刺五加新品種‘紫加1號’多糖分離純化及抗氧化活性分析

摘 要：‘紫加1號’為該課題組選育的刺五加（Acanthopanax senticosus）新品種，嫩莖葉灰紫色且味甘。為分離純化‘紫加1號’嫩莖葉多糖，并測定各組分的單糖組成和分子量大小、評價各組分的抗氧化活性。該研究以‘紫加1號’嫩莖葉為材料，采用水提醇沉工藝，經(jīng)大孔樹脂吸附法除雜脫色得到粗多糖（A. polysaccharides，ASPS）；通過DEAE-Cellulose 52離子柱和Sephadex G-100凝膠柱分離純化得多糖組分；采用離子色譜和凝膠色譜-示差-多角度激光光散射色譜，測定各均一組分的單糖組成和分子量；通過測定均一組分清除羥基自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O₂^-·）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH）的能力，分析其體外抗氧化活性強(qiáng)弱。結(jié)果表明：ASPS經(jīng)分離純化得到4種多糖組分，即酸性多糖ASPA-1-1、ASPA-2-1、ASPA-3-1和中性多糖ASPN-1，其分子量依次為8.10、26.15、0.91、0.89 kDa，主要是由阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、核糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等按不同比例組成的雜多糖。ASPA-1-1、ASPA-2-1、ASPA-3-1、ASPN-1均具有明顯的抗氧化活性，其中ASPA-2-1清除·OH、DPPH的能力高于ASPA-1-1、ASPA-3-1、ASPN-1，而ASPA-3-1清除O₂^-·的能力最強(qiáng)。綜上認(rèn)為，從‘紫加1號’中分離純化得到的多糖具有較好的抗氧化活性。該研究結(jié)果為‘紫加1號’作為天然抗氧化劑的深度研究和進(jìn)一步開發(fā)與利用提供了一定的科學(xué)理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：紫加1號，嫩莖葉，多糖，分離純化，單糖組成，分子量，抗氧化活性

中圖分類號：Q946 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1000-3142（2024）02-0362-11

基金項目：云南省院士專家工作站 “宋寶安院士工作站”項目（2019IC007）。

第一作者：周錦燕（1997-），碩士研究生，主要研究方向為高等植物資源評價與利用，（E-mail）3025017465@qq.com。

^*通信作者：曾千春，博士，教授，主要從事作物種質(zhì)創(chuàng)新與育種研究，（E-mail）zengqianchun@qq.com。

Isolation and purification the polysaccharides and its antioxidant activity of ‘Zijia 1’ novel variety of Acanthopanax senticosus ZHOU Jinyan， ZHANG Yun， LIU Liangyan， ZHANG Hui，

RUAN Liuyang， ZENG Qianchun^*

（ College of Agronomy and Biotechnology， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201，China ）

Abstract： ‘Zijia 1’ is a new variety of Acanthopanax senticosus bred by our team， its tender stems and leaves characterized with gray-purple color and sweet taste. This study is aim to isolate and purify the polysaccharides from the tender stems and leaves of ‘Zijia 1’， and determine the monosaccharide composition and molecular weight of different fractions obtained after separation， and the antioxidant activity of each fraction was evaluated. The crude Asenticosus polysaccharides （ASPS） were obtained from the tender stems and leaves of ‘Zijia 1’ by water extraction and alcohol precipitation， which were then separated and purified by DEAE-Cellulose 52 ion column and Sephadex G-100 gel column to obtain a uniform component. The ion chromatography and gel permeation chromatography-refractive index-multi-angle laser light scattering method was exploited to determine the monosaccharide compositions and molecular weight of the polysaccharides fractions. The hydroxyl radical （·OH）， superoxide radical （O₂^-·） and 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical （DPPH） scavenging ability were determined to evaluate the antioxidant of each fraction in vitro. Four polysaccharides ASPA-1-1， ASPA-2-1， ASPA-3-1 and ASPN-1 were isolated and purified from ASPS， with molecular weight of 8.10， 26.15， 0.91，" 0.89 kDa， respectively， mainly composed of arabinose， rhamnose， galactose， glucose， xylose， mannose， ribose， galacturonic acid and glucuronic acid in different proportions. The ASPA-1-1， ASPA-2-1， ASPA-3-1 and ASPN-1 from ‘Zijia 1’ demonstrated significant scavenging activities on ·OH， O₂^-· and DPPH free radical， the ability of ASPA-2-1 to scavenge ·OH and DPPH is higher than ASPA-1-1， ASPA-3-1 and ASPN-1; ASPA-3-1 has the strongest ability to scavenge O₂^-·. Therefore， the purified polysaccharides from ‘Zijia 1’ has obvious antioxidant activity， which provides a scientific theoretical basis for its further utilization.

Key words： ‘Zijia 1’， tender stems and leaves， polysaccharides， isolation and purification，monosaccharide compositions， molecular weight， antioxidant activity

‘紫加1號’源自云南省哀牢山南麓墨江縣境內(nèi)的野生刺五加（Acanthopanax senticosus），多年生常綠植物，由本課題組選育（云林園植新登第20220011號）。其嫩莖葉呈灰紫色且味甘，有別于普通刺五加嫩莖葉綠色且味苦；富含蛋白質(zhì)、粗纖維和維生素，是一種高鉀、高鈣、高鎂、低鈉的木本蔬菜（管穎等，2018）；其根可入藥，性溫，具有益氣健脾、補(bǔ)腎安神和扶正固本的作用（王正琴，2018），藥用價值很高，在醫(yī)療和保健方面發(fā)展前景可觀。

多糖是由多個單糖通過糖苷鍵連接而成的結(jié)構(gòu)復(fù)雜、極性大的化合物（Ullah et al.， 2019）。天然多糖因具有良好生物活性、無毒性、生物降解性和生物相容性等特點而成為目前國內(nèi)外的研究熱點（周洋等，2021）。刺五加多糖已被證實具有抗氧化（姬普雨和王慧景，2022）、抑制癌細(xì)胞增殖（彭莉等，2020）和治療免疫性肝損傷等能力（Zhang et al.，2019）。目前，大多數(shù)研究主要集中在刺五加的根莖和葉上，但對于‘紫加1號’不同級分多糖的抗氧化性分析卻尚未見報道。從‘紫加1號’原料中提取的多糖含有大量的蛋白質(zhì)、色素等雜質(zhì)，分離純化多糖是目前研究的重點。因此，對‘紫加1號’多糖的不同級分及抗氧化活性進(jìn)行綜合比較和評價具有一定意義。

本研究以‘紫加1號’嫩莖葉多糖為研究對象，依托現(xiàn)代色譜分離技術(shù)、光譜學(xué)手段及藥理學(xué)方法，擬探討‘紫加1號’嫩莖葉多糖的分子量、單糖組成、體外抗氧化活性，以期為‘紫加1號’作為天然抗氧化劑的進(jìn)一步開發(fā)利用及精細(xì)深加工提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

材料：以本課題組選育的刺五加新品種（云林園植新登第20220011號）‘紫加1號’的嫩莖葉，即枝條頂端7 ～ 5 cm幼嫩部分為材料，取自云南省墨江縣（101°41′ E、23°25′ N ，海拔1 282 m）。70℃烘干至恒重，揉碎，分裝于自封袋中，樣品于常溫干燥環(huán)境下避光保存。

試劑：AB-8大孔吸附樹脂（北京索萊寶科技有限公司）；玻璃層析柱［四川蜀玻（集團(tuán)）有限責(zé)任公司］；DEAE-Cellulose 52、Sephadex G-100、透析袋（上海源葉生物科技有限公司）；單糖標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC ≥ 98%）、氫氧化鈉（色譜純）、醋酸鈉（美國 Sigma 公司）；三氟乙酸（色譜純）、硝酸鈉、甲醇、氯化鈉、苯酚、濃硫酸、鄰苯三酚、鹽酸、維生素C（Vc）、水楊酸、Tris和硫酸亞鐵等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

DZF-6050真空干燥箱（上海-恒科學(xué)儀器有限公司）、ALPHA 1-2 LD plus真空冷凍干燥機(jī)（德國Marin Christ公司）、UV-6100S紫外可見光光度計（上海元析儀器有限公司）、XH-T漩渦混合器（新寶儀器）、Reacti-thermo氮氣吹掃儀（Thermo）、ICS5000離子色譜儀（Thermo）、OPTILAB T-rex示差檢測器（Wyatt）、DAWN HELEOS-Ⅱ激光光散射檢測器（Wyatt）。

1.3 方法

1.3.1 多糖的提取 采用熱水煮提法提取多糖（譚超杰等，2022），稱取樣品300 g，加入5.0 L超純水浸泡2.0 h后進(jìn)行煮提，收集濾液且濃縮至原體積溶液的1/5，于3 500 r·min^-1下離心5 min，取上清液，經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂柱（10 cm×30 cm）除雜脫色后，加入無水乙醇至濃度95%，4℃醇沉12 h，取沉淀，-30℃真空凍干后得粗多糖ASPS。

1.3.2 多糖含量的測定 采用苯酚-硫酸法測定‘紫加1號’多糖含量（于淼等，2019）。稱取無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，溶于100 mL的超純水中，依次吸取0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，超純水定容至2 mL，依次加入6%苯酚1 mL和濃硫酸5 mL，搖勻后放置5 min，置沸水中反應(yīng)15 min，冷卻至室溫，測定490 nm的吸光度。以質(zhì)量濃度（μg·mL^-1）為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=0.014 1x+0.005 6，R²=0.999 5，無水葡萄糖在15～90 μg·mL^-1的線性關(guān)系良好。

稱取ASPS 10 mg，超純水溶解且定容至5 mL，取2 mL于試管中，加入與上述相同的試劑，在490 nm處測定吸光度，通過以下公式計算多糖的含量：

式中：m為從標(biāo)準(zhǔn)曲線查到的多糖量（μg）；V_T為樣品總體積（mL）；V_S為測定的樣品體積（mL）；N為稀釋倍數(shù)，本研究取1；10⁶為1 g=10⁶ μg；m₀為樣品質(zhì)量（g）。

1.3.3 多糖的分離純化 （1）多糖的離子交換柱線性梯度洗脫分析：稱取10 mg ASPS溶解于10 mL超純水中，在4℃ 3 500 r·min^-1條件下離心10 min，取上清液，上樣品至DEAE-Cellulose 52離子柱（2.5 cm×45 cm），依次用超純水和0.1～1.0 mol·L^-1的NaCl溶液進(jìn)行洗脫，流速為5 s·d^-1，每管收集洗脫液5 mL，每管吸取1 mL采用苯酚-硫酸法在490 nm處測定吸光度，以管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作洗脫曲線。

（2）多糖離子交換柱層析制備：稱取10 g ASPS溶于200 mL超純水中，依次用4.0 L超純水和0.3、0.6、0.8 mol·L^-1的NaCl溶液洗脫，設(shè)定流速為5 s·d^-1，收集洗脫液，減壓濃縮后用截留分子量為3.5×10³ Da的透析袋除去鹽及色素，凍干備用。

（3）多糖的凝膠過濾層析制備：稱取適量上述多糖樣品溶于超純水中，在10 000" r·min^-1×5 min條件下離心，取上清，上樣品于Sephadex G-100凝膠柱（1.5 cm×100 cm）中，洗脫液為超純水，流速為10 s·d^-1，每管收集洗脫液10 mL，每管吸取1 mL用苯酚-硫酸法在490 nm處測定吸光度，以管數(shù)為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線，合并洗脫峰，濃縮凍干保存，即得純化后的均一多糖。

1.3.4 分子量測定 采用凝膠色譜-示差-多角度激光光散射色譜系統(tǒng)對多糖分子量進(jìn)行測定（胡衛(wèi)珍等，2020）。稱取適量多糖樣品溶解于0.1 mol·L^-1的NaNO₃溶液中，濃度為1.0 mg·mL^-1，完全溶解后通過0.45 μm的濾膜過濾，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中進(jìn)行檢測，采用Astra 6軟件收集和處理數(shù)據(jù)。

示差檢測器：Optilab T-rEX （Wyatt technology， CA， USA）；激光光散射檢測器：DAWN HELEOS Ⅱ （Wyatt technology，CA，USA）；凝膠排阻色譜柱［OHpak SB-805 HQ （300 mm×8 mm）、OHpak SB-804 HQ （300 mm×8 mm）、OHpak SB-803 HQ （300 mm×8 mm）］；流動相：0.1 mol·L^-1 NaNO₃；進(jìn)樣量：100 μL；流速：0.4 mL·min^-1；洗脫梯度：等度100 min，柱溫45℃。

1.3.5 單糖組分分析 采用Thermo ICS 5000離子色譜系統(tǒng)，結(jié)合電化學(xué)檢測器進(jìn)行單糖組成測定（郭東東等，2021）。以巖藻糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、古羅糖醛酸、葡萄糖醛酸和甘露糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品。稱取多糖樣品5.0 mg于色譜瓶中，加入1 mL 2 mol·L^-1 的三氟乙酸（TFA）溶液于121℃下水解2.0 h，通氮氣，吹干后加入甲醇清洗吹干，重復(fù)甲醇清洗吹干過程2～3次至完全除去TFA，加入適量無菌水溶解多糖，轉(zhuǎn)入色譜瓶中待測。

色譜條件：Dionex^TM CarboPac^TM PA20 （150 mm×3.0 mm， 10 μm）陰離子色譜柱；進(jìn)樣量：5 μL；流動相A為0.1 mol·L^-1 NaOH，流動相B為0.1 mol·L^-1 NaOH；0.2 mol·L^-1 NaAc；流速：0.5 mL·min^-1；柱溫：30℃。

1.3.6 抗氧化活性測定 （1） ·OH清除能力測定：采用水楊酸法測定多糖對·OH清除能力，根據(jù)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的·OH與水楊酸反應(yīng)，在510 nm處生成有色物質(zhì)，當(dāng)抗氧化劑存在時有色物質(zhì)相應(yīng)減少，可通過吸光度的大小來判斷清除·OH的能力。參考葛智超等（2021）的方法，稍加修改。稱取多糖粉末，溶于適量純水，配制不同質(zhì)量濃度 （0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0" mg·mL^-1）的溶液，分別吸取2 mL溶液于試管中，加入9 mmol·L^-1的硫酸亞鐵溶液和8.8 mmol·L^-1的過氧化氫溶液（3%，V/V）各1 mL，搖勻后加入1 mL 9 mmol·L^-1的水楊酸-乙醇溶液，將混合溶液于37℃下反應(yīng)1.0 h，在波長510 nm處測定吸光度，以純水和維生素C（Vc）溶液分別為空白對照和陽性對照，重復(fù)3次。

對·OH的清除活性：

式中：A₁為純水代替樣品的吸光度；A₂為加入樣品溶液的吸光度；A₃為不加過氧化氫溶液的吸光度。

（2）O₂^-·清除能力測定：采用鄰苯三酚自氧化法測定多糖對O₂^-·的清除能力，鄰苯三酚在堿性條件下迅速自氧化生成O₂^-·，加入抗氧化劑會抑制自氧化速度，并由綠色變?yōu)辄S色，在325 nm下通過測吸光度的大小來判斷抗氧化活性。參考楊洋等（2018）的方法，并稍加修改。稱取多糖粉末，溶于適量純水，配制不同質(zhì)量濃度（0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0 mg·mL^-1）的溶液，分別吸取2.0 mL于試管中，加入4.5 mL 50 mmol·L^-1的Tris-HCl緩沖液（pH 8.2），在25℃條件下反應(yīng)20 min，加入0.5 mL 25 mmol·L^-1的鄰苯三酚溶液，反應(yīng)5 min后加入1 mL 10 mmol·L^-1的HCl溶液終止反應(yīng)，于325 nm處測定吸光度。以Vc溶液作陽性對照，10 mmol·L^-1 HCl溶液作空白對照，重復(fù)3次。

對O₂^-·的清除活性：

式中：A₁為純水代替樣品的吸光度；A₂為加入樣品溶液的吸光度；A₃為鄰苯三酚溶液被純水代替的吸光度。

（3）DPPH清除能力測定：采用DPPH法對多糖的體外抗氧化活性進(jìn)行測定，當(dāng)抗氧化劑存在時，DPPH溶液由深紫色變?yōu)榈S色，在517 nm下吸光度變低，吸光度的變化與接受電子數(shù)量成定量關(guān)系，可對抗氧化能力進(jìn)行分析。參考王鋮博等（2019）的方法，并稍加修改。稱取多糖粉末，溶于適量純水中，配置不同質(zhì)量濃度（0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0 mg·mL^-1）的溶液，分別吸取2 mL于試管中，加入2 mL 2 mmol·L^-1的DPPH-無水乙醇溶液，25℃避光反應(yīng)30 min，在517 nm處測定吸光度。以Vc溶液為陽性對照、純水為空白對照，重復(fù)3次。

對DPPH的清除活性：

式中：A₀為純水代替樣品的吸光度；A₁為加入樣品溶液的吸光度；A₂為DPPH-無水乙醇溶液被純水代替的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2010軟件繪圖以及SPSS 21.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖提取和含量測定

取‘紫加1號’樣品300 g經(jīng)熱水煮提過濾、醇沉、AB-8大孔吸附樹脂除雜脫色，濃縮干燥后得到粗多糖粉末59.19 g，得率為19.73%，多糖含量為（8.41±0.09）%。

2.2 用DEAE-Cellulose 52制備柱分離多糖

如圖1所示，ASPS在DEAE-纖維素柱上的線性洗脫中主要分離出4個峰，分別對應(yīng)超純水、0.3 mol·L^-1 NaCl、0.6 mol·L^-1 NaCl和0.8 mol·L^-1 NaCl溶液。依次用4 L上述洗脫液分離ASPS，洗脫液經(jīng)減壓濃縮、透析、冷凍干燥后得到4個組分，命名為ASPA-1、ASPA-2、ASPA-3和ASPN，得率分別為7.41%、4.87%、4.07%和3.29%。

2.3 多糖的Sephadex G-100過濾層析結(jié)果

上述4個組分經(jīng)Sephadex G-100凝膠柱純化結(jié)果如圖2所示，經(jīng)凝膠柱純化后的多糖為單一峰，證明其為分子量在一定范圍內(nèi)的均一組分，收集洗脫峰，得到不同級分的多糖，命名為ASPA-1-1、ASPA-2-1、ASPA-3-1和ASPN-1，得率依次為1.49%、2.13%、6.24%和2.43%。

2.4 分子量測定

凝膠滲透色譜、多角度激光光散射檢測器與示差折光檢測器串聯(lián)對多糖分子量的測定結(jié)果如表1所示，ASPA-1-1、ASPA-2-1和ASPN-1多分散系數(shù)接近1.0，說明其相對分子質(zhì)量分布成單分散性，ASPA-3-1多分散性指數(shù)最大，各組分的旋轉(zhuǎn)半徑與重均分子質(zhì)量的大小順序不一致。

2.5 單糖組分分析

通過對比單糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間推斷單糖類型，如圖3所示，單糖標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖峰形勻稱，說明各標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰分離較好。采用內(nèi)標(biāo)法對單糖進(jìn)行定量，發(fā)現(xiàn)單糖種類及比例存在明顯差異，如圖4和表2所示，其中ASPA-1-1中半乳糖醛酸含量最高，ASPA-3-1中葡萄糖醛酸含量也最高，二者均未檢測出核糖；ASPA-2-1中核糖含量最高，半乳糖醛酸次之；ASPN-1中葡萄糖含量最高，含有極少的糖醛酸，未檢測出阿拉伯糖與核糖；4個多糖中均未檢測出古羅糖醛酸、甘露糖醛酸和果糖。

2.6 抗氧化活性測定

2.6.1 ·OH自由基清除能力 如圖5所示，不同多糖組分對·OH自由基的清除效果與多糖濃度呈量效關(guān)系，并且清除率均低于陽性對照Vc。當(dāng)質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL^-1時，ASPA-1-1、ASPA-2-1、ASPA-3-1和ASPN-1對·OH的清除率分別為48.94%、96.07%、48.22%和67.81%，對·OH清除能力的IC₅₀值依次為ASPA-2-1（0.17±0.008）mg·mL^-1、ASPN-1（0.36±0.033）mg·mL^-1、ASPA-1-1（1.35±0.336）mg·mL^-1、ASPA-3-1（2.01±0.050）mg·mL^-1，IC₅₀值越小表明自由基清除能力越強(qiáng)。其中，ASPA-2-1清除·OH能力最強(qiáng)。

2.6.2 O₂^-·自由基清除能力 如圖6所示，隨著濃度的增加，不同多糖組分對O₂^-·的清除能力增強(qiáng)，表現(xiàn)出一定的濃度依賴性，并且清除率均低于陽性對照Vc。當(dāng)質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL^-1時，ASPA-1-1、ASPA-2-1、ASPA-3-1和ASPN-1對O₂^-·的清除率分別為34.30%、46.84%、48.31%和16.58%；對O₂^-·清除能力的IC₅₀值依次為ASPA-3-1（1.29±0.037）mg·mL^-1、ASPA-2-1（1.49±0.045）mg·mL^-1、ASPA-1-1（5.03±0.253）mg·mL^-1、ASPN-1（7.56±0.160）mg·mL^-1，IC₅₀值越小表明自由基清除能力越強(qiáng)。ASPA-2-1和ASPA-3-1清除O₂^-·能力最強(qiáng)，并且葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸含量較高。

2.6.3 DPPH自由基清除能力 如圖7所示，不同多糖組分對DPPH的清除能力趨勢一致，均隨著濃度的增加而逐漸增加，并且清除率始終低于陽性對照Vc。當(dāng)質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL^-1時，ASPA-1-1、ASPA-2-1、ASPA-3-1和ASPN-1對DPPH的清除率依次為89.17%、89.02%、89.07%和76.18%，對DPPH清除能力的IC₅₀值依次為ASPA-2-1（0.01±0.003）mg·mL^-1、ASPA-1-1（0.14±0.002）mg·mL^-1、ASPA-3-1（0.15±0.017）mg·mL^-1、ASPN-1（0.50±0.002）mg·mL^-1，其分子量大小與清除自由基能力呈正相關(guān)，ASPA-2-1對DPPH的清除能力最強(qiáng)。

3 討論與結(jié)論

本研究通過水提醇沉得到刺五加新品種‘紫加1號’粗多糖（ASPS），ASPS經(jīng)DEAE-Cellulose 52聯(lián)合Sephadex G-100柱層析分離純化，得到4個多糖組分ASPA-1-1、ASPA-2-1、ASPA-3-1和ASPN-1，其中ASPA-1-1、ASPA-2-1和 ASPN-1多分散系數(shù)接近 1.0，說明其相對分子質(zhì)量分布成單分散性，表明多糖相對分子質(zhì)量分布范圍較集中，純度較高（ Hu et al.，2017），ASPA-3-1多分散性指數(shù)最大，可能是其分子鏈長短分布不均勻，從而導(dǎo)致分子量分布廣（ Liu et al.，2019）；均方根半徑反映該分子松散程度，旋轉(zhuǎn)半徑越小說明樣品的尺寸越?。ń?，2019），但試驗中各組分的旋轉(zhuǎn)半徑與重均分子質(zhì)量的大小順序不一致，這可能是多糖樣品在鹽溶液中因分子形狀發(fā)生皺縮而導(dǎo)致分子大小降低（胡衛(wèi)珍等，2020）。本研究單糖組分分析的結(jié)果表明，中性多糖ASPN-1中葡萄糖所占比例最高，含有極少的糖醛酸；酸性多糖ASPA-1-1、 ASPA-2-1和ASPA-3-1中半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸所占比例較高，這與白也明等（2015）從刺五加根莖分離出的半乳糖醛酸含量較高相似，不同的是‘紫加1號’中葡萄糖醛酸含量較高，并且在刺五加中含量低于1.10%。ASPA-1-1和ASPA-3-1分子量分別為8.10 kDa和0.91 kDa，小于白也明等（2015）從刺五加中分離的酸性多糖分子量10.0～48.0 kDa，原因可能是因品種、產(chǎn)地、提取方法和測定方法的不同而不同。

采用清除·OH、O₂^-·和DPPH三種自由基的方法是評價活性物質(zhì)體外抗氧化能力的常見方法。本研究得到的4個多糖組分對·OH、O₂^-·和DPPH均有明顯的清除作用，并且抗氧化能力與糖濃度呈現(xiàn)量效關(guān)系，即隨著多糖濃度的增加抗氧化能力逐漸增強(qiáng)。其中，ASPA-2-1分子量最大（為26.15 kD）、半乳糖醛酸含量較高（為22.47%），清除·OH和DPPH自由基的能力最強(qiáng)，IC₅₀值分別為（0.17±0.008）mg·mL^-1和（0.01±0.003）mg·mL^-1，與沈宇等（2020）發(fā)現(xiàn)刺五加果多糖在分子量10～50 kDa時抗氧化能力最高和胡彥波等（2022）發(fā)現(xiàn)薇菜中半乳糖醛酸含量較高的WOJP-A清除·OH的能力強(qiáng)于WOJP-N相似，原因可能是糖醛酸含量高且分子量大的多糖能夠阻斷自由基得電子，從而終止一系列自由基鏈反應(yīng)，并且糖醛酸與反應(yīng)溶液中的Fe²⁺螯合，從而減少了羥基的生成（Fan et al.，2019）。與此同時，ASPA-2-1 對DPPH的清除可能是糖醛酸可以活化異頭碳上的氫原子，與自由基結(jié)合形成穩(wěn)定的DPPH-H 結(jié)構(gòu)，從而終止自由基反應(yīng)（魏晨業(yè)等，2021；李學(xué)秀等，2022）。由此可知，多糖的抗氧化活性與其分子量、糖醛酸含量和單糖組成等因素相關(guān)（Xie et al.， 2016）。據(jù)文獻(xiàn)報道，糖醛酸含量較高的多糖具有較強(qiáng)的抗氧化能力（Yan et al.， 2019），ASPA-3-1清除O₂^-·能力最強(qiáng)，IC₅₀值為（1.29±0.037）mg·mL^-1，其富含葡萄糖醛酸（16.31%）和半乳糖醛酸（32.70%），原因可能是糖醛酸可以激活異頭碳上的氫原子供氫清除自由基，使其轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的化合物而阻斷氧化連鎖反應(yīng)，進(jìn)而賦予多糖較強(qiáng)的抗氧化活性（Hepef et al.， 2016；袁清霞等，2016; Monirsadat et al.， 2020）。

本研究通過分離純化聯(lián)合多種色譜手段對‘紫加1號’多糖的單糖組成和分子量進(jìn)行測定，在前人研究基礎(chǔ)上推進(jìn)了對‘紫加1號’多糖的認(rèn)知，為深入探索其化學(xué)成分與抗氧化機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時也為進(jìn)一步開發(fā)利用該植物提供科學(xué)依據(jù)。但目前，關(guān)于‘紫加1號’多糖不同級分的構(gòu)成單元及連接方式仍未明確，后續(xù)研究應(yīng)采用先進(jìn)技術(shù)明確多糖的精細(xì)結(jié)構(gòu)，以及通過動物試驗進(jìn)一步證實體內(nèi)抗氧化作用及分子機(jī)制。

參考文獻(xiàn)：

BAI YM， 2015. Isolation， purification and structure analysis of polysaccharides from Acanthopanax senticosus" ［D］. Changchun： Northeast Normal University." ［白也明， 2015. 刺五加多糖的分離純化和結(jié)構(gòu)研究 ［D］. 長春： 東北師范大學(xué).］

FAN J， FENG H， YU Y， et al.， 2017. Antioxidant activities of the polysaccharides of Chuanminshen violaceum" ［J］. Carbohyd Polym， 10（157）： 629-636.

GUAN Y， GUO YD， CHEN G， et al.， 2018. Analysis and quality evaluation of nutritional components in the Purple Acanthopanax senticosus" ［J］. J Food Saf Qual， 9（5）： 1021-1025." ［管穎， 郭艷東， 陳果， 等， 2018. 紫加1號的營養(yǎng)成分分析與評價 ［J］. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報， 9（5）： 1021-1025.］

GUO DD， LEI JY， PENG ZJ， et al.， 2021. Extraction optimization， structural characterization and physicochemical properties of polysaccharides from Clitocybe squamulosa fruiting body ［J］. Acta Edulis Fungi， 28（4）： 39-47." ［郭東東， 雷佳鈺， 彭志杰， 等， 2021. 鱗杯傘子實體多糖提取工藝優(yōu)化及其結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì) ［J］.食用菌學(xué)報， 28（4）： 39-47.］

GE ZC， LANG M， LI Y， 2021. Isolation，purification， monosaccharide composition and antioxidant activity analysis of Euglena gracilis polysaccharides" ［J］. J Shanghai Ocean Univ， 30（3）： 564-571." ［葛智超， 郎蒙， 李燕， 2021. 裸藻多糖的分離純化、單糖組成及其抗氧化活性 ［J］. 上海海洋大學(xué)學(xué)報， 30（3）： 564-571.］

GONG W， TANG J， WEI YY， et al.， 2021. Isolation，purification， structural characterization of polysaccharide from Camellia nitidissima Chi and its antioxidant activities in vitro" ［J］. Packag Food Mach， 37（6）： 184-190." ［龔雯， 唐婕， 韋雅淵， 等， 2021. 金花茶多糖分離純化、結(jié)構(gòu)表征及其體外抗氧化性 ［J］. 食品與機(jī)械， 37（6）： 184-190.］

HE PF， ZHANG AQ， ZHANG FM， et al.， 2016. Structure and bioactivity of a polysaccharide containing uronic acid from Polyporus umbellatus sclerotia ［J］. Carbohyd Polym， 152： 222-230.

HU WZ， QI ZY， CHEN XF， et al.， 2020. Determination of molecular weight and distribution of Dendrobium officinale polysaccharide by gel permeation chromatography coupled with multi angle laser light scattering" ［J］. Zhejiang Agric Sci， 61（6）： 1166-1167." ［胡衛(wèi)珍， 齊振宇， 陳曉芳， 等， 2020. 凝膠滲透色譜聯(lián)用多角度激光光散射測定鐵皮石斛多糖分子量及其分布 ［J］. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)， 61（6）： 1166-1167.］

HU T， HUANG QL， WONG KH，et al.， 2017. Structure， molecular conformation， and immunomodulatory activity of four polysaccharide fractions from Lignosus rhinocerotis sclerotia" ［J］. Int J Biol Macromol， 94 （Pt A）： 423-430.

JI PY， WANG HJ， 2022. Effect of Acanthopanax senticosus polysaccharide on growth performance， immune function and antioxidant capacity of broilers" ［J］. Feed Res， 45（4）： 52-55." ［姬普雨， 王慧景， 2022. 刺五加多糖對肉雞生長性能、免疫功能和抗氧化能力的影響 ［J］. 飼料研究， 45（4）： 52-55.］

JIANG Q， LOU ZX， WANG ZQ， et al.， 2019. Isolation and purification， structure and molecular conformation and antioxidant activities of polysaccharides from Cordyceps militaris" ［J］. Food Ferment Ind， 45（1）： 22-28." ［江琦， 婁在祥， 王正齊， 等， 2019. 蛹蟲草多糖的分離純化、分子構(gòu)象分析及抗氧化活性研究 ［J］. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 45（1）： 22-28.］

LIU Y， ZHENG DD， WANG DH， et al.， 2019. Immunomodulatory activities of polysaccharides from white button mushroom， Agaricus bisporus （Agaricomycetes）， fruiting bodies and cultured mycelia in healthy and immunosuppressed mice ［J］. Int J Med Mushrooms， 21（1）： 13-27.

LI XX， LIU HT， AN YZ， et al.， 2022. Study on separation， purification and antioxidant activities of hemicelulose polysaccharides from Eucalyptus pre-hydrolysate" ［J］. China Pulp amp; Paper， 41（4）： 30-37." ［李學(xué)秀， 劉海棠， 安永貞， 等， 2022. 桉木預(yù)水解液中半纖維素多糖分離純化及抗氧化活性研究 ［J］. 中國造紙， 41（4）： 30-37.］

MONIRSADAT M， MOHAMMAD RA， LEILA K， 2020. Antioxidant， antiradical， and antimicrobial activities of polysaccharides obtained by microwave-assisted extraction method： a review ［J］. Carbohyd Polym， 229： 115421.

PENG L， ZHOU YH， WANG D， 2020. Research progress in anti-tumor effect and mechanism of Acanthopanax senticosus polysaccharides" ［J］. J Hubei Univ Sci Technol （Med Ed）， 34（6）： 546-549." ［彭莉， 周燕紅， 王丹， 2020. 刺五加多糖抗腫瘤作用及其機(jī)制研究進(jìn)展 ［J］. 湖北科技學(xué)院學(xué)報（醫(yī)學(xué)版）， 34 （6）： 546-549.］

SHEN Y， ZHAO HB， ZHAO H， et al.， 2020. Study on separation of Acanthopanax polysaccharide and its antioxidant activity by ultrafiltration" ［J］. Heilongjiang Med Pharm， 43 （5）： 8-11." ［沈宇， 趙宏博， 趙宏， 等， 2020. 超濾法分離刺五加果多糖及其抗氧化活性的研究 ［J］. 黑龍醫(yī)藥科學(xué)， 43（5）： 8-11.］

TAN CJ， WANG B， ZOU WQ， et al.， 2022. Extraction technology and antioxidant activity of polysaccharide from traditional Chinese medicine compositions ［J］. J Beihua Univ （Nat Sci Ed）， 23 （2）： 218-224." ［譚超杰， 王博， 鄒文奇， 等， 2022. 中藥組合物多糖的提取工藝及抗氧化活性研究 ［J］. 北華大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 23（2）： 218-224.］

ULLAH S， KHALIL AA， SHAUKAT F， et al.， 2019. Sources extraction and biomedical properties of polysaccharides" ［J］. Foods， 8 （8）： 304.

WANG ZQ， 2018. Artificial domestication and cultivation techniques of plateau characteristic healthy vegetable purple Acanthopanax senticosus" ［J］. Yunnan Agric， （8）： 66-67." ［王正琴， 2018. 高原特色養(yǎng)生蔬菜紫五加人工馴化栽培技術(shù) ［J］. 云南農(nóng)業(yè)， （8）： 66-67.］

WANG CB， CHEN LL， JIAO CZ，et al.， 2019. Structural characterization and antioxidant activity of polysaccharide in Sorbus koehneana fruit ［J］. Guihaia， 39 （11）： 1527-1533." ［王鋮博， 陳樂樂， 焦彩珍， 等， 2019. 陜甘花楸果實多糖的結(jié)構(gòu)表征及抗氧化活性研究 ［J］. 廣西植物， 39（11）： 1527-1533.］

WEI CY， BAO XW， WANG J， et al.， 2021. Isolation， purification and antioxidant activity of polysaccharides from the fruit of Hippophae rhamnoides" ［J］. Food Sci， 42（4）： 227-232." ［魏晨業(yè)， 包曉瑋， 王娟， 等， 2021. 沙棘多糖分離純化及抗氧化活性 ［J］. 食品科學(xué)， 42（4）： 227-232.］

XIE XF， ZOU GL， LI CH， 2016. Purification， characterization and in vitro antioxidant activities of polysaccharide from Chaenomeles speciosa" ［J］. Int J Biol Macromol， 92： 702-707.

YAN JM， ZHU L， QU YH， et al.， 2019. Analyses of active antioxidant polysaccharides from four edible mushrooms" ［J］. Int J Biol Macromol， 123： 945-956.

YANG XF， ZENG YP， LU N， et al.， 2019. Optimization of pigment extraction from purple Acanthopanax senticosus by response surface methodology and its stability" ［J］. J Mol Sci， 35（5）： 432-440." ［楊先峰， 曾艷萍， 呂娜， 等， 2019. 響應(yīng)面法優(yōu)化紫五加色素提取工藝及其穩(wěn)定性研究 ［J］. 分子科學(xué)學(xué)報， 35（5）： 432-440.］

YU M， WANG B， FU YS， et al.， 2019. Research on extraction technology of polysaccharides from Acanthopanax senticosus waste residue by response surface methodology" ［J］. Chin Tradit Herb Drugs， 50（7）： 1610-1613." ［于淼， 王冰， 付葉珊， 等， 2019. 響應(yīng)面法優(yōu)化刺五加根廢棄物多糖提取工藝的研究 ［J］. 中草藥， 50（7）： 1610-1613.］

YANG Y， WANG YF， MA YX， et al.， 2018. Preparation and structural characteristics of sulfated polysaccharides from Aralia chinensis root-bark and its antioxidant activity" ［J］. Guihaia， 38（7）： 911-923." ［楊洋， 王一峰， 馬詣欣， 等， 2018. 楤木根皮多糖硫酸酯的制備、結(jié)構(gòu)表征及抗氧化活性的研究 ［J］. 廣西植物， 38（7）： 911-923.］

YUAN QX， 2016. Isolation， purification， structure and bioactivity of polysaccharides from mulberry （Morus alba L.） leaves" ［D］. Nanjing： Nanjing Agricultural University." ［袁清霞， 2016. 桑葉多糖分離純化、結(jié)構(gòu)分析及生物活性研究 ［D］. 南京： 南京農(nóng)業(yè)大學(xué).］

ZHOU Y， YANG DP， QIAN CG， et al.， 2021. Purification， structural characterization and antioxidant activity of polysaccharide from the rhizome of Amomum villosum Lour ［J］. Food Ferment Ind， 47（16）： 52-58." ［周洋， 楊得坡， 錢純果，等， 2021. 陽春砂根莖多糖分離純化、結(jié)構(gòu)表征及抗氧化活性 ［J］. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 47（16）： 52-58.］

（責(zé)任編輯 蔣巧媛）