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    黔產(chǎn)劍葉鳳尾蕨的化學成分研究

    2024-04-29 00:00:00肖麗申琳燕張敬杰何康葉江海趙臣亮張奇龍鄒娟
    廣西植物 2024年2期
    關鍵詞:化學成分

    摘 要:為研究劍葉鳳尾蕨(Pteris ensiformis)的化學成分,該研究選用硅膠、凝膠、MCI、C18等柱色譜進行分離純化,結(jié)合1H-NMR、13C-NMR、MS、IR等波譜數(shù)據(jù)鑒定化合物結(jié)構(gòu),并通過MTS和APTT、PT以及TT等方法對所分離得到的部分單體化合物進行抗腫瘤和抗凝血活性篩選。結(jié)果表明:(1)從劍葉鳳尾蕨中分離得到15個化合物,分別為2-羥基-乙?;量?)、N-(3-羧丙基)-2-乙酰基吡咯(2)、3-羥基-2-甲基吡啶(3)、N-甲基羥胺(4)、pterosin S 13-O-glucoside(5)、obtupterosin C(6)、ent-11α-hydroxy-15-oxokauran-19-oic acid(7)、ent-11α-hydroxy-15-oxokaur-16-en-19-oic acid(8)、β-谷甾醇(9)、ent-11α-hydroxy-15-oxokaur-16-en-19-oic acid-O-glucopyranoside(10)、5, 5′-二丁氧基-2, 2′-雙環(huán)呋喃(11)、5, 5′-二 (2-乙基-己氧基)-2, 2′-雙環(huán)呋喃(12)、黑麥草內(nèi)酯(13)、丁二酸(14)、富馬酸(15)。化合物1為新的吡咯生物堿類天然產(chǎn)物,化合物1-7、10-15為首次從劍葉鳳尾蕨中分離得到,化合物1、3、4為首次從鳳尾蕨屬植物中分離得到。(2)活性測試結(jié)果表明,在濃度為40 μmol·L-1時,化合物1、2、3、5、6、10對腫瘤細胞HL-60、A549、SMMC-7721、MDA-MB-231及SW480的體外腫瘤生長有抑制作用;在樣品濃度為2.0 mmol·L-1時,化合物1、2、3、6對APTT有縮短作用,化合物1、5、6對PT有延長作用。該研究結(jié)果豐富了黔產(chǎn)劍葉鳳尾蕨的化學成分,為抗腫瘤藥物的研發(fā)提供了物質(zhì)基礎。

    關鍵詞:劍葉鳳尾蕨,化學成分,結(jié)構(gòu)鑒定,抗腫瘤活性,抗凝血活性

    中圖分類號:Q946 文獻標識碼:A 文章編號:1000-3142(2024)02-0396-09

    基金項目:國家自然科學基金(81660723);貴州省科技計劃項目(黔科合平臺人才(2017)5618);貴州省中醫(yī)藥管理局項目(QZYY-2015-125)。

    第一作者:肖麗(1999-),碩士研究生,研究方向為中藥及民族藥資源與化學,(E-mail)2713500642@qq.com。

    *通信作者:鄒娟,博士,副教授,研究方向為中藥及民族藥資源與化學,(E-mail)zoujuan466@gzy.edu.cn。

    Chemical constituents of Pteris ensiformis from Guizhou

    XIAO Li1, SHEN Linyan1, ZHANG Jingjie1, HE Kang1, YE Jianghai1,

    ZHAO Chenliang1, ZHANG Qilong2, ZOU Juan1*

    ( 1. Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550025, China;2. College of Basic Medicine, Guizhou Medical University, Guiyang 550025, China )

    Abstract: To study the chemical constituents of Pteris ensiformis, silica gel, gel, MCI, C18 and other column chromatography were used for separation and purification, and their structures were identified by 1H-NMR, 13C-NMR, MS, IR and othe spectral data; the anti-tumor and anti-coagulation activities of some monomers were screened by MTS, APTT, PT and TT. The results were as follows:(1) A total of 15 compounds were isolated from P. ensiformis, the compounds were 2-hydroxy-acetylpyrrole (1), N-(3-carboxypropyl)-2-acetylpyrrole (2), 3-hydroxy-2-methylpyridine (3), N-methylhydroxylamine (4), pterosin S 13-O-glucoside (5), obtupterosin C (6), ent-11α-hydroxy-15-oxokauran-19-oic acid (7), ent-11α-hydroxy-15-oxokaur-16-en-19-oic acid (8), β-sitosterol (9), ent-11α-hydroxy-15-oxokaur-16-en-19-oic acid-O-glucopyranoside (10), 5, 5′-dibutoxy-2, 2′-bifuran (11), 5, 5′-di(2-ethyl-hexyloxy)-2, 2′-bifuran (12), (-)-loliolide (13), succinic acid (14), fumaric acid (15). Compound 1 is a new natural product of pyrrole alkaloids. Compounds 1-7, 10-15 were isolated from P. ensiformis for the first time, and compounds 1, 3, 4 were isolated from Pteris for the first time. (2) The results of activity test showed that compounds 1, 2, 3, 5, 6 and 10 inhibited the growth of tumor cells HL-60, A549, SMMC-7721, MDA-MB-231 and SW480 in vitro at a concentration of 40 μmol·L-1, At the concentration of 2.0 mmol·L-1, compounds 1, 2, 3 and 6 shortened APTT and compounds 1, 5 and 6 prolonged PT. The study enriches the chemical constituents of" P. ensiformis from Guizhou and provides a material basis for the development of anti-tumor drugs.

    Key words: Pteris ensiformis, chemical constituent, structural identification, anti-tumor activity, anticoagulant activity

    劍葉鳳尾蕨(Pteris ensiformis)為鳳尾蕨屬植物,又名細葉鳳尾草、鳳尾草、井欄草、鳳凰草、井邊茜,在我國分布于華南、西南、華東及臺灣等地,以全草或根莖入藥(張艷等,2016;Shi et al.,2017)。劍葉鳳尾蕨有清熱利濕、活血破瘀、消腫解毒的功效(Liva et al.,2009;潘爐臺等,2012;管玉格等,2018),可用于痢疾、黃疸、淋證、跌打損傷等疾病的治療(管玉格等,2018)。有研究表明,劍葉鳳尾蕨中含有二萜類、倍半萜類、黃酮類、酚酸類等化合物(張艷等,2016;Hou et al.,2020),其中二萜類和倍半萜類化合物具有一定的抗腫瘤活性,而二萜類化合物抗腫瘤活性較好,尤其是母核為對映-貝殼杉烷型的二萜,如pterisolic acid C能有效控制人胃癌細胞BGC-823、人結(jié)腸癌細胞HCT-116和肝癌細胞Hep G2(張艷等,2016),但尚未發(fā)現(xiàn)有關黔產(chǎn)劍葉鳳尾蕨化學成分和生物活性研究的報道。因此,為更深入研究黔產(chǎn)劍葉鳳尾蕨植物的化學成分,以獲得更多含量較高、活性較強、低毒性的天然化學成分,本課題從黔產(chǎn)劍葉鳳尾蕨醇提物中分離得到15個化合物,經(jīng)波譜數(shù)據(jù)分析分別鑒定為2-羥基-乙?;量?)、N-(3-羧丙基)-2-乙?;量?)、3-羥基-2-甲基吡啶(3)、N-甲基羥胺(4)、pterosin S 13-O-glucoside(5)、obtupterosin C(6)、ent-11α-hydroxy-15-oxokauran-19-oic acid(7)、ent-11α-hydroxy-15-oxokaur-16-en-19-oic acid(8)、β-谷甾醇(9)、ent-11α-hydroxy-15-oxokaur-16-en-19-oic acid-O-glucopyranoside(10)、5, 5′-二丁氧基-2, 2′-雙環(huán)呋喃(11)、5, 5′-二 (2-乙基-己氧基)-2, 2′-雙環(huán)呋喃(12)、黑麥草內(nèi)酯(13)、丁二酸(14)、富馬酸(15)。化合物1為新天然產(chǎn)物,除化合物8和化合物9外,其余化合物均為首次從劍葉鳳尾蕨中分離得到,其中化合物1、3、4為首次從鳳尾蕨屬中分離得到。本研究初步探究了部分化合物的抗腫瘤及抗凝血活性,在濃度為40 μmol·L-1時,化合物1、2、3、5、6、10可抑制腫瘤細胞HL-60、A549、SMMC-7721、MDA-MB-231和SW480的體外腫瘤生長;當樣品濃度為2.0 mmol·L-1時,化合物1、2、3、5、6顯示出不同程度的抗凝血活性。

    1 儀器與材料

    Bruker Avance NEO 600 MHz核磁共振光譜儀、Bruker Daltonics Compact質(zhì)譜儀(德國BRUKER儀器公司);ICAN傅立葉變換紅外光譜儀(天津市能譜科技有限公司);X-5顯微熔點測定儀(鞏義市予華儀器有限責任公司);WFH-203B三用紫外分析儀(上海精科實業(yè)有限公司);柱色譜硅膠(100~200目、200~300目、300~400目,青島海洋化工廠分廠);CHP 20P 75~150 μm MCI GEL(日本三菱化學公司);30~60目聚酰胺(臺州市路橋四甲生化塑料廠);石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、冰醋酸(貴州祥輝儀器有限公司,AR)。

    Cellometer mini細胞計數(shù)儀(美國Nexelom公司);370 CO2培養(yǎng)箱、MULTISKAN FC酶標儀(美國Thermo公司);MC-4000血凝儀(德國美創(chuàng)醫(yī)療儀器生產(chǎn)貿(mào)易有限公司);093UK-K272A凝血質(zhì)控血漿、APTT試液、PT試液、TT試液(德國TECO公司);HL-60白血病細胞、A549肺癌細胞、SMCC-7721肝癌細胞、MDA-MB-231乳腺癌細胞、SW480結(jié)腸癌細胞(美國ATCC公司);N1001A順鉑、D1106A紫杉醇(美侖生物科技公司);MTS試劑盒(美國Promega公司)。

    試驗藥材采自貴州省黔東南苗族侗族自治州黎平縣,經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學趙俊華教授鑒定為鳳尾蕨科鳳尾蕨屬植物劍葉鳳尾蕨(Pteris ensiformis),植物憑證標本存放于貴州中醫(yī)藥大學生藥學實驗室。

    2 提取與分離

    干燥劍葉鳳尾蕨藥材19.5 kg。常溫下用95%工業(yè)甲醇浸漬,每次7 d,共浸漬提取7次(95%甲醇提取1次,90%甲醇提取3次,70%甲醇提取3次),合并提取液,減壓回收溶劑得到浸膏約7.8 kg。將浸膏用適量溫水溶解,采用液-液萃取法,依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇進行萃取,分別減壓回收溶劑得到石油醚部位1 590 g、乙酸乙酯部位340 g、正丁醇部位2 550 g。

    乙酸乙酯部位(340 g)采用MCI樹脂(GELCHP 20P)反相柱色譜初步分離,以甲醇-水為洗脫系統(tǒng)(3∶7、1∶1、3∶2、7∶3、4∶1、9∶1、10∶0)進行梯度洗脫,得到Fr.A~Fr.G共7個組分。Fr.A(172 g)經(jīng)硅膠柱色譜,以二氯甲烷-乙酸乙酯(30∶1→0∶1)、乙酸乙酯-甲醇(20∶1→1∶1)進行梯度洗脫,結(jié)合重結(jié)晶得到化合物3(23 mg),將剩余流分按TLC檢測結(jié)果合并,分別得到Fr.A-1~Fr.A-6。Fr.A-1(45 g)經(jīng)硅膠柱色譜,結(jié)合凝膠柱色譜及重結(jié)晶等方法,得到化合物11(23 mg)、1(29 mg)、4(8 mg)。Fr.B(41 g)經(jīng)硅膠柱色譜以二氯甲烷-甲醇(100∶1→1∶1)進行梯度洗脫,得到Fr.B-1~Fr.B-6。Fr.B-1、Fr.B-2經(jīng)硅膠柱色譜及重結(jié)晶,得到化合物13(76 mg)、2(20 mg)、8(18 mg)。Fr.C(17 g)經(jīng)硅膠柱色譜,以石油醚-乙酸乙酯(20∶1→3∶1)進行洗脫,重結(jié)晶后得到化合物7(34 mg),并得到6個組分Fr.C-1~Fr.C-6。Fr.C-3和Fr.C-5經(jīng)多次硅膠柱色譜、凝膠柱層析及重結(jié)晶,得到化合物9(384 mg)和化合物12(7 mg)。將Fr.C剩余樣品部分與Fr.D合并(12 g),經(jīng)C18反相柱色譜,以甲醇-水(1∶1、3∶2、7∶3、85∶15、10∶0)進行梯度洗脫,得到Fr.CD-1~Fr.CD-3。其中,F(xiàn)r.CD-1經(jīng)硅膠柱色譜,結(jié)合凝膠柱色譜與重結(jié)晶得到化合物10(64 mg)。

    正丁醇部位(2 550 g)經(jīng)硅膠柱色譜,以乙酸乙酯-甲醇(1∶0、50∶1、30∶1、10∶1、5∶1、3∶1、1∶1)進行梯度洗脫,得到Fr.H~Fr.N共7個組分。Fr.H(220 g)經(jīng)硅膠柱色譜,以石油醚-乙酸乙酯(15∶1→1∶1)進行洗脫,得到Fr.H-1~Fr.H-5。其中,F(xiàn)r.H-4(57 g)經(jīng)硅膠柱色譜,結(jié)合凝膠柱色譜及重結(jié)晶得到化合物14(45 mg)。

    Fr.I(383 g)經(jīng)硅膠柱色譜,以二氯甲烷-甲醇(30∶1→3∶1)進行洗脫,得到Fr.I-1~Fr.I-5。Fr.I-3經(jīng)反復硅膠柱色譜及重結(jié)晶得到化合物15(14 mg)。Fr.L(397 g)經(jīng)硅膠柱色譜,以二氯甲烷-甲醇(50∶1→1∶1)進行洗脫,得到Fr.L-1~Fr.L-7。Fr.L-4(48 g)經(jīng)C18反相柱色譜,以甲醇-水(1∶1、3∶2、7∶3、85∶15、10∶0)進行梯度洗脫,得到Fr.L-4-1~Fr.L-4-5。其中,F(xiàn)r.L-4-2經(jīng)硅膠柱色譜及重結(jié)晶得到化合物6(29 mg)和化合物5(57 mg)。

    3 結(jié)構(gòu)鑒定

    化合物1 白色結(jié)晶(甲醇),熔點(melting point, mp):111.9~131.1℃;在254 nm的紫外波長下觀察有熒光。HR-ESI-MS數(shù)據(jù)顯示,[M+Na]m/z 148.036 4(計算值C6H7NO2Na,148.036 9),確定該化合物的分子式為C6H7NO2,不飽和度為4。紅外光譜(IR)數(shù)據(jù)顯示,在1 644.7 cm-1處有吸收提示可能有羰基,在3 311.4 cm-1處有吸收提示可能有羥基。

    1H-NMR(600 MHz,Methanol-d4)數(shù)據(jù)可知,δH 7.09(1H,dd,J =2.4,1.4 Hz),7.00(1H,dd,J =3.9,1.4 Hz),6.24(1H,dd,J =3.9,2.4 Hz)推測該化合物可能含有2個雙鍵上的氫信號,δH 4.63(2H,s)推測為連氧碳上的氫信號且與季碳相連。由13C-NMR(150 MHz,Methanol-d4)數(shù)據(jù)可知,化合物1有6個碳信號,其中δC 189.9推測為1個羰基碳信號,δC 65.2推測有1個連氧碳信號,δC 130.1、126.6、117.4、111.2推測可能有2個雙鍵上的碳信號。結(jié)合13C-NMR和DEPT譜可推斷出該化合物含有6個碳,其中1個亞甲基、3個次甲基和2個季碳。綜合以上數(shù)據(jù),可初步推斷出該化合物為吡咯生物堿類化合物。

    1H-1H COSY譜可知,δH 6.24(H-4)與δH 7.00(H-3)、7.09(H-5)相關,可推出C3-C4-C5片段。據(jù)NOESY譜中δH 4.63(H-7)與δH 7.00(H-3)相關且在HMBC譜中,δH 4.63(H-7)與δC 189.9(C-6)有相關信號,顯示該羥甲基連接在C-6位。δH 6.24(H-4)與δC 117.4(C-3),126.6(C-5),130.1(C-2)有相關信號,δH 7.00(H-3)與δC 111.2(C-4),126.6(C-5),130.1(C-2)有相關信號,δH 7.09(H-5)與δC 117.4(C-3),111.2(C-4),130.1(C-2)有相關信號。

    綜上所述,鑒定化合物1的結(jié)構(gòu)如圖1所示,此化合物為新天然產(chǎn)物,命名為2-羥基-乙?;量;衔锏腍MBC、1H-1H COSY、NOESY譜相關信號見圖2,具體核磁數(shù)據(jù)見表1。

    化合物2 C10H13NO3,白色結(jié)晶(甲醇)。HR-ESI-MS:[M+Na] m/z 218.078 7。1H-NMR(600 MHz,Methanol-d4)δ:7.11(1H,dd,J =4.1,1.7 Hz,H-3),7.04(1H,t,J =2.1 Hz,H-5),6.16(1H,dd,J =4.1,2.5 Hz,H-4),4.36(2H,t,J =6.9 Hz,H-1′),2.42(3H,s,H-7),2.22(2H,t,J =7.4 Hz,H-3′),2.00~1.96(2H,m,H-2′);13C-NMR(150 MHz,Methanol-d4)δ: 131.0(C-2),122.8(C-3),109.4(C-4),132.7(C-5),190.3(C-6),27.1(C-7),49.6(C-1′),27.7(C-2′),31.5(C-3′),176.6(C-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(李蒙等,2019)報道一致,故鑒定化合物2為N-(3-羧丙基)-2-乙?;量?/p>

    化合物3 C6H7NO,白色結(jié)晶(甲醇)。HR-ESI-MS:[M+H] m/z 110.060 0。1H-NMR(600 MHz,Methanol-d4)δ:7.85(1H,dd,J =4.9,1.4 Hz,H-6),7.16(1H,dd,J =8.2,1.4 Hz,H-4),7.08(1H,dd,J =8.2,4.9 Hz,H-5),2.39(3H,s,H-7);13C-NMR(150 MHz,Methanol-d4)δ:147.5(C-2),153.8(C-3),123.4(C-4),123.7(C-5),139.2(C-6),18.4(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(段潔等,2009)報道一致,故鑒定化合物3為3-羥基-2-甲基吡啶。

    化合物4 白色粉末。1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:4.17(1H,m,-NH),3.17(3H,d,J =5.1 Hz,-CH3);13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:48.8(-NCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(張寶等,2018)報道一致,故鑒定化合物4為N-甲基羥胺。

    化合物5 白色結(jié)晶(DMSO)。HR-ESI-MS:[M+Na]m/z 435.161 8,C20H28O91H-NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:7.44(1H,s,H-4),5.03(1H,d,J =4.8 Hz,H-14β),4.87(1H,d,J =5.6 Hz,H-14α),4.61(1H,t,J =4.8 Hz,H-3),4.18(1H,d,J =7.8 Hz,H-1′),3.81(1H,d,J =8.2 Hz,H-13α),3.65(1H,d,J =6.4 Hz,H-6′α),3.61(1H,d,J =8.7 Hz,H-13β),3.42(1H,s,H-6′β),3.13(1H,d,J =4.5 Hz,H-5′),3.10(2H,d,J =7.8 Hz,H-12),3.09(1H,d,J =3.7 Hz,H-3′),3.04(1H,d,J =9.1 Hz,H-4′),2.96(1H,d,J =8.3 Hz,H-2′),2.44(3H,s,H-11),2.43~2.40(1H,m,H-2),1.21(3H,d,J =7.3 Hz,H-10);13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:205.1(C-1),53.5(C-2),73.8(C-3),126.3(C-4),145.0(C-5),137.3(C-6),138.6(C-7),131.0(C-8),154.0(C-9),12.7(C-10),20.8(C-11),28.9(C-12),68.3(C-13),54.8(C-14),103.0(C-1′),73.6(C-2′),77.0(C-3′),70.2(C-4′),76.9(C-5′),61.2(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(Murakami et al.,1985)報道一致,故鑒定化合物5為pterosin S 13-O-glucoside。

    化合物6 白色結(jié)晶(甲醇)。1H-NMR(600 MHz,Methanol-d4)δ:7.51(2H,s,H-4,4′),5.11(2H,d,J =12.1 Hz,H-14α,14′α),5.00(2H,d,J =12.1 Hz,H-14β,14′β),4.74(2H,d,J =4.1 Hz,H-3,3′),4.25(2H,d,J =7.8 Hz,Glc-1,1′),4.06(2H,d,J =7.4 Hz,H-13α,13′α),3.84(2H,s,Glc-6α,6′α),3.69(2H,d,J =9.6 Hz,H-13β,13′β),3.66(2H,s,Glc-6β,6′β),3.31(2H,s,Glc-3, 3′),3.27(2H,s,Glc-2, 2′),3.26(2H,s,Glc-5, 5′),3.21(4H,d,J =7.9 Hz,H-12,12′),3.19(2H,s,Glc-4, 4′),2.52(6H,s,H-11,11′),1.34(6H,d,J =7.3 Hz,H-10,10′);13C-NMR(150 MHz,Methanol-d4)δ:207.8(C-1,1′),54.9(C-2,2′),76.1(C-3,3′),127.7(C-4,4′),147.3(C-5,5′),138.5(C-6,6′),139.6(C-7,7′),132.9(C-8,8′),155.3(C-9,9′),13.0(C-10,10′),21.5(C-11,11′),29.9(C-12,12′),70.2(C-13,13′),57.8(C-14,14′),104.6(Glc-1,1′),71.6(Glc-2,2′),78.0(Glc-3,3′),75.1(Glc-4,4′),78.0(Glc-5,5′),62.7(Glc-6,6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(Peng et al.,2020)報道一致,故鑒定化合物6為obtupterosin C。

    化合物7 C20H30O4,白色結(jié)晶(甲醇)。HR-ESI-MS:[M+Na] m/z 357.203 6。1H-NMR(600 MHz,Methanol-d4)δ:3.88(1H,d,J =5.4 Hz,H-11′),2.43~2.37(2H,m,H-6),2.26(1H,p,J =6.8 Hz,H-2′),2.17~2.12(1H,m,H-7′),1.95(1H,d,J =3.1 Hz,H-12′),1.92(1H,s,H-16),1.90(1H,d,J =3.1 Hz,H-1′),1.89(1H,d,J =2.7 Hz,H-12),1.88~1.83(1H,m,H-13),1.80(1H,ddd,J =13.6,11.7,2.5 Hz,H-3′),1.73(1H,td,J =13.3,3.5 Hz,H-9),1.47~1.42(1H,m,H-2),1.42~ 1.38(1H,m,H-7),1.38~1.34(1H,m,H-5),1.23(3H,d,J =6.9 Hz,H-17),1.21(3H,s,H-20),1.18(2H,d,J =12.4 Hz,H-14),1.13~1.08(1H,m,H-1),1.06(1H,dd,J =13.5,4.4 Hz,H-3),0.96(3H,s,H-18);13C-NMR(150 MHz,Methanol-d4)δ:40.6(C-1),20.0(C-2),39.0(C-3),44.6(C-4),57.5(C-5),21.3(C-6),36.3(C-7),52.5(C-8),62.3(C-9),39.7(C-10),65.7(C-11),34.4(C-12),35.9(C-13),38.3(C-14),224.8(C-15),50.6(C-16),11.5(C-17),29.4(C-18),181.3(C-19),16.0(C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻(Maosong et al.,2016)報道一致,故鑒定化合物7為ent-11α-hydroxy-15-oxokauran-19-oic acid。

    化合物8 C20H28O4,白色結(jié)晶(甲醇)。HR-ESI-MS:[M+Na] m/z 355.187 9。1H-NMR(600 MHz,Methanol-d4)δ:5.72(1H,s,H-17),5.24(1H,s,H-17),4.01(1H,d,J =4.6 Hz,H-11),3.03(1H,d,J =4.0 Hz,H-13),2.43(1H,d,J =11.8 Hz,H-9),1.22(3H,s,H-19),0.99(3H,s,H-20);13C-NMR(150 MHz,Methanol-d4)δ:40.9(C-1),20.1(C-2),39.0(C-3),44.7(C-4),57.5(C-5),21.2(C-6),37.8(C-7),52.0(C-8),63.7(C-9),40.0(C-10),66.7(C-11),41.4(C-12),38.5(C-13),35.3(C-14),212(C-15),152.2(C-16),112.7(C-17),29.5(C-18),181.4(C-19),16.3(C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻(張德志等,1990)報道一致,故鑒定化合物8為ent-11α-hydroxy-15-oxokaur-16-en-19-oic acid。

    化合物9 白色針狀結(jié)晶(氯仿)。1H-NMR(600 MHz,Chloroform-d)δ:5.35(1H,d,J =4.5 Hz,H-6),3.56~3.48(1H,m,H-3),1.00(3H,s,CH3-19),0.92(3H,d,J =6.4 Hz,CH3-21),0.84(3H,d,J =2.5 Hz,CH3-29),0.82(3H,d,J =6.5 Hz,CH3-26),0.80(3H,s,CH3-27),0.67(3H,s,CH3-18);13C-NMR(150 MHz,Chloroform-d)δ:37.4(C-1),32.1(C-2),72.0(C-3),42.5(C-4),140.9(C-5),121.9(C-6),31.8(C-7),32.1(C-8),50.3(C-9),36.7(C-10),21.2(C-11),39.9(C-12),42.4(C-13),56.9(C-14),24.5(C-15),28.4(C-16),56.2(C-17),12.0(C-18),18.9(C-19),36.3(C-20),19.2(C-21),34.1(C-22),26.2(C-23),46.0(C-24),29.3(C-25),20.0(C-26),19.5(C-27),23.2(C-28),12.1(C-29)。以上數(shù)據(jù)與文獻(Song et al.,2013)報道一致,故鑒定化合物9為β-谷甾醇。

    化合物10 C26H38O9,白色結(jié)晶(甲醇)。HR-ESI-MS:[M+Na] m/z 517.240 8。1H-NMR(600 MHz,Methanol-d4)δ:5.71(1H,s,H-17α),5.41(1H,d,J =8.0 Hz,H-1′),5.23(1H,s,H-17β),4.00(1H,d,J =4.3 Hz,H-11),3.83(1H,d,J =11.9 Hz,H-13),3.69(1H,dd,J =12.0,4.1 Hz,H-9),3.40(1H,d,J =9.1 Hz,H-3′),3.37(1H,s,H-4′),3.36(1H,d,J =1.3 Hz,H-5′),3.35(1H,s,H-2′),3.03~3.00(2H,m,H-6′),2.47(1H,d,J =12.0 Hz,H-14α),2.21(1H,d,J =13.1 Hz,H-3β),2.10~2.06(1H,m,H-2α),2.04~1.98(1H,m,H-1β),1.97(1H,s,H-2β),1.94(2H,d,J =3.2 Hz,H-6),1.83~1.77(1H,m,H-7β),1.48~1.44(1H,m,H-14β),1.38~1.37(1H,m,H-7α),1.35(2H,s,H-12),1.26(3H,s,H-18),1.23(1H,d,J =6.7 Hz,H-5),1.14~1.11(1H,m,H-1α),1.09(1H,d,J =4.1 Hz,H-3α),0.99(3H,s,H-20);13C-NMR(150 MHz,Methanol-d4)δ:40.8(C-1),19.9(C-2),38.9(C-3),45.0(C-4),58.0(C-5),21.0(C-6),37.7(C-7),52.0(C-8),63.6(C-9),40.1(C-10),66.8(C-11),41.3(C-12),38.5(C-13),35.3(C-14),212.1(C-15),152.4(C-16),112.6(C-17),29.0(C-18),178.0(C-19),16.3(C-20),95.6(C-1′),74.0(C-2′),78.7(C-3′),71.1(C-4′),78.7(C-5′),62.4(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(Kazuo et al.,1977)報道一致,故鑒定化合物10為ent-11α-hydroxy-15-oxokaur-16-en-19-oic acid-O-glucopyranoside。

    化合物11 C16H22O4,白色油狀物。HR-ESI-MS:[M+Na] m/z 301.141 0。1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:7.71(2H,dd,J =5.7,3.4 Hz,H-3,3′),7.66(2H,dd,J =5.7,3.4 Hz,H-4,4′),4.21(4H,t,J =6.6 Hz,H-6,6′),1.66~1.60(4H,m,H-7,7′),1.39~1.33(4H,m,H-8,8′),0.88(6H,dt,J =22.5,7.5 Hz,H-9,9′);13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:131.8(C-2,2′),128.8(C-3,3′),131.7(C-4,4′),167.2(C-5,5′),65.2(C-6,6′),30.1(C-7,7′),18.8(C-8,8′),13.7(C-9,9′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(Liu et al.,2010)報道一致,故鑒定化合物11為5, 5′-二丁氧基-2, 2′-雙環(huán)呋喃。

    化合物12 C24H38O4,黃色油狀物。HR-ESI-MS:[M+Na]m/z 413.266 2。1H-NMR(600 MHz,Methanol-d4)δ:7.72(2H,d,J =9.1 Hz,H-3,3′),7.62(2H,d,J =9.1 Hz,H-4,4′),4.31~4.21(4H,m,H-6,6′),1.71(2H,dt,J =20.5,6.6 Hz,H-7,7′),1.49~1.43(4H,m,H-12,12′),1.44~1.40(4H,m,H-8,8′),1.39(4H,m,H-10,10′),1.36~1.33(4H,dd,J =19.3,7.4 Hz,H-9,9′),0.97(6H,dd,J =19.3,7.4 Hz,H-13,13′),0.93(6H,t,J =7.4 Hz,H-11,11′);13C-NMR(150 MHz,Methanol-d4)δ:133.6(C-2,2′),129.9(C-3,3′),132.4(C-4,4′),169.3(C-5,5′),69.1(C-6,6′),40.2(C-7,7′),31.6(C-8,8′),30.1(C-9,9′),24.0(C-10,10′),14.4(C-11,11′),25.0(C-12,12′),11.4(C-13,13′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(Zhi et al.,2015)報道一致,故鑒定化合物12為5, 5′-二 (2-乙基-己氧基)-2, 2′-雙環(huán)呋喃。

    化合物13 白色結(jié)晶(甲醇)。1H-NMR(600 MHz,Methanol-d4)δ:5.75(1H,s,H-7),4.22(1H,p,J =3.5 Hz,H-3),2.42(1H,dt,J =13.5,2.6 Hz,H-4),1.99(1H,dt,J =14.4,2.7 Hz,H-2),1.76(3H,s,H-11),1.74(1H,d,J =4.2 Hz,H-4a),1.53(1H,dd,J =14.5,3.8 Hz,H-2),1.46(3H,s,H-9),1.28(3H,s,H-10);13C-NMR(150 MHz,Methanol-d4)δ:174.5(C-2),113.3(C-3),185.7(C-3a),37.2(C-4),47.9(C-5),67.2(C-6),46.4(C-7),89.0(C-7a),27.0(C-8),31.0(C-9),27.4(C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(Yang et al.,2020)報道一致,故鑒定化合物13為黑麥草內(nèi)酯。

    化合物14 白色結(jié)晶(甲醇)。1H-NMR(600 MHz,Methanol-d4)δ:2.52(4H,s,H-2,3);13C-NMR(150 MHz,Methanol-d4)δ:176.2(C-1,4),29.8(C-2,3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(李燕等,2007)報道一致,故鑒定化合物14為丁二酸。

    化合物15 白色結(jié)晶(甲醇)。1H-NMR(600 MHz,Methanol-d4)δ:6.76(2H,s,H-2,3);13C-NMR(150 MHz,Methanol-d4)δ:168.0(C-1,4),135.2(C-2,3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(譚冰心等,2017)報道一致,故鑒定化合物15為富馬酸。

    化合物1-15的結(jié)構(gòu)式如圖3所示。

    4 抗腫瘤、抗凝血活性篩選結(jié)果

    4.1 抗腫瘤活性篩選結(jié)果

    選取化合物1、2、3、5、6、10,采用MTS法對HL-60白血病細胞、 A549肺癌細胞、SMMC-7721肝癌細胞、MDA-MB-231乳腺癌細胞和SW480結(jié)腸癌細胞進行篩選,以順鉑(cisplatin, DDP)、紫杉醇(taxol)作為陽性對照。由表2可知,6個化合物對HL-60、A549、SMMC-7721、MDA-MB-231、SW480腫瘤細胞均顯示出不同的抗腫瘤活性。

    4.2 抗凝血活性篩選結(jié)果

    通過測定化合物1、2、3、5、6、10人質(zhì)控血漿活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time,APTT)、凝血酶原時間(prothrombin time,PT)和凝血酶時間(thrombin time,TT)的影響來進行抗凝血活性測定,APTT和TT兩組是以依諾肝素(enoxaparin, LMWH)為陽性對照,PT組是以肝素(heparin, HEP)為陽性對照。由表3可知,與空白對照組(control, Con.)相比,當樣品濃度為2.0 mmol·L-1時,化合物1、2、3、6對APTT有微弱縮短作用,化合物1、5、6對PT有微弱延長作用。

    5 討論與結(jié)論

    本研究共分離得到15個化合物,其中化合物1為新天然產(chǎn)物,除化合物8、9外,其余化合物均為首次從劍葉鳳尾蕨中分離獲得。經(jīng)查閱文獻,化合物6對HCT-116細胞表現(xiàn)出細胞毒活性(段潔等,2009),化合物8具有抗腫瘤、抗炎、抗血小板聚集等藥理活性(姜紀武等,1996),化合物9具有降膽固醇、降血糖、抗氧化、抗炎、抑菌等作用(陳躍平等,2021)。本研究對化合物1、2、3、5、6、10進行了抗腫瘤及抗凝血活性篩選。在濃度為40 μmol·L-1時,6個化合物均可抑制腫瘤細胞HL-60、A549、SMMC-7721、MDA-MB-231及SW480的體外腫瘤生長;在樣品濃度為2.0 mmol·L-1時,化合物1、2、3、6對APTT有縮短作用,化合物1、5、6對PT有延長作用。

    綜上所述,本試驗結(jié)果豐富了黔產(chǎn)劍葉鳳尾蕨的化學成分及生物活性,顯示黔產(chǎn)劍葉鳳尾蕨中的化學成分結(jié)構(gòu)多樣且在抗腫瘤方面具有潛在的應用前景,為劍葉鳳尾蕨植物在藥用價值上的開發(fā)利用提供了物質(zhì)基礎及科學依據(jù)。但是,該文未對每種腫瘤細胞進行多種細胞系研究,有待進一步研究。

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    (責任編輯 鄧斯麗)

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