shè)置3次重復(fù)，用錫箔紙包裹并使用液氮速凍后，放置于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于后續(xù)RNA的提取。

1.2 茉莉花PAL基因家族成員的鑒定

本研究基于課題組前期獲得的單瓣茉莉花、雙瓣茉莉花及重瓣茉莉花全基因組數(shù)據(jù)[19-20]，對(duì)茉莉花中PAL基因進(jìn)行鑒定。從Pfam網(wǎng)站（http：//pfam.xfam.org/）下載PAL結(jié)構(gòu)序列PF00221的隱馬爾科夫模型，使用HMMER 3.0（http：//hmmer.janelia.org）軟件建立HMM模型進(jìn)行同源序列的鑒定。使用 CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）和 SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）確認(rèn)候選序列具有完整的PAL特征結(jié)構(gòu)域（編號(hào)：PLN02457）。利用ExPASy 網(wǎng)站的ProtParam工具（https：//web.expasy.org/protparam）對(duì)JsPAL蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行分析。利用Plant-mPloc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）網(wǎng)站進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.3 茉莉花PAL基因家族染色體定位及共線性分析

使用TBtools軟件繪制JsPAL家族成員在染色體上的定位分布圖，并按照其在染色體上的位置，按序命名。使用Ensembal plants（https：//ensembl.gramene.org/ Index.html）數(shù)據(jù)庫(kù)下載擬南芥的基因序列及其注釋文件，利用單瓣茉莉花、雙瓣茉莉花和重瓣茉莉花基因組及其注釋文件在TBtools軟件上獲取基因密度、基因位置和共線性相關(guān)信息，最后使用TBtools的Advanced Circos功能分析單瓣茉莉花、雙瓣茉莉花、重瓣茉莉花和擬南芥PAL基因家族的共線性。

1.4 茉莉花PAL基因家族系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

下載擬南芥[7]、水稻[8]、玉米[10]、山茶花[21]、葡萄[11]的PAL家族成員的蛋白質(zhì)序列，利用MEGA7.0軟件對(duì)JsPAL家族成員進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，采用鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Boostrap設(shè)置為1 000，得到newick文件后再使用Evolview網(wǎng)站進(jìn)行美化。

1.5 茉莉花PAL基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)保守基序與保守結(jié)構(gòu)域的比較分析

在MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）網(wǎng)站上分析JsPAL家族成員的保守基序。在GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）網(wǎng)站分析JsPAL內(nèi)含子和外顯子的組成。利用DNAMAN軟件對(duì)JsPAL基因家族成員進(jìn)行多序列比對(duì)，最后使用WebLogo（http：//weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）網(wǎng)站進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域的可視化。

1.6 茉莉花PAL基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

利用TBtools軟件提取JsPAL起始密碼子上游2 000 bp的基因序列，而后在PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）網(wǎng)站進(jìn)行順式作用元件預(yù)測(cè)分析，并使用TBtools制作熱圖。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

分別提取不同時(shí)期采摘的茉莉花瓣及茉莉花不同組織的RNA。引物（表1）設(shè)計(jì)、熒光定量試驗(yàn)及數(shù)據(jù)分析具體方法參考洪雅萍等[1]的研究。將得到的數(shù)據(jù)用 2-△△Ct 算法進(jìn)行分析，使用SPSS 24.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析（α=0.05），然后用TBtools和Prism8軟件作圖?；诒菊n題組前期研究結(jié)果，得到福州單瓣茉莉和雙瓣茉莉不同階段的香氣成分含量[22]，將福州單瓣茉莉和雙瓣茉莉不同階段的香氣成分含量與其不同開(kāi)放階段的PAL基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 茉莉花PAL基因家族的全基因組鑒定

經(jīng)過(guò)隱馬爾科夫模型的搜索和NCBI網(wǎng)站的比對(duì)，刪除結(jié)構(gòu)域不完整的序列后，在單瓣茉莉花、雙瓣和重瓣茉莉花全基因組中分別鑒定出4個(gè)、1個(gè)和4個(gè)PAL家族基因。對(duì)JsPAL基因進(jìn)行染色體定位分析，結(jié)果（圖1）表明，單瓣茉莉花PAL基因在SP_Chr04和SP_Chr12染色體上；雙瓣茉莉花PAL基因在DP_Chr04染色體上；重瓣茉莉花PAL基因在MP_Chr09和MP_Chr13染色體上，呈現(xiàn)出串聯(lián)重復(fù)的形式。在SP_Chr04、MP_Chr09染色體上各有3個(gè)基因，其余染色體上均只有1個(gè)基因。根據(jù)JsPAL基因在染色體上的位置分布，按順序?qū)⑵浞謩e命名為 ?SP_JsPAL1 ?～ ?SP_JsPAL4 ?（單瓣）; ?DP_JsPAL1 ?（雙瓣）; ?MPJsPAL1～MP_JsPAL4 ?（重瓣）（表1）。JsPAL基因家族的氨基酸長(zhǎng)度為679～712 aa，相對(duì)分子質(zhì)量為73 890～77 750，理論等電點(diǎn)為5.73～6.41（表2）。所有JsPAL蛋白的理論等電點(diǎn)均小于7.00，表明JsPAL為酸性蛋白質(zhì)。所有JsPAL的親水性平均系數(shù)（GRAVY）平均值均小于0，具有親水性。亞細(xì)胞定位研究發(fā)現(xiàn)所有JsPAL均定位于細(xì)胞質(zhì)。

2.2 茉莉花PAL基因家族系統(tǒng)發(fā)育分析

為了研究植物中PAL基因家族的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，使用來(lái)自擬南芥、水稻、玉米、山茶花、葡萄的PAL家族蛋白質(zhì)構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2）。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以將JsPAL分為5個(gè)亞家族（PAL-a～PAL-e），PAL-c和PAL-d包含了所有的JsPAL蛋白家族成員。除了SP_JsPAL4、MP_JsPAL4在PAL-c中，其余JsPAL蛋白均在PAL-d中。茉莉花PAL蛋白主要集中在PAL-c和PAL-d，PAL-a和PAL-b類群由水稻和玉米PAL蛋白成員組成，PAL-c和PAL-d類群由山茶花、茉莉花、葡萄和擬南芥PAL蛋白成員組成，PAL-e類群全部由葡萄PAL蛋白成員組成。以上結(jié)果表明，茉莉花與山茶花、擬南芥這些雙子葉被子植物PAL基因親緣關(guān)系較近，而與水稻、玉米等單子葉植物PAL基因親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3 茉莉花PAL基因家族共線性分析

基于單瓣茉莉花、雙瓣茉莉花、重瓣茉莉花和擬南芥PAL基因的共線性分析結(jié)果（圖3），在茉莉花種內(nèi)共線性關(guān)系中發(fā)現(xiàn)了4對(duì)片段復(fù)制基因，分別為 ?SP_JsPAL1 ?和 ?DP_JsPAL1、SP_JsPAL2和MP_JsPAL2、SP_JsPAL3和MP_JsPAL1、SP_JsPAL4和MP_JsPAL4 ?，表明JsPAL家族某些成員之間具有相似的基因功能。在茉莉花和擬南芥2個(gè)物種的PAL基因家族中發(fā)現(xiàn)了6對(duì)JsPAL/AtPAL處于共線性區(qū)域，分別是 ?MP_JsPAL1/AtPAL1、MP_JsPAL1/AtPAL2、MP_JsPAL4/AtPAL3、SP_JsPAL4/AtPAL3 、SP_JsPAL3/AtPAL1、SP_JsPAL3/AtPAL2 ?，重瓣茉莉花與擬南芥有3對(duì)同源基因，單瓣茉莉花與擬南芥有3對(duì)同源基因，雙瓣茉莉花與擬南芥間不存在同源基因?qū)?。以上結(jié)果說(shuō)明，SP_JsPAL和MP_JsPAL之間具有較緊密的共線性關(guān)系，其與 ?DP_JsPAL1 ?之間無(wú)共線性關(guān)系；單瓣茉莉花、重瓣茉莉花和擬南芥的PAL基因家族具有相對(duì)更近的同源進(jìn)化關(guān)系，且這些同源基因?qū)Τ蓡T之間可能具有相似的功能。

2.4 茉莉花PAL保守基序（Motif）和基因結(jié)構(gòu)的比較分析

蛋白質(zhì)保守基序分析結(jié)果（圖4B）顯示，所有JsPAL家族成員均含有Motif 1～Motif 18，表明JsPAL蛋白結(jié)構(gòu)相似度極高。在Motif16中含有PAL基因的活性序列ASG，且所有JsPAL成員中均含有Motif 16，推測(cè)其在維持PAL蛋白結(jié)構(gòu)功能方面具有重要意義。JsPAL基因的結(jié)構(gòu)（圖4C）顯示，所有JsPAL家族成員均含有外顯子和內(nèi)含子，除 ?MP_JsPAL2 ?具有3個(gè)外顯子外，多數(shù)JsPAL基因具有2個(gè)外顯子。Motif分析和基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，JsPAL基因家族具有高度相似的保守基序，且在同一亞家族中的JsPAL具有相似的基因結(jié)構(gòu)。

2.5 茉莉花PAL家族序列比對(duì)及保守結(jié)構(gòu)域分析

利用DNAMAN進(jìn)行JsPAL基因家族多重蛋白質(zhì)序列比對(duì)（圖5），JsPAL基因編碼的氨基酸序列中均含有圖中橫線上PAL的活性位點(diǎn)GTITASGDLV（L）PLSYIAG，該位點(diǎn)包含圖5中矩形框圈出的PAL家族普遍存在的由丙氨酸-絲氨酸-甘氨酸（Ala-Ser-Gly）組成的三肽活性中心。通過(guò)序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)JsPAL在活性位點(diǎn)上高度保守，所有JsPAL家族成員均具有Ala-Ser-Gly組成的三肽活性中心。

2.6 茉莉花PAL基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

順式作用元件在植物生長(zhǎng)發(fā)育中對(duì)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄有重要作用，啟動(dòng)子順式作用元件分析結(jié)果（圖6）表明，JsPAL基因上游2 000 bp啟動(dòng)子區(qū)域有大量順式調(diào)控元件。在JsPAL啟動(dòng)子區(qū)域鑒定出4種脅迫響應(yīng)元件，8種激素響應(yīng)元件，19種光響應(yīng)元件，4種植物生長(zhǎng)相關(guān)元件。其中參與脅迫響應(yīng)的元件有干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子（MBS）、厭氧誘導(dǎo)型啟動(dòng)子（ARE）、低溫誘導(dǎo)表達(dá)型啟動(dòng)子（LTR）、防衛(wèi)和脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子（TC-rich repeats）等，參與激素響應(yīng)的元件有茉莉酸甲酯響應(yīng)順式調(diào)控元件（TGACG-motif與CGTCA-motif）、參與脫落酸應(yīng)答啟動(dòng)子（ABRE）、赤霉素響應(yīng)元件（TCA-element、P-box）、生長(zhǎng)素響應(yīng)元件（TGA-element、AuxRR-core），參與植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)的元件有分生組織表達(dá)調(diào)控元件（CAT-box）、玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控元件（O2-site）、晝夜節(jié)律調(diào)控元件（Circadian）和胚乳表達(dá)調(diào)控元件（GCN4-motif），此外還有大量光響應(yīng)順式作用調(diào)控元件（G-box、BOX4等）。以上結(jié)果表明，JsPAL基因家族與茉莉花的生長(zhǎng)發(fā)育、激素響應(yīng)和脅迫響應(yīng)密切相關(guān)。此外，在上游2 000 bp啟動(dòng)子區(qū)域中， ?DP_JsPAL1 ?啟動(dòng)子元件數(shù)量較少，SP_JsPAL和MP_JsPAL啟動(dòng)子元件數(shù)量較多。

2.7 茉莉花PAL基因家族組織特異性表達(dá)分析

使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)鑒定JsPAL基因家族成員在茉莉花不同器官中的表達(dá)情況，以莖的相對(duì)表達(dá)量作為對(duì)照，結(jié)果（圖7）顯示， ?SP_JsPAL2、SP_JsPAL3、SP_JsPAL4、DP_JsPAL1、MP_JsPAL3 ?和 ?MP_JsPAL4 ?在茉莉的花中高表達(dá)，而在莖、根、成熟葉和嫩葉中的相對(duì)表達(dá)量普遍較低，說(shuō)明這些基因可能在花的發(fā)育中起關(guān)鍵作用。此外， ?SP_JsPAL1 ?在根中的相對(duì)表達(dá)量高于其他組織， ?MP_JsPAL2 ?在成熟葉中的相對(duì)表達(dá)量高于其他組織。SP_JsPAL和 ?DP_JsPAL1 ?在花中的相對(duì)表達(dá)量總體上高于MP_JsPAL。以上分析結(jié)果表明，多數(shù)JsPAL在茉莉花花的生長(zhǎng)發(fā)育中具有重要作用，且JsPAL具有較強(qiáng)的組織表達(dá)特異性。

2.8 茉莉花PAL基因家族在福州單瓣茉莉花和雙瓣茉莉花不同開(kāi)花階段的表達(dá)模式分析

為探究JsPAL基因在不同瓣型茉莉花中表達(dá)模式的差異，對(duì)JsPAL基因家族在不同開(kāi)花時(shí)期的福州單瓣和雙瓣茉莉花中的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果（圖8）顯示，除福州單瓣茉莉花 ?SP_JsPAL3和MP_JsPAL2 ?在不同開(kāi)花時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異外，多數(shù)福州單瓣茉莉花與所有雙瓣茉莉花在不同開(kāi)花時(shí)期的JsPAL相對(duì)表達(dá)量均有顯著差異；部分JsPAL在福州單瓣茉莉花F3階段的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他階段，如 ?SP_JsPAL2、SP_JsPAL4、MP_JsPAL1 ?和 ?MP_JsPAL3 ?；雙瓣茉莉花 ?DP_JsPAL1 ?在F3階段的相對(duì)表達(dá)量最高；福州單瓣茉莉花中，相對(duì)表達(dá)量最高的是 ?SP_JsPAL2 ?的F3階段，約為其F1階段相對(duì)表達(dá)量的8.8倍，且SP_JsPAL的相對(duì)表達(dá)量總體上高于MP_JsPAL和 ?DP_JsPAL1 ?；雙瓣茉莉花中，相對(duì)表達(dá)量最高的是 ?DP_JsPAL1 ?的F3階段，約為其F1階段相對(duì)表達(dá)量的1.5倍。多數(shù)JsPAL基因在福州單瓣茉莉花中整體相對(duì)表達(dá)量高于雙瓣茉莉花。將福州單瓣和雙瓣茉莉不同階段的香氣成分含量與其不同開(kāi)放階段的PAL基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析（圖9），結(jié)果顯示， ?SP_JsPAL1 ?和 ?SP_JsPAL2 ?與2-苯乙醇和苯乙醛含量呈顯著正相關(guān)，其中 ?SP_JsPAL1 ?還與苯甲醛含量呈顯著正相關(guān)。

3 討 論

目前，關(guān)于茉莉花基因的研究主要集中于萜類化合物合成途徑中的關(guān)鍵酶，例如，萜類合成酶（TPS）[1]、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶（MVD）[23]、大根香葉烯合成酶（GDS）[24]、牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶（GGPPS）[25]等，但對(duì)苯丙烷類化合物合成途徑中重要基因的研究還不夠深入。本研究分別從單瓣茉莉花、雙瓣茉莉花和重瓣茉莉花的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定出4個(gè)、1個(gè)和4個(gè)PAL基因家族成員。通過(guò)染色體定位分析發(fā)現(xiàn)JsPAL基因家族分布在5條染色體上，且呈現(xiàn)出串聯(lián)重復(fù)的形式，說(shuō)明JsPAL基因在進(jìn)化過(guò)程中可能經(jīng)歷了若干次的基因復(fù)制擴(kuò)增事件[11]。此外，序列比對(duì)結(jié)果顯示，JsPAL均包含1個(gè)由丙氨酸-絲氨酸-甘氨酸（Ala-Ser-Gly）組成的三肽活性中心，其能夠通過(guò)脫水產(chǎn)生4-甲基咪唑酮-5-酮（MIO），MIO能夠影響PAL的活性[26]，缺少此三肽活性中心會(huì)導(dǎo)致PAL活性降低甚至失去酶活性。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析結(jié)果顯示，茉莉花PAL基因與擬南芥和山茶花的親緣關(guān)系比與水稻和玉米的親緣關(guān)系緊密，在同源關(guān)系比對(duì)中發(fā)現(xiàn)，單瓣茉莉花、重瓣茉莉花和擬南芥間較雙瓣茉莉花和擬南芥間具有更強(qiáng)的同源進(jìn)化關(guān)系。鑒于茉莉花PAL基因和擬南芥PAL基因的同源性，推測(cè)同一亞家族中的PAL同源基因?qū)赡馨l(fā)揮相似功能，擬南芥 ?AtPAL1和AtPAL2 ?參與調(diào)控類黃酮生物合成， ?AtPAL4 ?與木質(zhì)素的合成有關(guān)[27-28]。推測(cè)其同源基因 ?MP_JsPAL1和SP_JsPAL3 ?可能參與類黃酮的生物合成。

PAL基因在植物組織中存在特異性表達(dá)，蘋(píng)果的PAL基因家族中 ?MdPAL1和MdPAL5 ?在花和葉中的表達(dá)量較高， ?MdPAL3 ?在莖和果中的表達(dá)量較高[29]；云錦杜鵑RhPAL相對(duì)表達(dá)量在芽中最高，在老葉中最低[12]。孫君等[14]通過(guò)檢測(cè)茉莉花開(kāi)放過(guò)程中JsPAL相對(duì)表達(dá)量的變化，發(fā)現(xiàn)茉莉花在半開(kāi)放階段PAL相對(duì)表達(dá)量最高，隨著時(shí)間的推移相對(duì)表達(dá)量逐漸降低，并推測(cè)茉莉花花香強(qiáng)度與JsPAL的相對(duì)表達(dá)量有關(guān)。本研究中，除 ?SP_JsPAL1 ?和 ?MP_JsPAL2 ?外，多數(shù)JsPAL在茉莉花的花中相對(duì)表達(dá)量最高，在根、莖、成熟葉和嫩葉中的相對(duì)表達(dá)量較低。與孫君等[14]的結(jié)果相似，推測(cè)JsPAL在茉莉花的生長(zhǎng)發(fā)育中具有重要的調(diào)控作用。 ?SP_JsPAL1 ?在茉莉花根中的相對(duì)表達(dá)量最高， ?MP_JsPAL2 ?在茉莉花成熟葉中的相對(duì)表達(dá)量最高，推測(cè)二者可能在茉莉花根和葉的生長(zhǎng)發(fā)育中起重要調(diào)控作用。

苯丙烷類化合物是茉莉花香氣物質(zhì)的主要組成部分，它是由PAL催化苯丙氨酸生成反式肉桂酸后，通過(guò)羥基化、?；图谆确磻?yīng)步驟后形成的各類揮發(fā)性物質(zhì)[30]，主要包括乙酸芐酯、苯甲醇、苯甲酸芐酯、苯甲酸甲酯和水楊酸甲酯等[3]。牽牛花PAL家族基因在苯丙烷代謝途徑中對(duì)乙酸芐酯和苯甲醇的合成起重要的調(diào)控作用[31]，推測(cè)茉莉花PAL家族基因?qū)Χ呔哂邢嗨频恼{(diào)控作用。JsPAL在茉莉花不同開(kāi)花時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量具有顯著差異，高麗萍等[3]發(fā)現(xiàn)JsPAL基因相對(duì)表達(dá)量在茉莉花半開(kāi)放時(shí)較開(kāi)放初期有顯著提高；張芊[32]和熊青等[15]發(fā)現(xiàn)在茉莉花預(yù)備開(kāi)花階段JsPAL基因相對(duì)表達(dá)量隨著時(shí)間的推移遞增，在茉莉花初開(kāi)放時(shí)PAL相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值，隨后呈下降趨勢(shì)；本研究結(jié)果顯示，福州單瓣茉莉花 ?SP_JsPAL3 ?、 ?SP_JsPAL4 ?和 ?MP_JsPAL1 ?的相對(duì)表達(dá)量在F1至F3階段遞增，在F4階段呈下降趨勢(shì)，推測(cè)茉莉花花香強(qiáng)度在F1至F3階段遞增，在F3階段達(dá)到峰值后逐漸下降，與張芊[32]和熊青等[15]的研究結(jié)果基本一致。本研究對(duì)JsPAL在福州單瓣茉莉花和雙瓣茉莉花不同開(kāi)花時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量分析結(jié)果表明， ?SP_JsPAL2、SP_JsPAL4、MP_JsPAL1 ?和 ?MP_JsPAL3 ?在福州單瓣茉莉花F3時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量較高， ?DP_JsPAL1 ?在雙瓣茉莉花F3時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量較高。推測(cè) ?SP_JsPAL2、SP_JsPAL4、MP_JsPAL1 ?和 ?MP_JsPAL3 ?對(duì)福州單瓣茉莉花中苯丙烷類化合物的形成具有重要作用， ?DP_JsPAL1 ?對(duì)雙瓣茉莉花中苯丙類化合物的合成起重要作用，且可能參與調(diào)控茉莉花香氣的形成。此外，JsPAL的相對(duì)表達(dá)量與花香強(qiáng)度相關(guān)[14]，JsPAL在福州單瓣茉莉花中的整體相對(duì)表達(dá)量高于雙瓣茉莉花，暗示福州單瓣茉莉花花香強(qiáng)度高于雙瓣茉莉花，這與郭素枝等[33]的研究結(jié)果基本一致。苯甲醛是苯丙氨酸通過(guò)PAL脫氨后合成肉桂酸，再由肉桂酸直接合成的，而2-苯乙醇和苯乙醛是由苯丙氨酸通過(guò)其他途徑生成的；苯甲醛可以通過(guò)氧化合成苯甲酸，苯甲酸是揮發(fā)性苯甲酸甲酯和水楊酸甲酯的前體物質(zhì)[34]。此外，苯甲醛還可以直接合成苯甲醇，苯甲醇是影響茉莉花的清香香氣的重要物質(zhì)，且其在福州單瓣茉莉中的含量較高[18]，本研究中 ?SP_JsPAL1 ?相對(duì)表達(dá)量與苯甲醛含量呈顯著正相關(guān)，表明 ?SP_JsPAL1 ?可能對(duì)福州單瓣茉莉鮮靈香氣的形成具有重要作用。

4 結(jié) 論

本研究基于福州單瓣茉莉花、雙瓣茉莉花和重瓣茉莉花全基因組數(shù)據(jù)，對(duì)茉莉花PAL基因進(jìn)行鑒定，分別得到4個(gè)、1個(gè)和4個(gè)具有完整結(jié)構(gòu)域的茉莉花PAL基因。茉莉花PAL家族基因主要在花中高表達(dá)，且 ?SP_JsPAL2、SP_JsPAL4、MP_JsPAL1 ?和 ?MP_JsPAL3 ?可能在福州單瓣茉莉花香氣形成過(guò)程中具有重要調(diào)控作用，且 ?SP_JsPAL1 ?可能對(duì)福州單瓣茉莉鮮靈香氣的形成具有重要作用。 ?DP_JsPAL1 ?可能參與調(diào)控雙瓣茉莉花香氣的形成。此外，SP_JsPAL、 ?DP_JsPAL1 ?和 ?MP_JsPAL ?在茉莉花不同組織及不同開(kāi)花時(shí)期的表達(dá)模式有差異。后續(xù)將對(duì)部分在茉莉花中相對(duì)表達(dá)量差異明顯的基因進(jìn)行功能驗(yàn)證，深入探究JsPAL基因家族成員在茉莉花香氣形成中的作用。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）