小黃花茶內(nèi)生真菌的多樣性分析及抑菌活性初篩

摘 要：為探究小黃花茶內(nèi)生真菌種類和種群分布規(guī)律以及對(duì)植物病原真菌的抑制作用，該研究采用組織分離法對(duì)小黃花茶內(nèi)生真菌進(jìn)行分離純化，基于形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)進(jìn)行鑒定并結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析評(píng)價(jià)其多樣性，再通過(guò)平板對(duì)峙法篩選出具有抑菌活性的菌株。結(jié)果表明：（1）從小黃花茶324份組織塊中分離得到內(nèi)生真菌261株，隸屬1門(mén)5綱9目22屬，其中優(yōu)勢(shì)屬包括炭疽菌屬（Colletotrichum）、間座殼屬（Diaporthe）、擬盤(pán)多毛孢屬（Pestalotiopsis），分離頻率分別為21.84%、16.86%、10.34%。（2）研究發(fā)現(xiàn)小黃花茶內(nèi)生真菌在不同季節(jié)分布不同，冬季分離出的菌株數(shù)量最多，為72株（占27.59%，隸屬16個(gè)屬），春季62株（隸屬13個(gè)屬），夏季59株（隸屬15個(gè)屬），秋季68株（隸屬13個(gè)屬），冬季的香農(nóng)-維納指數(shù)（H′）、辛普森指數(shù)（D）、Pielous均勻度指數(shù)（E）和Margalefs豐富度指數(shù)（M）最高，春季與冬季內(nèi)生真菌種類相似性較高，夏季與秋季內(nèi)生真菌種類相似性較高。（3）小黃花茶內(nèi)生真菌不同部位分布不同，莖中內(nèi)生真菌的分布最多，有102株（占39.08%，隸屬15個(gè)屬），根61株（隸屬10個(gè)屬），葉98株（隸屬15個(gè)屬）；莖的H′、D、E、M最高，葉部與莖部?jī)?nèi)生真菌種類最為相似。（4）平板對(duì)峙結(jié)果顯示，在35株供試內(nèi)生真菌中，有26株內(nèi)生真菌至少對(duì)1種植物病原真菌有抑制作用，占74.29%，其中CJ-Ⅱ-2、XY-V-3、QY-Ⅱ-4、QJ-Ⅲ-2、DJ-I-2對(duì)8種植物病原真菌均有不同程度的抑制作用，XY-V-3對(duì)8種植物病原真菌的抑制效果最佳，抑菌率均高于50%，XY-V-3和QJ-Ⅲ-2對(duì)2株小黃花茶病原真菌的抑菌率高于50%，具備防治小黃花茶自身病害的潛力。綜上所述，小黃花茶內(nèi)生真菌多樣性豐富，部分菌株表現(xiàn)出較好的抑制植物病原真菌的作用，為生物防治產(chǎn)品的研發(fā)和小黃花茶病害的防治奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：小黃花茶，內(nèi)生真菌，分離鑒定，多樣性，抑菌活性

中圖分類號(hào)：Q945.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1000-3142（2024）02-0382-14

基金項(xiàng)目：四川省科技計(jì)劃項(xiàng)目（川林規(guī)函 ［2021］959號(hào)-002）。

第一作者：易航（1998-），碩士研究生，主要從事野生動(dòng)植物資源的保護(hù)、開(kāi)發(fā)和利用研究，（E-mail）302925146@qq.com。

^*通信作者：王麗，教授，主要從事植物的起源和進(jìn)化、細(xì)胞遺傳、引種馴化等研究，（E-mail）yzxj@vip.163.com。

Diversity analysis of endophytic fungi and preliminary screening of antibacterial activity in Camellia luteoflora

YI Hang， HE Jing， YANG Xi， RONG Shutian， WANG Li^*

（ College of Life Sciences， Sichuan University， Chengdu 610065， China ）

Abstract： In order to explore the species and population distribution of endophytic fungi in Camellia luteoflora， as well as their inhibitory effects on plant pathogenic fungi， this study used tissue separation method to isolate and purify endophytic fungi in C. luteoflora. These fungi were identified based on morphology and molecular biology， and their diversity was evaluated through statistical analysis. The strains with antibacterial activity were screened out by the plate confrontation method. The results were as follows： （1） A total of 261 strains of endophytic fungi were isolated from 324 C. luteoflora tissue samples， belonging to 1 phylum， 5 classes， 9 orders， and 22 genera. The dominant genera were Colletotrichum， Diaporthe and Pestalotiopsis with isolation frequencies of 21.84%， 16.86% and 10.34%， respectively. （2） The distribution of endophytic fungi in C. luteoflora varied in different seasons. The highest number of strains was isolated in winter （72 strains， accounting for 27.59%， belonging to 16 genera）， 62 strains were isolated in spring （belonging to 13 genera）， 59 strains were isolated in summer （belonging to 15 genera）， and 68 strains were isolated in autumn （belonging to 13 genera）. The Shannon-Wiener index （H′）， Simpson index （D）， Pielous evenness index （E）， and Margalefs richness index （M） were the highest in winter. The similarity of endophytic fungal species between spring and winter was higher， and the similarity between summer and autumn was higher. （3） The distribution of endophytic fungi also varied in different parts of C. luteoflora. The stems had the most abundant endophytic fungi， with 102 strains accounting for 39.08% （belonging to 15 genera）， 61 strains were isolated from the roots （belonging to 10 genera）， and 98 strains were isolated from the leaves （belonging to 15 genera）. The H′， D， E， and M were highest in the stems， and the endophytic fungal species in the leaves were most similar to those in the stems. （4） The plate confrontation results showed that among the 35 tested endophytic fungi， 26 endophytic fungi had inhibitory effects on at least one plant pathogenic fungi， accounting for 74.29%， among which CJ-Ⅱ-2， XY-V-3， QY-Ⅱ-4， QJ-Ⅲ-2 and DJ-I-2 had inhibitory effects on eight plant pathogen fungi to varying degrees. XY-V-3 had the best inhibitory effect on eight plant pathogenic fungi， and the inhibitory rate was higher than 50%. XY-V-3 and QJ-Ⅲ-2 have higher inhibitory rate than 50% on two strains of pathogenic fungi in C. luteoflora， which had the potential to control disease of C. luteoflora. To sum up， the diversity of endophytic fungi in C. luteoflora is rich， and some of the strains have higher effect of inhibiting plant pathogenic fungi， which lay a foundation for the research and development of biological control products and the disease control of C. luteoflora.

Key words： Camellia luteoflora， endophytic fungi， separation and identification， diversity， antibacterial activity

植物內(nèi)生真菌是指生活史中的某一階段或整個(gè)階段，寄生在健康植物組織內(nèi)部，但不會(huì)使宿主植物出現(xiàn)明顯病害癥狀的微生物（Zhao et al.， 2011）。內(nèi)生真菌與宿主植物形成互惠共生體，植物為內(nèi)生真菌提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和棲息場(chǎng)所，內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)和促生性物質(zhì)，保護(hù)宿主植物抵御病蟲(chóng)害，促進(jìn)宿主植物的生長(zhǎng)，兩者協(xié)同進(jìn)化，相互作用（Martina et al.， 2014）。研究發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)生真菌種類繁多，分布廣泛，其多樣性體現(xiàn)在同一地區(qū)內(nèi)同種植物在不同年齡段、不同部位以及所處的季節(jié)不同，分離得到的內(nèi)生真菌種類和數(shù)量都不同。例如，王京等（2017）發(fā)現(xiàn)不同年齡段的側(cè)柏（Platycladus orientalis）鱗葉內(nèi)生真菌的多樣性和相似性存在一定差異；李夢(mèng)歌等（2018）發(fā)現(xiàn)陜西宜君核桃（Juglans regia）不同季節(jié)和不同組織部位其內(nèi)生真菌多樣性和相似性均不同。除此之外，不同地區(qū)的同種植物分離得到的內(nèi)生真菌種類和數(shù)量也不相同，如周婀等（2023）統(tǒng)計(jì)分析了紅河谷和蒿坪兩地野生桃兒七（Sinopodophyllum hexandrum）內(nèi)生真菌的多樣性，發(fā)現(xiàn)蒿坪野生桃兒七內(nèi)生真菌多樣性要高于紅河谷。因此，根據(jù)當(dāng)?shù)刂参锷L(zhǎng)特點(diǎn)分析其內(nèi)生真菌的多樣性，篩選出優(yōu)勢(shì)菌株和特有菌株，是挖掘具有生防作用和其他功能性作用菌株的基礎(chǔ)。內(nèi)生真菌既可以產(chǎn)生抗病原真菌的次生代謝產(chǎn)物，如萜類、生物堿、黃酮等（Aly et al.， 2010），也能通過(guò)搶占生態(tài)位點(diǎn)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等競(jìng)爭(zhēng)方式，抑制病原真菌的生長(zhǎng)（宋金秋和田璨熙，2020）。同時(shí)，利用植物內(nèi)生菌進(jìn)行生物防治，具有無(wú)污染、無(wú)耐藥性、安全可持續(xù)的優(yōu)點(diǎn)。

小黃花茶（Camellia luteoflora），我國(guó)特有珍稀植物，隸屬山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia），目前主要分布在貴州赤水市、四川古藺縣、長(zhǎng)寧縣等地區(qū)（楊雪，2014；陳鋒和王馨，2016）。小黃花茶花色金黃，葉片寬厚，因其性狀獨(dú)特，具有較高的觀賞價(jià)值，在園林綠化、盆栽、鮮切花領(lǐng)域都有不錯(cuò)的發(fā)展前景（鄒天才，2000）。然而，小黃花茶病害嚴(yán)重，油茶餅病和鬼帚病是危害其植株健康的主要病害，對(duì)其經(jīng)濟(jì)和觀賞價(jià)值造成了嚴(yán)重影響（劉清炳等，2005）。目前，針對(duì)小黃花茶病害的防治并沒(méi)有得到深入的研究，如何安全有效地防治小黃花茶的病害，同時(shí)對(duì)其生境不造成破壞，是目前亟須解決的問(wèn)題。小黃花茶作為瀕危植物，對(duì)其內(nèi)生真菌的多樣性和抑菌活性進(jìn)行研究，一方面能夠回答其內(nèi)生真菌由哪些種類組成，不同組織部位和不同季節(jié)的內(nèi)生真菌的分布及多樣性如何，哪些內(nèi)生真菌屬于優(yōu)勢(shì)菌株。加強(qiáng)對(duì)小黃花茶內(nèi)生真菌資源的了解，為其內(nèi)生真菌資源的開(kāi)發(fā)做鋪墊。另一方面，由于小黃花茶數(shù)量稀少，其病害的防治顯得尤為重要，通過(guò)抑菌試驗(yàn)篩選出具有生防潛力的菌株，不僅能夠?yàn)樾↑S花茶的病害防治開(kāi)辟一條新的路徑，同時(shí)還能緩解因化學(xué)防治對(duì)小黃花茶生境造成的影響。

因此，本研究以小黃花茶為對(duì)象，采用組織分離法和分子生物學(xué)等方法，對(duì)小黃花茶內(nèi)生真菌進(jìn)行分離鑒定，分析其內(nèi)生真菌的多樣性，篩選出優(yōu)勢(shì)菌株和特有菌株，并通過(guò)小黃花茶內(nèi)生真菌對(duì)植物病原真菌抑制作用的探究，篩選出具有廣譜抑菌活性的菌株，為小黃花茶病害的防治以及小黃花茶內(nèi)生真菌資源的進(jìn)一步利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試植物 小黃花茶樣品于春（2021年4月）、夏（2021年7月）、秋（2021年10月）、冬（2022年1月）4個(gè)季節(jié)采自四川省古藺縣桂花鄉(xiāng)漢溪村（海拔901 m，105°41′17″ E、28°10′52″ N），隨機(jī)選擇5株健康的小黃花茶，每株采集其根、枝條、葉片各3份，裝入無(wú)菌樣品袋放入冰盒，帶回實(shí)驗(yàn)室后于4℃環(huán)境保存。

1.1.2 供試病原菌 8種供試植物病原真菌分別為茶葉輪斑菌（Pestalotiopsis theae）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、串珠鐮刀菌（F. moniliforme）、草莓炭疽菌（Colletotrichum fragariae）、油菜菌核菌（Sclerotiua sclerotiorum）、西瓜枯萎菌（Fusarium oxysporum f. sp. niveum）、小黃花茶致病菌（Colletotrichum cliviicola、Alternaria alternata），由四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 主要儀器 立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX-50KBS，上海）、全溫振蕩器（HZQ-QX，哈爾濱）、智能生化培養(yǎng)箱（SPX，寧波）、電熱恒溫水浴鍋（HSG-IC-2，浙江）、臺(tái)式高速離心機(jī)（H1650-W，湖南）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-5522，上海）。

1.1.4 主要試劑 無(wú)水乙醇、次氯酸鈉溶液、乳酸酚棉藍(lán)染色劑、馬鈴薯葡萄糖水（PDW）、真菌基因組DNA快速抽提試劑盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］、Taq PCR Mix預(yù)混液（2X含藍(lán)染料）、通用引物ITS1、ITS4［生工生物工程（上海）股份有限公司］、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基（solarbio，美國(guó)）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小黃花茶內(nèi)生真菌的分離與純化 首先，將小黃花茶根、莖、葉洗凈后，進(jìn)行表面消毒，將消毒后的組織切段，斜插入PDA培養(yǎng)基中，28℃恒溫暗培養(yǎng)。然后，待菌落長(zhǎng)出后，挑取菌落邊緣形態(tài)質(zhì)地不同的菌絲于新的PDA培養(yǎng)基單獨(dú)培養(yǎng)，反復(fù)操作2～3次，直至得到單一菌落，編號(hào)后拍照記錄菌落特征。最后，將菌絲接入PDA斜面，28℃培養(yǎng)一段時(shí)間后置于4℃保存。

表面消毒效果的檢測(cè)：把最后一遍清洗液涂布在PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7 d后未發(fā)現(xiàn)有菌落長(zhǎng)出，說(shuō)明表明消毒徹底，分離得到的菌株全部來(lái)自植株內(nèi)部，屬內(nèi)生真菌。

1.2.2 小黃花茶內(nèi)生真菌的鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 定期觀察PDA培養(yǎng)基上的菌落生長(zhǎng)狀況和形態(tài)特征，包括形狀、質(zhì)地、顏色、生長(zhǎng)速度等。菌落生長(zhǎng)初期，挑取菌落邊緣的菌絲孢子于載玻片上，用乳酸酚棉藍(lán)染色劑進(jìn)行染色，制成玻片后于光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)特征、是否產(chǎn)孢、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的形態(tài)特征、產(chǎn)孢方式及孢子形態(tài)、大小、顏色等。根據(jù)觀察結(jié)果，參照《真菌鑒定手冊(cè)》（魏景超，1979）和Illustrated genera of imperfect fungi（Barnett ＆ Hunter， 1998），結(jié)合張永杰等（2010）的方法進(jìn)行鑒定。將鑒定后的內(nèi)生真菌進(jìn)行編號(hào)，前兩位表示季節(jié)和部位的首字母縮寫(xiě)，中間的羅馬數(shù)字表示所采植物的編號(hào)，最后一位數(shù)字表示所屬組織塊的編號(hào)。

1.2.2.2 分子生物學(xué)鑒定 內(nèi)生真菌DNA用真菌基因組DNA快速抽提試劑盒進(jìn)行提取，于-20℃保存。采用通用引物ITS1 （5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對(duì)提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，條帶明亮清晰的產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 小黃花茶內(nèi)生真菌的系統(tǒng)進(jìn)化分析 測(cè)序后的內(nèi)生真菌ITS序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對(duì)分析，在MEGA 11軟件中使用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，重復(fù)計(jì)算1 000次，確定真菌的分類地位（Kumar et al.， 2016）。

1.2.4 小黃花茶內(nèi)生真菌的多樣性分析 分別統(tǒng)計(jì)小黃花茶內(nèi)生真菌的定殖率（colonization rate，CR）、分離率（isolation rate，IR）、分離頻率（isolation frequency，IF）、辛普森指數(shù)（Simpsons diversity，D）、香農(nóng)-維納指數(shù)（Shannon-Weiner diversity index，H′）、Pielous均勻度指數(shù)（Pielous evenness index，E）、Margalefs豐富度指數(shù)（Margalefs richness index，M），并基于小黃花茶內(nèi)生真菌的種類組成，使用SPSS 24.0軟件對(duì)不同季節(jié)和部位的內(nèi)生真菌進(jìn)行聚類分析。通過(guò)以上數(shù)據(jù)分析小黃花茶內(nèi)生真菌的多樣性、優(yōu)勢(shì)種群、分布的均勻程度、豐富度，以及不同季節(jié)和部位間的相似水平。

定殖率（CR）：長(zhǎng)真菌的組織塊數(shù)量與分離的組織塊總數(shù)的比值，反映植物受真菌浸染的程度。

分離率（IR）：某一類菌株的數(shù)量與分離的組織塊總數(shù)的比值，用于度量組織中真菌的豐度以及組織塊受浸染的頻率。

分離頻率（IF）：某一類菌株的數(shù)量與分離得到的菌株總數(shù)的比值，反映不同種類內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)程度。

辛普森指數(shù)（D）：反映群落中物種的優(yōu)勢(shì)度或多樣性。

香農(nóng)-維納指數(shù)（H′）：反映群落種類的多樣性。

Margalef’s豐富度指數(shù)（M）：反映群落中物種的豐富度。

Pielou’s均勻度指數(shù)（E）：反映物種在群落中分布的均勻程度。

以上式中：N_i表示不同季節(jié)或部位內(nèi)生真菌i的數(shù)量；N為菌株總數(shù)；S為物種數(shù)。

1.2.5 小黃花茶內(nèi)生真菌抑菌作用 采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法測(cè)定小黃花茶內(nèi)生真菌的抑菌活性，用直徑為6 mm的打孔器將35株供試內(nèi)生真菌和8株病原菌菌株打菌餅，再將8株病原菌菌餅與35株內(nèi)生真菌菌餅一一對(duì)應(yīng)，接種至同一PDA培養(yǎng)基的對(duì)稱位置，每個(gè)處理重復(fù)3次，以單獨(dú)接種病原菌的PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照，28℃暗培養(yǎng)7 d。之后用十字交叉法測(cè)量病原菌對(duì)峙培養(yǎng)的趨向半徑（r）和單獨(dú)培養(yǎng)的半徑（R），計(jì)算抑菌率并篩選出具有抑菌性的內(nèi)生真菌。

分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：抑菌率＞75%為強(qiáng)，50%～75%為中，10%～50%為低，＜10%為無(wú)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小黃花茶內(nèi)生真菌的分離

從小黃花茶324份組織塊中分離得到內(nèi)生真菌261株，由表1可知，小黃花茶內(nèi)生真菌的總定殖率和總分離率分別為71.30%和80.55%。從定殖率來(lái)看，不同部位內(nèi)生真菌定殖率不同，最高的部位為莖（88.89%），其次為葉（81.48%），根最低（43.52%）；不同季節(jié)定殖率也不同，冬季最高（75.31%），秋季第二（72.84%），其次為春季（69.14%），夏季最低（67.90%）。分離率從高到低依次為莖（94.44%）gt;葉（90.74%）gt;根（56.48%），冬（88.89%）gt;秋（83.95%）gt;春（76.54%）gt;夏（72.83%）。分離頻率莖最高，占39.08%；葉其次，占37.55%；根最低，占23.37%。按季節(jié)從高到低依次為冬（27.59%）gt;秋（26.05%）gt;春（23.75%）gt;夏（22.61%）。

2.2 小黃花茶內(nèi)生真菌的種群組成

將提取出的真菌基因組DNA以ITS1和ITS4為引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度為500～750 bp的擴(kuò)增片段；經(jīng)測(cè)序后將測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果利用MEGA 11軟件，取相似性大于99%的序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖1）；結(jié)合純化后菌落的顏色、形態(tài)、質(zhì)地以及顯微鏡下孢子和菌絲的形態(tài)，鑒定為35個(gè)種，隸屬1門(mén)5綱9目22屬（小黃花菜內(nèi)生真菌組成如表2所示，顯微形態(tài)圖和菌落圖如圖2和圖3所示）。

由表2可知，小黃花茶內(nèi)生真菌全部來(lái)自子囊菌門(mén)（Ascomycota）。以綱為單位劃分，其中糞殼菌綱（Sordariomycetes）為優(yōu)勢(shì)綱，共有內(nèi)生真菌197株，占總菌株數(shù)的75.48%；散囊菌綱（Eurotiomycetes）共有內(nèi)生真菌20株，占總菌株數(shù)的7.66%；座囊菌綱（Dothideomycetes）共有內(nèi)生真菌21株，占總菌株數(shù)的8.05%；錘舌菌綱（Leotiomycetes）共有內(nèi)生真菌20株，占總菌株數(shù)的7.66%；刺盾炱綱（Chaetothyriomycetes）共有內(nèi)生真菌3株，占總菌株數(shù)的1.15%。小黃花茶內(nèi)生真菌在目水平上的組成包括9個(gè)目，分別為炭角菌目（Xylariales）、肉座菌目（Hypocreales）、間座殼菌目（Diaporthales）、刺盤(pán)孢目（Glomerellales）、散囊菌目（Eurotiales）、煤炱目（Capnodiales）、格孢腔目（Pleosporales）、柔膜菌目（Helotiales）、刺盾炱目（Chaetothyriales）。其中，優(yōu)勢(shì)目為炭角菌目、刺盤(pán)孢目、間座殼菌目，分別占總菌株數(shù)的26.47%、21.84%、18.77%。小黃花茶內(nèi)生真菌在屬水平上的組成包括擬盤(pán)多毛孢屬（Pestalotiopsis）、炭團(tuán)菌屬（Hypoxylon）、Annulohypoxylon、炭角菌屬（Xylaria）、毛殼菌屬（Chaetomium）、多節(jié)孢屬（Nodulisporium）、色孢子節(jié)菱孢菌屬（Arthrinium）、鐮刀菌屬（Fusarium）、土赤殼屬（Ilyonectria）、間座殼屬（Diaporthe）、擬莖點(diǎn)霉屬（Phomopsis）、炭疽菌屬（Colletotrichum）、青霉屬（Penicillium）、隱囊菌屬（Aphanoascus）、背芽突霉屬（Cadophora）、葉點(diǎn)霉屬（Phyllosticta）、枝孢菌屬（Cladosporium）、Acrocalymma、柔盤(pán)菌屬（Hymenoscyphus）、柱霉屬（Scytalidium）、無(wú)柄盤(pán)菌屬（Pezicula）、 Herpotrichiellaceae共22個(gè)屬。其中，優(yōu)勢(shì)屬為炭疽菌屬、間座殼屬、擬盤(pán)多毛孢屬，分別占菌株總數(shù)的21.84%、16.86%、10.34%。

2.3 小黃花茶內(nèi)生真菌生態(tài)分布

2.3.1 不同季節(jié)內(nèi)生真菌分布 如圖4所示，春季分離出的內(nèi)生真菌包含13個(gè)屬，夏季包含15個(gè)屬，秋季包含13個(gè)屬，冬季包含16個(gè)屬。4個(gè)季節(jié)共有屬分別是隱囊菌屬、炭疽菌屬、間座殼屬、鐮刀菌屬、炭團(tuán)菌屬、炭角菌屬、擬盤(pán)多毛孢屬、無(wú)柄盤(pán)菌屬、葉點(diǎn)霉屬。僅于春季組織中分離到的屬有1個(gè)，為柔盤(pán)菌屬；僅于夏季組織中分離到的屬有3個(gè)，分別為柱霉屬、 Acrocalymma、 Herpotrichiellaceae；僅于秋季組織中分離到的屬為Annulohypoxylon；僅于冬季組織中分離到的屬有2個(gè)，分別為毛殼菌屬、色孢子節(jié)菱孢菌屬。春季分離出的特有菌株為Helotiales sp.和Diaporthe discoidispora；夏季分離出的特有菌株為Herpotrichiellaceae sp. 2 KO-2013、Scytalidium auriculariicola、Acrocalymma medicaginis；秋季分離出的特有菌株為Annulohypoxylon stygium和Colletotrichum camelliae；冬季分離出的特有菌株為Chaetomium subaffine、Arthrinium arundinis、Pestalotiopsis chamaeropis、P. microspora。春季和夏季的共有菌株有12種，春季和秋季的共有菌株有16種，春季和冬季的共有菌株有15種，夏季和秋季的共有菌株有11種，夏季和冬季的共有菌株有14種，秋季和冬季的共有菌株有14種。

2.3.2 不同部位內(nèi)生真菌分布 如圖4所示，莖部分離出的內(nèi)生真菌包含15個(gè)屬，葉部包含18個(gè)屬，根部包含10個(gè)屬。3個(gè)部位共有的屬分別是隱囊菌屬、炭疽菌屬、間座殼屬、炭團(tuán)菌屬、土赤殼屬、無(wú)柄盤(pán)菌屬、炭角菌屬。從根分離到的特有屬為柔盤(pán)菌屬和Herpotrichiellaceae；莖分離到的特有屬為Acrocalymma；葉分離到的特有屬為柱霉屬、Annulohypoxylon、毛殼菌屬、色孢子節(jié)菱孢菌屬。根分離出的特有菌株為Helotiales sp.和Herpotrichiellaceae sp. 2 KO-2013；莖分離出的特有菌株為Diaporthe discoidispora、Acrocalymma medicaginis、Colletotrichum pseudomajus；葉分離出的特有菌株為Scytalidium auriculariicola、Annulohypoxylon stygium、Chaetomium subaffine、Arthrinium arundinis。根和莖的共有菌株有10種，根和葉的共有菌株有8種，莖和葉的共有菌株有20種。

2.3.3 小黃花茶內(nèi)生真菌的多樣性分析 根據(jù)小黃花茶不同季節(jié)內(nèi)生真菌的多樣性指數(shù)結(jié)果（圖5）可知，D從高到低的順序?yàn)槎?.944）gt;春（0.929）gt;秋（0.926）gt;夏（0.919）；H′為冬（3.027）gt;春（2.820）gt;秋（2.813）gt;夏（2.670）；M為冬（3.728）gt;春（3.359）gt;秋（3.285）gt;夏（2.890）；E為冬（0.952）gt;春（0.926）gt;夏（0.923）gt;秋（0.906）。根據(jù)小黃花茶不同部位內(nèi)生真菌的多樣性指數(shù)結(jié)果（圖5）可知，D從高到低的順序?yàn)榍o（0.947）gt;葉（0.936）gt;根（0.887）；H′為莖（3.116）gt;葉（2.958）gt;根（2.337）；M為莖（3.897）gt;葉（3.628）gt;根（2.023）；E為莖（0.945）gt;葉（0.919）gt;根（0.911）。小黃花茶內(nèi)生真菌不同季節(jié)間，冬季種群數(shù)量最豐富且均勻程度高；不同部位間莖部種群數(shù)量最豐富且均勻程度高，根部?jī)?nèi)生真菌菌群?jiǎn)我磺曳€(wěn)定性弱。

2.3.4 小黃花茶內(nèi)生真菌相似性分析結(jié)果 基于小黃花茶內(nèi)生真菌種類組成，以歐式平方距離為標(biāo)準(zhǔn)，采用組間連接法進(jìn)行聚類分析，衡量不同季節(jié)和部位間小黃花茶內(nèi)生真菌組成的相似性。由圖6可知，J、Y、G分別代表莖、葉、根，C、D、X、Q分別代表春、冬、夏、秋，其中J、Y、G集聚為一類，C、D、X、Q聚集為一類，顯示為部位和季節(jié)兩大類別，這兩大類別小黃花茶內(nèi)生真菌組成差異明顯。在部位類別中，莖部和葉部的內(nèi)生真菌組成相似性最高，根部和這兩個(gè)部位內(nèi)生真菌組成差異明顯；在季節(jié)類別中，春季和冬季內(nèi)生真菌組成相似性較高，夏季和秋季內(nèi)生真菌組成相似性較高，春冬兩季和夏秋兩季內(nèi)生真菌組成差異明顯。

2.4 小黃花茶內(nèi)生真菌抑菌作用結(jié)果

平板對(duì)峙結(jié)果（表3）表明，在35株供試內(nèi)生真菌中，有26株內(nèi)生真菌至少對(duì)1種病原真菌有抑制作用，占74.29%。對(duì)茶葉輪斑菌、串珠鐮刀菌、草莓炭疽菌、尖孢鐮刀菌、西瓜枯萎菌、油菜菌核菌、Colletotrichum cliviicola、Alternaria alternata具有抑菌活性的菌株分別占總數(shù)的17.14%、25.71%、37.14%、25.71%、20.00%、34.29%、42.86%、25.71%。有5株內(nèi)生菌抑菌性較強(qiáng)且具有廣譜抑菌作用，分別為CJ-Ⅱ-2、XY-V-3、QY-Ⅱ-4、QJ-Ⅲ-2、DJ-I-2。其中，XY-V-3對(duì)8種病原真菌的抑菌率均高于50%，對(duì)草莓炭疽菌、西瓜枯萎菌、Alternaria alternata的抑制作用最強(qiáng)，抑菌率分別為76.31%、80.64%、77.49%；DJ-I-2對(duì)油菜菌核菌和草莓炭疽菌的抑制作用最強(qiáng)，抑菌率分別為82.16%和78.43%；QJ-Ⅲ-2對(duì)串珠鐮刀菌的抑制作用最強(qiáng)，抑菌率高達(dá)75.41%（圖7）。

3 討論與結(jié)論

本研究分4個(gè)季節(jié)從小黃花茶根、莖、葉3個(gè)部位分離得到內(nèi)生真菌261株，通過(guò)形態(tài)學(xué)特征、顯微觀察以及ITS序列分析鑒定為22個(gè)屬，其中優(yōu)勢(shì)屬為炭疽菌屬、間座殼屬和擬盤(pán)多毛孢屬，這一結(jié)果與山茶科山茶屬植物油茶（Camellia oleifera）內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)菌屬相似（張婷等，2017）。小黃花茶內(nèi)生真菌與同一緯度相鄰地區(qū)的貴州赤水桫欏保護(hù)區(qū)桫欏（Alsophila spinulosa）內(nèi)生真菌所共有的屬包括色孢子節(jié)菱孢菌屬、枝孢菌屬、炭疽菌屬、鐮刀菌屬、炭團(tuán)菌屬、擬盤(pán)多毛孢屬、擬莖點(diǎn)霉屬、炭角菌屬共8個(gè)屬（劉永蘭等，2021），而與采自自貢的茶樹(shù)（Camellia sinensis）的內(nèi)生真菌共有屬只有4個(gè)，即毛殼菌屬、炭疽菌屬、鐮刀菌屬、青霉屬（游見(jiàn)明，2009），由于地理位置相距較遠(yuǎn)，小黃花茶的內(nèi)生真菌和所處同一屬植物茶樹(shù)的內(nèi)生真菌組成差異較大，而與生長(zhǎng)環(huán)境相近的桫欏的內(nèi)生真菌組成更相似，說(shuō)明環(huán)境對(duì)于植物內(nèi)生真菌的組成具有較大的影響。小黃花茶分離出的35個(gè)菌株中，除Aphanoascus verrucosus （QY-Ⅱ-6）和Scytalidium auriculariicola（XY-V-3）外，有33株在其他植物內(nèi)生真菌中有分布。

小黃花茶內(nèi)生真菌總的定殖率和分離率分別為71.30%和80.55%，與同為南方地區(qū)的植物白花曼陀羅（Datura metel）和南方紅豆杉（Taxus wallichiana" var. mairei）的定殖率相近（臧威等，2014；馮美茹，2021），但略高于北方地區(qū)生長(zhǎng)的植物，可能與南方熱帶和亞熱帶地區(qū)降水量大，空氣濕度高，更適宜內(nèi)生真菌在植物體內(nèi)浸染定殖有關(guān)（Porras-Alfaro ＆ Bayman， 2011）。小黃花茶葉部和莖部?jī)?nèi)生真菌定殖率和分離率相似，高于根部，多樣性指數(shù)排序?yàn)榍o部＞葉部＞根部，說(shuō)明小黃花茶內(nèi)生真菌對(duì)小黃花茶組織部位具有一定的偏好性，可能是由于小黃花茶葉和莖的養(yǎng)分與空間更加充足，更適宜內(nèi)生真菌浸染定殖。小黃花茶不同季節(jié)中，秋冬季的內(nèi)生真菌定殖率和分離率大于春夏季，多樣性指數(shù)也是秋冬季大于春夏季，與貴州馬尾松（Pinus massoniana）（羅鑫和于存，2021）和貴州艾納香（Blumea balsamifera）（唐青等，2017）內(nèi)生真菌多樣性研究結(jié)果相近，小黃花茶耐陰喜濕，分布于四川古藺與貴州赤水接壤的地區(qū)，該地區(qū)秋季降雨量大，9—12月平均氣溫17℃（翁玲等，2010），同時(shí)秋冬季為小黃花茶的花果期（郭能彬等，2006），植物內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)積累和激素水平變化較大（孫紅梅等，2017），可能也是小黃花茶內(nèi)生真菌在秋冬季生長(zhǎng)更活躍的一個(gè)原因。小黃花茶內(nèi)生真菌聚類分析結(jié)果顯示，春季和冬季內(nèi)生真菌組成相似性較高，夏季和秋季內(nèi)生真菌組成相似性較高，春冬兩季和夏秋兩季內(nèi)生真菌組成差異明顯，植物內(nèi)部環(huán)境隨季節(jié)的變化而變化，間接影響植物內(nèi)生真菌的組成，這是植物內(nèi)生真菌隨季節(jié)環(huán)境不斷變化而長(zhǎng)期協(xié)調(diào)進(jìn)化的結(jié)果（張林平等，2013）。莖部和葉部的內(nèi)生真菌組成最相似，與根部的組成差異較大，這是由于植物不同組織器官之間的微環(huán)境不同，包括化學(xué)成分、空間大小和通氣狀況等，直接影響了植物不同組織器官內(nèi)生真菌的類群組成（Vesterlund et al.， 2011）。

平板對(duì)峙結(jié)果表明，有26株內(nèi)生真菌至少對(duì)1種植物病原真菌有抑制作用，有5株內(nèi)生真菌對(duì)8種植物病原菌均有不同程度的抑制作用，分別為Diaporthe phaseolorum（CJ-Ⅱ-2）、Scytalidium auriculariicola（XY-V-3）、Hypoxylon fragiforme（QJ-Ⅲ-2）、Fusarium graminearum（DJ-Ⅰ-2）和 Annulohypoxylon stygium （QY-Ⅱ-4）。Scytalidium auriculariicola（XY-V-3）對(duì)8株病原真菌均有較強(qiáng)的抑制作用，抑菌率均高于50%。Ahmad等（2020）發(fā)現(xiàn)柱霉屬真菌S. parasiticum能夠產(chǎn)生具有抗真菌活性的生物堿、黃酮類、脂肪酸等次生代謝產(chǎn)物。由此可推斷，柱霉屬真菌的次生代謝產(chǎn)物豐富多樣，在抑制其他真菌的生長(zhǎng)方面具有較強(qiáng)的作用。本研究表明Fusarium graminearum（DJ-Ⅰ-2）對(duì)油菜菌核菌和草莓炭疽菌的抑制作用較強(qiáng)，對(duì)油菜菌核菌的抑制率為82.16%。付潔等（2006）發(fā)現(xiàn)F. graminearum的次生代謝產(chǎn)物對(duì)油菜菌核菌有較強(qiáng)的抑制作用，與本研究的結(jié)果相近。Jin等（2022）發(fā)現(xiàn)，與Hypoxylon fragiforme同屬的山核桃（Carya cathayensis）內(nèi)生真菌Hypoxylon spp.的次生代謝產(chǎn)物能抑制3株植物病原真菌的生長(zhǎng)；Becker等（2020）發(fā)現(xiàn)，與Annulohypoxylon stygium同屬的真菌A. viridistratum的次生代謝產(chǎn)物對(duì)白色念珠菌（Candida albicans）和凍土毛霉菌（Mucor hiemalis）等真菌有較強(qiáng)的抑制作用。這說(shuō)明，Annulohypoxylon和炭團(tuán)菌屬真菌的次生代謝產(chǎn)物具備生物防治的潛力。因此，后續(xù)可進(jìn)一步對(duì)這5株內(nèi)生真菌的抑菌機(jī)理進(jìn)行研究，從而為其開(kāi)發(fā)利用以及小黃花茶病害的防治提供理論支撐。本研究的8株植物病原真菌中，Colletotrichum cliviicola和Alternaria alternata為小黃花茶的致病菌，Colletotrichum cliviicola能使小黃花茶葉片產(chǎn)生黃白色斑點(diǎn)，Alternaria alternata引起小黃花茶葉片發(fā)黑，出現(xiàn)黑色斑塊（代玉煊，2021）。Scytalidium auriculariicola和 Hypoxylon fragiforme對(duì)Colletotrichum cliviicola和Alternaria alternata的抑制率均高于50%，對(duì)小黃花茶自身病害的防治具有較好的作用，在小黃花茶生物防治的開(kāi)發(fā)上值得更深入的研究。

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（責(zé)任編輯 周翠鳴）