花魔芋軟腐病原真菌分離鑒定

摘 要：魔芋軟腐病是魔芋生產(chǎn)過程中的重要病害，也是限制魔芋產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素。目前，已有報道魔芋軟腐病主要由細(xì)菌引起，鮮有真菌引起魔芋球莖軟腐發(fā)病的報道。為明確云南曲靖市花魔芋（Amorphophallus konjac）軟腐病的病原種類和侵染特征，該研究通過組織分離法，對采集自云南曲靖市的花魔芋病樣進(jìn)行了真菌的分離，通過形態(tài)學(xué)結(jié)合基于ITS與LSU序列分析的分子鑒定方法對分離真菌進(jìn)行鑒定，并根據(jù)柯赫氏法則進(jìn)行致病性測定，并對鑒定出的病原真菌同魔芋軟腐病原細(xì)菌進(jìn)行了雙回接試驗(yàn)分析。結(jié)果表明：（1）從形態(tài)學(xué)和分子水平鑒定了輪紋鐮刀菌（Fusarium concentricum）、尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）和F. ambrosium 3種鐮刀菌，1種毛霉屬真菌（Mucor sp.），1種根霉屬真菌（Rhizopus sp.），1種青霉屬真菌（Penicillium sp.）和1種粉紅螺旋聚孢霉屬真菌（Clonostachys sp.）。（2）統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，輪紋鐮刀菌的相對豐度最高，為45.45%。（3）柯赫氏法則檢測發(fā)現(xiàn)輪紋鐮刀菌具有致病性。（4）輪紋鐮刀菌和病原細(xì)菌胡蘿卜果膠桿菌（Pectobacterium aroidearum）雙接種魔芋球莖發(fā)現(xiàn)軟腐病發(fā)病更快，病變組織重量顯著高于單接種輪紋鐮刀菌或果膠桿菌處理。綜上表明，魔芋軟腐病可能是由真菌和細(xì)菌復(fù)合侵染引發(fā)。該研究結(jié)果為魔芋軟腐病的防治提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：花魔芋，軟腐病，病原真菌，系統(tǒng)發(fā)育分析，致病性

中圖分類號：Q949.32 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1000-3142（2024）02-0333-12

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（31860057）；云南省基礎(chǔ)應(yīng)用研究項(xiàng)目（2019FD103，2019FD105）；云南省地方高校聯(lián)合項(xiàng)目（2017FH001-037）。

第一作者：李竹梅（1988-），博士，講師，研究方向?yàn)椴≡⑸飳W(xué)，（E-mail）lizhume@163.com。

^*通信作者：褚洪龍，博士，副教授，研究方向?yàn)橹参锱c微生物互作、植物抗逆，（E-mail）chuhonglo@163.com。

Isolation and identification of pathogenic fungi from soft rot tissue of Amorphophallus konjac corm

LI Zhumei¹， DONG Kun²， ZHANG Yanan¹， GAO Yong¹， CHEN Hong¹， FANG Pingping¹，

LEI Hongxian¹， LU Xiaoqian¹， CHU Honglong^1，3*

（ 1. College of Biological Resource and Food Engineering， Qujing Normal University， Qujing 655011， Yunnan， China; 2. Fuyuan Konjak Research Institute， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Fuyuan 655500， Yunnan， China; 3. Yunnan Engineering Research Center of Fruit Wine， Qujing Normal University， Qujing 655011， Yunnan， China ）

Abstract： Konjac （Amorphophallus konjac） is a horticultural plant with high nutritional and medicinal values. Soft rot is a severe disease in production of konjac and it is also the main factor restricting the development of the konjac industry. It has been reported that the soft rot of konjac is mainly caused by pathogenic bacteria （mainly including Pectobacterium aroidearum， P. carotovorum subsp. carotovorum， P. chrysanthemi and Enterobacter sp.）， and there is rare reports on pathogenic fungi that cause konjac soft rot. In order to clarify the pathogenic types and infection characteristics of the soft rot in Qujing City， Yunnan Province， the diseased corms were collected for fungal isolation by tissue isolation methods. The isolated fungi were identified by morphological and molecular identification methods based on ITS and LSU sequence analyses， and pathogenicity was determined according to Kochs rule. The infection characteristic was analyzed by mixed inoculation using the identified pathogenic fungi and the pathogenic bacteria of konjac soft rot. The results were as follows： （1） Three species of Fusarium spp. （Fusarium concentricum， F. oxysporum and F. ambrosium）， one species of Mucor sp.， one species of Rhizopus sp.， one species of Penicillium sp. and one species of Clonostachys sp. were identified. （2） Statistics analysis found that Fusarium concentricum had the highest relative abundance （45.45%）. （3） Koch postulates tests showed that inoculation with F. concentricum caused obvious soft rot symptoms of konjac corms within three days. （4） In addition， mixed Pectobacterium aroidearum and Fusarium concentricum together inoculation promoted the disease development， and the weight of" rotten tissue was significantly higher than that of single inoculation using F. concentricum or Pectobacterium aroidearum. Overall， these results indicate that konjac soft rot may be caused by a combination of fungus and bacterium infection. The results provide a theoretical reference for the prevention and management of konjac soft rot.

Key words： Amorphophallus konjac， soft rot， pathogenic fungus， phylogenetic analysis， pathogenicity

魔芋屬（Amorphophallus）植物是天南星科（Araceae）多年生草本植物，主要生長在高海拔山區(qū)（邱凌和仇農(nóng)學(xué)， 1995）。全世界大約有170種，主要分布在越南、緬甸、中國、日本等國家，其中我國約有17種，主要集中分布在廣東、四川、云南等地。魔芋球莖的蛋白質(zhì)含量高于馬鈴薯和甘薯，并且富含膳食纖維。魔芋制品熱量低，營養(yǎng)價值和藥用價值高，食用魔芋具有減肥、降血壓和血糖、改善腸道菌群結(jié)構(gòu)和防癌等功效（Zhang et al.， 2005；Chua et al.， 2010；Srzednicki amp; Borompichaichartkul， 2020）。魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan，KGM）作為魔芋粉的主要成分（Li et al.， 2010），是一種水溶性多糖，在食品科學(xué)、營養(yǎng)保健、生物技術(shù)、藥理學(xué)和精細(xì)化工等領(lǐng)域具有多種用途（Zhang et al.， 2005；Chua et al.， 2010；Behera amp; Ray， 2016；Zhu， 2018；Srzednicki et al.， 2020）?；в螅ˋmorphophallus konjac）作為葡甘聚糖含量最高的魔芋種類之一，是我國主要的栽培種（Gao et al.， 2022）。作為重要經(jīng)濟(jì)作物，魔芋已成為云、貴、川等地區(qū)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展中最具潛力與競爭優(yōu)勢的特色資源產(chǎn)業(yè)之一，也是鄉(xiāng)村振興重點(diǎn)推廣種植的作物。

軟腐病是魔芋病害中影響最為嚴(yán)重的病害。由于缺乏持續(xù)有效的防控措施，被認(rèn)為是對魔芋產(chǎn)業(yè)威脅最大的毀滅性病害，在魔芋生長期和貯藏期均可能發(fā)生。生長期魔芋軟腐病的發(fā)病特征是植株的莖稈、球莖部位會由硬變軟，葉片萎蔫，隨后球莖發(fā)黑腐爛，有臭味散發(fā)出，并會出現(xiàn)倒苗的現(xiàn)象（Wei et al.， 2020；王敏珍等，2021）。在貯藏期及播種期，如果種芋染上軟腐病，球莖在發(fā)病的初期，其表皮會出現(xiàn)水漬狀的褐色斑紋，并不斷地向內(nèi)擴(kuò)展，球莖的白色組織逐漸變成灰色乃至黃褐色，滲出大量濃稠的菌液，致使球莖腐爛（王敏珍等，2021）。軟腐病在魔芋種植區(qū)廣泛傳播嚴(yán)重阻礙了我國魔芋產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

目前，有報道魔芋軟腐病主要由胡蘿卜果膠桿菌（Pectobacterium aroidearum）、胡蘿卜果膠桿菌胡蘿卜軟腐亞種 ［P. carotovorum subsp. carotovorum （Pcc）］、菊果膠桿菌（P. chrysanthemi）和腸桿菌屬（Enterobacter sp.）等引起的細(xì)菌性軟腐病（Wu et al.， 2011；徐煒，2011；黃露等，2014；Wu et al.， 2015；Sun， 2019；Wei et al.， 2020；Zhang et al.， 2022），而關(guān)于魔芋軟腐病病原真菌的報道比較少。何斐等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致魔芋病株的根區(qū)、根表土壤和根系腐爛的病原真菌是腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）和尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）；李迎賓等（2017）通過用離體菌絲塊接種的方法研究表明尖孢鐮刀菌對不同品種魔芋球莖致病力存在著差異；趙興麗等（2022）分離鑒定了魔芋莖腐病的病原菌，也從病樣分離鑒定出尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌2個種，但致病性檢測發(fā)現(xiàn)尖孢鐮刀菌菌株（xymy-8）無致病性，腐皮鐮刀菌（xymy-7、xymy-9）有致病性且致病性有差異。主流觀點(diǎn)認(rèn)為魔芋軟腐病病原菌為細(xì)菌（徐煒，2011；Wu et al.， 2015；Wei et al.， 2020；Zhang et al.， 2022），但研究發(fā)現(xiàn)云南曲靖市地區(qū)儲存期魔芋球莖發(fā)病會在病組織處長出大量真菌菌絲，田間發(fā)病植株取樣放置后也會在極短的時間內(nèi)長出大量菌絲，甚至在田間也能發(fā)現(xiàn)軟腐病組織處有真菌菌絲長出。魔芋軟腐病原細(xì)菌侵染特征相關(guān)研究表明，病原菌不能直接通過自然孔口侵染魔芋塊莖，只能通過芽鞘、傷口侵染致?。S露等，2014；Wu et al.， 2021）。田間魔芋軟腐病能夠短期快速傳播，一方面可能由于田間病原菌累積，雨水沖刷蔓延（張紅驥等，2012）；另一方面可能是由于病原真菌的侵染為病原細(xì)菌侵染提供了通道。

本研究以云南省曲靖市魔芋產(chǎn)業(yè)種植區(qū)為研究區(qū)域，針對花魔芋軟腐病球莖，采用真菌組織分離方法，通過形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)手段以及科赫氏法則檢測，并利用所分離病原真菌與魔芋軟腐病原細(xì)菌進(jìn)行雙回接試驗(yàn)，擬探討以下問題：（1）魔芋軟腐病病原物種類是真菌、細(xì)菌亦或復(fù)合病害；（2）魔芋軟腐病病原真菌的種類、分類地位和病害特征如何。以期為云南地區(qū)魔芋軟腐病的精準(zhǔn)防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

發(fā)病花魔芋球莖采自云南省曲靖市富源縣、沾益區(qū)和陸良縣魔芋種植基地，詳見表1。魔芋發(fā)病癥狀如圖1所示，植株葉片發(fā)黃，有萎蔫癥狀，并會出現(xiàn)倒苗現(xiàn)象，植株的莖稈和/或球莖部位有軟腐癥狀，挖出的球莖發(fā)黑腐爛，散發(fā)出臭味（圖1：A，B，D）。所采病樣在病組織處有大量白色和/或黃色真菌菌絲，有些病樣采集時未發(fā)現(xiàn)真菌菌絲，但在溫放置后會在極短的時間內(nèi)長出大量真菌菌絲（圖1：B，C）。

1.2" 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的分離純化 （1）真菌分離：取具有軟腐病狀的花魔芋球莖，流水沖洗掉表面泥土，取發(fā)病與健康交界處組織切成0.3 cm左右小塊；75%的乙醇浸泡30 s對樣品組織表面消毒，無菌水沖洗3次；將3～5塊消毒后的組織塊轉(zhuǎn)移到PDA（培養(yǎng)基中含3‰乳酸）平板，均勻排布，編號，用封口膜封口；25℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)2～5 d。（2）真菌純化：培養(yǎng)2～5 d后，組織塊周圍長出不同顏色和形狀真菌菌落；用接種針沿菌落邊緣挑取部分菌絲，接種至新PDA平板上，編號，培養(yǎng)箱中25℃暗培養(yǎng)，觀察并記錄其生長情況。重復(fù)真菌純化培養(yǎng)操作2遍。

1.2.2 形態(tài)學(xué)鑒定 將分離純化的菌株培養(yǎng)一周后，制作產(chǎn)孢菌株的臨時玻片，用復(fù)合式顯微鏡（Olympus BX53）觀察菌株的菌絲、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及孢子結(jié)構(gòu)特征并拍照，使用Image FrameWork軟件測量其孢子大?。總€菌株選擇20個孢子）。具體參考《真菌鑒定手冊》（魏景超，1979）進(jìn)行形態(tài)鑒定。

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定 從純化后的真菌培養(yǎng)皿中刮取菌絲，置于1.5 mL離心管中，用液氮研磨，CTAB法提取真菌基因組DNA，用（LR0R： 5′-GTACCCGCTGAACTTAAGC-3′和LR5： 5′- ATCCTGAGGGAAACTTC-3′） （Vilgalys amp; Hester， 1990）與（ITS4： 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′ 和ITS5： 5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）（White et al.， 1990）兩對引物分別擴(kuò)增所分離菌株的LSU和ITS保守區(qū)段，擴(kuò)增后的樣品送測序。測序結(jié)果用BioEdit編輯后，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blastn，下載高同源性序列和相關(guān)數(shù)據(jù)，以Russula vesca菌株作為系統(tǒng)發(fā)育樹的外群，MEGA-X（Clustal W，Neighbor-Joining， bootstrap=1 000）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 致病性鑒定 （1）柯赫氏法則檢測。將鑒定出的7種真菌培養(yǎng)平板，用打孔器打直徑為0.5 cm的菌餅，菌絲面接在健康魔芋塊莖片上，以無菌瓊脂餅為空白對照置于28℃溫箱保濕培養(yǎng)，觀察是否出現(xiàn)軟腐病特征?；疾〗M織塊再次分離真菌，鑒定。（2）病原細(xì)菌和真菌接種試驗(yàn)。處理1（F+P）：將輪紋鐮刀菌的菌餅（直徑0.5 cm）和OD₆₀₀為0.1的胡蘿卜果膠桿菌菌液20 μL接種到健康魔芋塊莖上。處理2（F）：只接種輪紋鐮刀菌菌餅和20 μL無菌水到健康魔芋塊莖上。處理3（P）：只接種OD₆₀₀為0.1的胡蘿卜果膠桿菌菌液20 μL和無菌瓊脂餅到健康魔芋塊莖上。處理4（CK）：接種無菌水和無菌瓊脂餅。將4種處理置于28℃保濕培養(yǎng)3 d，用硅膠勺將軟腐組織挖出稱重，獲得的數(shù)據(jù)用SPSS（IBM SPSS Statistics 19）進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），用Tukey方法檢驗(yàn)，用Excel制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 球莖軟腐真菌分離純化

從發(fā)病花魔芋球莖組織中分離、純化出22株真菌，編號為M1-M25（M2、M13和M16純化失?。?，在PDA培養(yǎng)基25℃培養(yǎng)5 d后觀察菌落形態(tài)、微觀結(jié)構(gòu)特征。其中，菌株M1、M3、M4、M5、M6、M8、M9、M11、M14和M25生長迅速，菌落正反面都呈磚紅偏紫色或淡紫色，邊緣齊整，絨毛狀，菌落表面有白色棉絮狀，環(huán)紋不明顯；分生孢子長約7.51 μm，寬約3.51 μm，以小型分生孢子為主，呈腎形，分生大孢子稍彎、或有隔；菌絲有隔，可產(chǎn)生紅色色素，菌絲中部產(chǎn)孢。菌株M7在PDA生長迅速，菌落中部正、反面都呈紅偏淡紫色，邊緣白色不整齊；分生孢子長約7.60 μm，寬約4.03 μm，小型分生孢子卵圓形，大型分生孢子鐮刀形，有隔，會產(chǎn)生紅色色素，菌絲有隔，從菌絲中間產(chǎn)孢。菌株M10和M15生長迅速，菌落正反面都呈白色，邊緣整齊，絨毛狀，菌落環(huán)紋不明顯；分生孢子長約10.77 μm，寬約5.92 μm，小型分生孢子為主，呈卵圓形，大型分生孢子稍彎，有一個分隔或無分隔，菌絲透明，有隔，從菌絲中部產(chǎn)孢。菌株M12、M19和M22的菌落正面呈白色并帶有淡黃色，菌落中心高于邊緣，有或無環(huán)紋；分生孢子長約4.68 μm，寬約3.16 μm，橢圓形，表面光滑，無隔透明；菌絲白色絮狀，菌絲透明有隔，頂端呈帚狀分枝。菌株M17和M21生長迅速，分生孢子長約5.54 μm，寬約4.01 μm，小型分生孢子為橢圓形，大型分生孢子為球形；菌絲分枝少，透明狀，菌絲的頂端有球形孢子囊產(chǎn)孢。菌株M18、M20和M23生長迅速，菌落正面靠里顏色呈深灰色，邊緣呈白色，反面呈白色，質(zhì)地疏松，邊緣不整齊，無菌落環(huán)紋，菌落表面有黑色；分生孢子為圓形或橢圓形，分生孢子長約4.35 μm，寬約3.61 μm，孢子壁厚；有營養(yǎng)菌絲，大部分無隔，會產(chǎn)生黃色色素，頂端膨大形成孢子囊進(jìn)行產(chǎn)孢。菌株M24生長迅速，菌落正面呈灰白色發(fā)青，反面呈灰白色，邊緣不整齊，絨毛狀，菌落環(huán)紋明顯；分生孢子長約3.15 μm，寬約2.67 μm，分生孢子為球形或卵圓形，孢子壁厚；菌絲有隔，中部產(chǎn)孢或頂端的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)產(chǎn)孢（圖2，圖3）。

A. 整株軟腐病癥狀; B. 莖稈軟腐癥狀; C. 球莖軟腐早期癥狀; D. 球莖、莖稈基部軟腐晚期癥狀。

2.2 球莖軟腐真菌分子生物學(xué)鑒定

由表2和圖4可知，除M5菌株的ITS序列與輪紋鐮刀菌模式菌株的相似度為96.89%以外，M1、M3、M4、M6、M8、M9、M11、M14和M25的ITS和LSU序列與輪紋鐮刀菌模式菌株的相似度均大于97.77%（表1）。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，M1、M3、M4、M6、M8、M9、M11、M14和M25與輪紋鐮刀菌的進(jìn)化地位接近，并且系統(tǒng)發(fā)育分析顯示在同一進(jìn)化分支的支持度為72%，可認(rèn)為它們是同一物種。M10和M15與Fusarium ambrosium的進(jìn)化地位接近，支持度為80%且與模式株F. ambrosium的ITS和LSU兩段序列相似性在97.82%以上，可認(rèn)為它們是同一物種。M7與尖孢鐮刀菌的進(jìn)化地位接近，支持度為99%且序列相似度為98.95%，可它們認(rèn)為是同一物種。M12、M19和M22的ITS和LSU序列與粉紅螺旋聚孢霉（Clonostachys rosea f. catenulata）模式菌株的相似度大于99%且支持度為84%，可認(rèn)為它們是同一物種。M17的ITS和LSU序列與拜尼爾毛霉（Mucor bainieri）模式菌株的相似度分別是97.22%和99.23%且支持度為100%，可認(rèn)為它們是同一物種；M21的ITS和LSU基因序列與拜尼爾毛霉菌株的相似度分別是91.39%和99.20%且支持度為100%，因此M21應(yīng)該是毛霉屬真菌。M18和M23的ITS和LSU基因序列與單孢根霉（Rhizopus azygosporus）的模式菌株相似度大于98%且支持度為97%，可認(rèn)為M18和M23與單孢根霉是同一菌種；M20的ITS和LSU基因序列與單孢根霉菌株的相似度分別是98.89%和85.85%且支持率為100%，可認(rèn)為M20是根霉屬真菌。M24在NCBI數(shù)據(jù)庫中的ITS和LSU基因序列與氯氮卓青霉（Penicillium solitum）菌株的相似度是91.80%且支持率為96%，可認(rèn)為M24是青霉屬真菌（Penicillium sp.）。

綜上所述，結(jié)合形態(tài)鑒定結(jié)果共鑒定出輪紋鐮刀菌、尖孢鐮刀菌和Fusarium ambrosium 3種，占總分離真菌種類的43.86%；毛霉屬真菌拜尼爾毛霉、單孢根霉、青霉屬真菌（Penicillium sp.）和粉紅螺旋聚孢霉各1種，各占總分離真菌種類的14.29%。

根據(jù)鑒定結(jié)果，對不同種類菌株進(jìn)行了分離頻率的統(tǒng)計。從魔芋軟腐病株中分離得到的輪紋鐮刀菌出現(xiàn)的頻率最高，其相對豐度為45.45%；菌株粉紅螺旋聚孢霉和單孢根霉出現(xiàn)的頻率較高，其相對豐度為13.64%；菌株Fusarium ambrosium和拜尼爾毛霉出現(xiàn)的頻率較低，其相對豐度為9.09%；菌株尖孢鐮刀菌和氯氮卓青霉出現(xiàn)的頻率最低，其相對豐度為4.55%，由此可以推斷，輪紋鐮刀菌是魔芋軟腐病致病菌的概率最大（表3）。

2.3 柯赫氏法則檢測

將鑒定出的7個菌株直徑0.5 cm的菌餅接種在健康的魔芋球莖切片上，28℃保濕培養(yǎng)3 d后，接種輪紋鐮刀菌菌餅的球莖切片可以聞到明顯的臭味，并且接菌處附近均出現(xiàn)了明顯的發(fā)黑軟腐癥狀且面積不斷擴(kuò)大，此現(xiàn)象與魔芋軟腐病的發(fā)病癥狀相同，而空白對照處無發(fā)病的癥狀。從接種發(fā)病的魔芋球莖上又可以重新分離到接種菌株，因此可以確定該菌株可能是魔芋軟腐病的致病真菌（圖5）。同時接種輪紋鐮刀菌和胡蘿卜果膠桿菌（F+P）處理軟腐組織重量顯著高于單接種處理（F和P）處理，說明在野外環(huán)境中魔芋軟腐病可能是由真菌和細(xì)菌復(fù)合侵染引起的；病原細(xì)菌胡蘿卜果膠桿菌在相同條件下致病性高于輪紋鐮刀菌（圖6）。

3 討論與結(jié)論

植物病害病原種類的確定，對于防治植物病害起著關(guān)鍵性作用。本研究對花魔芋病樣球莖進(jìn)行分離、純化，獲得22株真菌，根據(jù)形態(tài)特征結(jié)合分子生物學(xué)手段，共鑒定出7種真菌，其中鐮刀菌有輪紋鐮刀菌、尖孢鐮刀菌和F. ambrosium 3種，毛霉屬真菌、根霉屬真菌單孢根霉、青霉屬真菌（Penicillium sp.）和粉紅螺旋聚孢霉各1種。根據(jù)柯赫氏法則檢測本研究發(fā)現(xiàn)輪紋鐮刀菌具有致病性，推斷輪紋鐮刀菌可能是云南曲靖市地區(qū)魔芋軟腐病原真菌。據(jù)報道輪紋鐮刀菌也是辣椒（Capsicum annuum）果實(shí)軟腐?。╓ang et al.，2013）、玉米（Zea mays）穗腐病（Du et al.，2020）、羅漢松（Podocarpus macrophyllus）萎蔫?。≦in et al.，2021）和玫瑰茄（Hibiscus sabdariffa）果斑?。≧ahim et al.，2020）的病原真菌。云南地區(qū)魔芋大田規(guī)?；耘嗤c玉米套種，這可能會增加魔芋真菌性軟腐病和玉米穗腐病的風(fēng)險。何斐等M1、M3～M12、M14、M15、M17～M25為分離菌株編號。下同。

（2016）在魔芋根際分離出尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌兩種鐮刀菌，通過回接毒素粗提液，發(fā)現(xiàn)可以引發(fā)魔芋球莖腐爛。李迎賓等（2017）也報道了從具有魔芋軟腐癥狀的球莖分離出了尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌兩種鐮刀菌，致病性檢測發(fā)現(xiàn)尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌都能引起花魔芋發(fā)病，但尖孢鐮刀菌不能引起珠芽黃魔芋發(fā)病。趙興麗等（2022）也從魔芋莖腐病病樣分離鑒定出尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌兩種鐮刀菌，但致病性檢測發(fā)現(xiàn)尖孢鐮刀菌（菌株xymy-8）無致病性，腐皮鐮刀菌（菌株xymy-7、xymy-9）有致病性，但致病性有差異。本研究也分離出了尖孢鐮刀菌，但致病性檢測發(fā)現(xiàn)其致病性弱于輪紋鐮刀菌。不同研究中，這些鐮刀菌對魔芋的致病性存在差異，可能與菌株間毒力差異和魔芋種植地域差異有關(guān)。

此外，本研究利用病原細(xì)菌胡蘿卜果膠桿菌和致病真菌輪紋鐮刀菌進(jìn)行了雙接種魔芋球莖試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)胡蘿卜果膠桿菌和輪紋鐮刀菌雙接種處理的軟腐組織重量顯著高于單接種處理，說明魔芋軟腐病細(xì)菌病原菌和真菌同時侵染會加快魔芋組織軟腐化速率。因此，我們推測魔芋軟腐病可能是一種真菌、細(xì)菌復(fù)合侵染病害。病原細(xì)菌不像病原真菌能夠形成附著胞等結(jié)構(gòu)主動侵入宿主，病原細(xì)菌侵染通常需要侵染孔口，并在侵染處達(dá)到一定的數(shù)量才能導(dǎo)致宿主發(fā)?。钫涞?， 2019）。Wu 等（2021）研究魔芋軟腐病侵染路徑發(fā)現(xiàn)，軟腐病病原細(xì)菌不能直接侵染完好球莖或從天然孔口侵入魔芋，而是通過傷口或根、鱗芽等組織的生長部位侵入魔芋。黃露等（2014）利用熒光蛋白標(biāo)記病原細(xì)菌探究了不同接種（針刺、涂抹和灌根）方法對魔芋組培苗的侵染特性，也發(fā)現(xiàn)病原菌不能從自然孔口和根部侵染魔芋植株，主要是通過傷口侵染致病。田間魔芋軟腐病能夠短期大量傳播爆發(fā)，一方面可能因田間病原菌累積而導(dǎo)致雨水沖刷蔓延（張紅驥等， 2012）；另一方面可能因?yàn)檎婢秩緜谠谧匀粻顟B(tài)下為病原細(xì)菌的侵染提供了侵染通道，從而導(dǎo)致軟腐病的快速發(fā)病。本研究還在魔芋軟腐病狀組織病健交界處分離出了毛霉、根霉和青霉等腐生真菌，這些真菌不能引起健康魔芋球莖發(fā)病，它們在軟腐病發(fā)病過程中具體有何作用，還有待進(jìn)一步研究。但是，這些腐生真菌可以加速軟腐組織的降解（Kavkler amp; Demar，2019），在其快速繁殖的過程也會分泌各種多糖降解酶類物質(zhì)（Lange et al.，2019），從而影響魔芋球莖健康部位，加快軟腐病的發(fā)病速度。此外，我們還從魔芋軟腐病狀組織病健交界處分離出了粉紅螺旋聚孢霉屬真菌，它是一種生防菌，能夠捕食真菌和線蟲（Seenivasagan amp; Babalola，2021），可能是因?yàn)槟в筌浉K組織處的次生侵染真菌和線蟲能夠?yàn)槠涮峁┦澄铩?/p>

盡管對魔芋軟腐病防治的研究相關(guān)報道較多（崔雙等，2021；代雪鳳等，2021；趙小明等，2021），但是效果顯著的防治方法并不多。本研究明確了魔芋球莖軟腐病組織的真菌群落類型，首次確定了輪紋鐮刀菌可以引起魔芋球莖軟腐，是致病真菌。病原細(xì)菌胡蘿卜果膠桿菌和輪紋鐮刀菌雙回接試驗(yàn)顯示魔芋軟腐病原細(xì)菌和真菌同時侵染會提高魔芋組織軟腐化速率，表明魔芋軟腐病可能是一種真菌和細(xì)菌復(fù)合侵染的病害。本研究明確了云南曲靖市花魔芋種植區(qū)軟腐病的病原真菌種類和病害特征，對于該病害的防控具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

參考文獻(xiàn)：

BEHERA SS， RAY RC， 2016. Konjac glucomannan， a promising polysaccharide of Amorphophallus konjac K. Koch in health care ［J］. Int J Biol Macromol， 92： 942-956.

CHADHA J， HARJAI K， CHHIBBER S， 2022. Revisiting the virulence hallmarks of Pseudomonas aeruginosa： a chronicle through the perspective of quorum sensing ［J］. Environ Microbiol， 24（6）： 2630-2656.

CHUA M， BALDWIN TC， HOCKING TJ， et al.， 2010. Traditional uses and potential health benefits of Amorphophallus konjac K. Koch ex N.E.Br ［J］. J Ethnopharmacol， 128（2）： 26-78.

CUI S， CHEN CL， FENG JH， et al.， 2021. Characterization of Pectobacterium aroidearum causing konjac soft rot and biocontrol effect of Bacillus velezensis ［J］. Chin Veget， （3）： 83-93." ［崔雙， 陳昌龍， 馮佳豪， 等， 2021. 魔芋軟腐病致病菌Pectobacterium aroidearum的特征及貝萊斯芽孢桿菌的生防效果 ［J］. 中國蔬菜， （3）： 83-93.］

DAI XF， ZHU L， ZHANG SL， et al.， 2021. Screening of antagonistic actinomycetes against Amorphophallus soft rot ［J］. J SW Univ （Nat Sci Ed）， 43（11）： 9-17." ［代雪鳳， 朱麗， 張盛林， 等， 2021. 魔芋軟腐病拮抗放線菌篩選 ［J］. 西南大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 43（11）： 9-17.］

DU Q， DUAN C， LI S， et al.， 2020. First report of maize ear rot caused by Fusarium concentricum in china ［J］. Plant Dis， 104（5）： 1539-1540.

GAO Y， ZHANG Y， CHEN F， et al.， 2022. A chromosome-level genome assembly of Amorphophallus konjac provides insights into konjac glucomannan biosynthesis ［J］. Comput Struct Biotechnol， 20： 1002-1011.

HE F， ZHANG ZL， CUI M， et al.， 2016. Identification and allelopathic effect of dominant fungi in rootzone of Amorphophallus konjac and screening of the bio-control actinomycetes ［J］. J NW A amp; F Univ （Nat Sci Ed）， 44（4）： 157-167." ［何斐， 張忠良， 崔鳴， 等， 2016. 魔芋根域優(yōu)勢真菌鑒定和化感作用及其生防放線菌的篩選 ［J］. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 44（4）： 157-167.］

HUANG L， LIU YX， REN XX， et al.， 2014. Isolation， identification and GFP maker of soft rot bacteria strains in Amorphophallus rivieri ［J］. Guizhou Agric Sci， 42（12）： 118-121." ［黃露， 劉永翔， 任秀秀， 等， 2014. 魔芋軟腐病菌的分離鑒定及其GFP標(biāo)記 ［J］. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)， 42（12）： 118-121.］

KAVKLER K， DEMAR A， 2012. Impact of fungi on contemporary and accelerated aged wool fibres ［J］. Polym Degrad Stabil， 97（5）： 786-792.

LANGE L， PILGAARD B， HERBST FA， et al.， 2019. Origin of fungal biomass degrading enzymes： Evolution， diversity and function of enzymes of early lineage fungi ［J］. Fungal Biol Rev， 33（1）： 82-97.

LI H， ZHU G， BOYCE PC， et al.， 2010. Flora of China ［M］. Beijing： Science Press： 23-33.

LI YB， BAO XK， WAN Q， et al.， 2017. Isolation and pathogenicity of konjac root rot pathogenic fungi ［C］//Proceedings of the Annual Meeting of Chinese Society for Plant Pathology. Shandong： Taian." ［李迎賓， 暴曉凱， 萬琪， 等， 2017. 魔芋塊根腐爛病原真菌的分離及其致病性研究 ［C］//中國植物病理學(xué)會2017年學(xué)術(shù)年會論文集. 山東： 泰安.］

QIN CD， JIANG Y， ZHANG R， et al.， 2021. First report of Fusarium concentricum causing shoot blight on Podocarpus macrophyllus in China ［J］. Plant Dis， 160（2）： 768.

QIU L， CHOU NX， 1995. Konjac Resource and Its Development and Utilization Value ［J］. Territ Nat Resour Study， 27（2）： 73-74." ［邱凌， 仇農(nóng)學(xué)， 1995. 魔芋資源及其開發(fā)利用價值 ［J］. 國土與自然資源研究， 27（2）： 73-74.］

RAHIM H， KAMARUDIN NS， MOHD MH， 2020. First report of Fusarium concentricum causing fruit blotch on roselle （Hibiscus sabdariffa） ［J］. Austral Plant Dis， 15： 15.

SEENIVASAGAN R， BABALOLA OO， 2021. Utilization of microbial consortia as biofertilizers and biopesticides for the production of feasible agricultural product ［J］. Biology， 10（11）： 1111.

SRZEDNICKI G， BOROMPICHAICHARTKUL C， 2020. Konjac glucomannan-production， processing， and functional applications ［M］. Boca Ration： CRC Press： 1-300.

SUN MM， 2019， Pathogen identification and rapid detection method development for soft rot of Amorphophallus konjac ［D］. Wuhan： Huazhong Agricultural University." ［孫苗苗， 2019. 魔芋軟腐病病原鑒定及快速檢測技術(shù)研究 ［D］. 武漢： 華中農(nóng)業(yè)大學(xué).］

VILGALYS R， HESTER M， 1990. Rapid genetic identification and mapping of enzymatically amplified ribosomal DNA from several Cryptococcus species ［J］. J Bacteriol， 172（8）： 4238-4246

WANG JH， FENG ZH， HAN Z， et al.， 2013. First report of pepper fruit rot caused by Fusarium concentricum in China ［J］. Plant Dis， 97（12）： 1657-1658.

WANG ZM， LIU RN， DANG DZ， et al.， 2021. Symptoms， influencing factors and control measures of konjac soft rot ［J］. NW Hortic， （2）： 47-48." ［王敏珍， 劉潤妮， 黨丹州， 等， 2021. 魔芋軟腐病癥狀、影響因素與防治措施 ［J］. 西北園藝（綜合），（2）： 47-48.］

WEI H， YANG M， PEI W， et al.， 2020. First report of Pectobacterium aroidearum causing soft rot of Amorphophallus konjac in China ［J］. Plant Dis， 104（3）： 969.

WEI JC， 1979. Fungal identification manual ［M］. Beijing： Science Press." ［魏景超， 1979. 真菌鑒定手冊 ［M］. 北京： 科學(xué)出版社.］

WHITE TJ， BRUNS TD， LEE SB， et al.， 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics ［M］//PCR Protocols. Pittsburgh： Academic Press： 315-322.

WU J， DIAO Y， GU Y， et al.， 2011. Molecular detection of Pectobacterium species causing soft rot of Amorphophallus konjac ［J］. World J Microb Biot， （27）： 613-618.

WU J， YANG C， JIAO Z， et al.， 2015. Genetic relationships of soft rot bacteria isolated from konjac in China by Amplified Fragment Length Polymorphism （AFLP） and 16S rDNA gene sequences ［J］. Agric Sci， 6： 717-723.

WU JP， DIAO Y， GU YC， et al.， 2021. Infection pathways of soft rot pathogens on Amorphophallus konjac ［J］. Afr J Microbiol R， 4（14）： 1495-1499.

XU W， 2011. Isolation and identification of the soft rot and Sclerotium rolfsii of konjac and study of biological control in Langao County ［D］. Yangling： Northwest A amp; F University." ［徐煒， 2011. 嵐皋縣魔芋軟腐病和白絹病病原菌的分離鑒定和生物防控初探 ［D］. 楊凌： 西北農(nóng)林科技大學(xué).］

YANG Z， DAI CC， WANG XX， et al.， 2019. Advance in research on rhizosphere microbial mechanisms of crop soil-borne fungal diseases ［J］. Acta Pedol Sin， 56（1）： 12-22." ［楊珍， 戴傳超， 王興祥， 等， 2019. 作物土傳真菌病害發(fā)生的根際微生物機(jī)制研究進(jìn)展 ［J］. 土壤學(xué)報， 56（1）： 12-22.］

ZHAO XM， LI ZY， CUI M， et al.， 2021. Preliminary study on soft rot control technology of konjac in Ankang ［J］. Acta Agric Boreal-Occident Sin， 30（8）： 1263-1270." ［趙小明， 李增義， 崔鳴， 等， 2021. 安康魔芋軟腐病防治技術(shù)初步研究 ［J］. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報， 30（8）： 1263-1270.］

ZHANG HJ， SHAO M， DU P， et al.， 2012. Effects of diversity cultivation of konjac and maize in controlling konjac’s soft rot disease in Yunnan Province， Southwest China ［J］. Chin J Ecol， 31（2）： 332-336." ［張紅驥， 邵梅， 杜鵬， 等， 2012. 云南省魔芋與玉米多樣性栽培控制魔芋軟腐病 ［J］. 生態(tài)學(xué)雜志， 31（2）： 332-336.］

ZHANG YA， CHU HL， YU LQ， et al.， 2022. Analysis of the taxonomy， synteny， and virulence factors for soft rot pathogen Pectobacterium aroidearum" in Amorphophallus konjac using comparative genomics ［J］. Front Microbiol， 12： 679102.

ZHANG YQ， XIE BJ， GAN X， 2005. Advance in the applications of konjac glucomannan and its derivatives ［J］. Carbohyd Polym， 60： 27-31.

ZHAO XL， HE SL， LIU SR， et al.， 2022. Isolation and identification of three strains of pathogen causing konjac stem rot and studies on pathogenicity ［J］. Chin Veget， （6）： 56-63." ［趙興麗， 賀圣凌， 劉思睿， 等， 2022. 3株魔芋莖腐病病原菌的分離鑒定與致病性研究 ［J］. 中國蔬菜， （6）： 56-63.］

ZHU F， 2018. Modifications of konjac glucomannan for diverse applications ［J］. Food Chem， 256（Aug. 1）： 419-426.

（責(zé)任編輯 李 莉）