蜂膠軟膠囊中總黃酮測定方法的改進(jìn)

摘 要：蜂膠中富含大量總黃酮類化合物，黃酮類化合物具有豐富的藥理作用。對蜂膠軟膠囊參照GB/T 20574—2006檢測時，加入顯色劑用水定容后，溶液變渾濁，影響分光光度計吸光度測定的穩(wěn)定性，本文對其前處理條件、定容溶液、顯色時間進(jìn)行優(yōu)化，并對方法標(biāo)準(zhǔn)曲線、重復(fù)性、加標(biāo)回收率進(jìn)行驗證。結(jié)果表明，在415 nm處，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，在含量為0.2～1.2 mg時呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=0.734 1x-0.005 6（R=0.999 8），相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%，加標(biāo)回收率為92.0%～97.0%。

關(guān)鍵詞：蜂膠軟膠囊；總黃酮；分光光度法

Improvement of the Determination Method for Total Flavonoids in Propolis Soft Capsules

ZHOU Lu1，2， HUANG Ting1，2， DONG Yao1，2

（1.Jiangsu Provincial Productivity Promotion Center， Nanjing 210001， China;

2.Jiangsu Provincial Physical and Chemical Testing Center， Nanjing 210001， China）

Abstract： Propolis is rich in a large amount of total flavonoids， which have rich pharmacological effects. When testing propolis soft capsules with reference to GB/T 20574—2006， the solution became turbid after adding a colorimetric agent to a constant volume of water， which affected the stability of the spectrophotometer absorbance measurement. The pre-treatment conditions， constant volume solution， and colorimetric time were improved， and the method standard curve， detection limit， repeatability， and spiked recovery rate were verified. The results showed that at 415 nm， the content of rutin was 0.2～1.2 mg， and the linear regression equation was y= 0.734 1x-0.005 6 （R=

0.999 8）， the relative standard deviation was 0.9%. The recoveries were 92.0% ～ 97.0%.

Keywords： propolis soft capsules; total flavonoids; spectrophotometry

蜂膠是由蜜蜂，特別是工蜂，從植物的樹膠、樹脂中采集，并與上顎腺、蠟腺等分泌物混合形成的具有黏性的固體膠狀物[1]?，F(xiàn)代研究結(jié)果表明，蜂膠含有維生素、酚類、蓓烯類、黃酮類化合物等多種營養(yǎng)保健成分。在蜂膠的眾多活性物質(zhì)中，黃酮類物質(zhì)是最為關(guān)鍵的成分之一，它具有抗菌、殺毒、消炎止痛、降血脂、促進(jìn)機(jī)體組織再生和增強(qiáng)機(jī)體免疫能力等功效[2]。

近年來，蜂膠產(chǎn)品在市場上受到了廣泛的關(guān)注和認(rèn)可，其種類也日益豐富，主要以膠囊形式呈現(xiàn)。蜂膠中主要活性成分為黃酮類化合物，已成為研究熱點，且市售的蜂膠膠囊類產(chǎn)品均以總黃酮含量作為評價指標(biāo)[3]。黃酮類化合物的測定有多種方法，如液相色譜法﹑分光光度法等，液相色譜法可以測定單一的黃酮成分，分光光度比色法可以測定黃酮成分的總量[4-5]。紫外分光光度法被廣泛應(yīng)用于測定蜂膠制品中的總黃酮含量，因為它具有操作簡便、準(zhǔn)確度高且易于實施的特點，因此深受廣大研究者的青睞。

1 材料與方法

1.1 試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（含量95.5%，上海安譜璀世標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，批號2251131）；無水乙醇、硝酸鋁、95%乙醇、醋酸鉀（分析純，南京化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器

UV-1801紫外-可見分光光度計（北京瑞利分析儀器有限公司）；KH2-250DB超聲波清洗儀（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；TGL-15B高速臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；BT25S十萬分之一電子天平、BSA224S-CW電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]。

1.3 實驗方法

根據(jù)《蜂膠中總黃酮含量的測定方法 分光光度比色法》（GB/T 20574—2006），利用分光光度比色法對蜂膠軟膠囊中的總黃酮進(jìn)行定量分析。

1.3.1 試樣的制備

稱取蜂膠軟膠囊內(nèi)容物0.5 g（精確至1 mg）于燒杯中，加入95%乙醇約30 mL，室溫下超聲提取20 min，將溶液轉(zhuǎn)移至50 mL的容量瓶中，加入95%乙醇至刻度線，混合均勻后進(jìn)行過濾，棄去初濾液，收集濾液待測。

準(zhǔn)確吸取1.0 mL待測溶液于50 mL容量瓶中，分別加入1.0 mL硝酸鋁溶液和1.0 mL醋酸鉀溶液，加95%乙醇至刻度，搖勻，靜置10 min，3 000 r·min-1離心3 min，取上清液待測。

空白實驗精密吸取1.0 mL待測溶液于50 mL容量瓶中，加95%乙醇至刻度，搖勻。用1 cm比色皿，在415 nm以空白試液作參比，測定樣品吸光度。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

稱取10.50 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（含量95.5%）于50 mL容量瓶中，用無水乙醇溶解，并定容至刻度，搖勻，溶液濃度為0.2 g·L-1。吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL和6.00 mL（相當(dāng)于蘆丁含量0 mg、0.2 mg、0.4 mg、0.6 mg、0.8 mg、1.0 mg和1.2 mg），分別置于50 mL容量瓶中，向容量瓶中加入1.0 mL硝酸鋁溶液和1.0 mL醋酸鉀溶液，用95%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置10 min后測定。

1.3.3 結(jié)果計算

總黃酮計算公式為

式中：X為黃酮類化合物的總含量，%；m1為由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出測定液中蘆丁質(zhì)量，mg；m為樣品的質(zhì)量，g；d為稀釋比例。計算結(jié)果表示到小數(shù)點后兩位。

2 結(jié)果與分析

2.1 試樣前處理方法的改進(jìn)

國標(biāo)方法中稱取樣品0.5 g，置于燒杯中，加入95%乙醇約30 mL，然后將燒杯置于65 ℃水浴中加熱45 min，攪拌使之溶解，國標(biāo)前處理時間較長。本文分別研究了室溫下不同超聲提取時間、振蕩提取時間對實驗結(jié)果的影響。結(jié)果表明，當(dāng)超聲提取時間分別為5 min、20 min、40 min時，總黃酮測定結(jié)果分別為7.53%、7.70%、7.68%；振蕩提取時間分別為5 min、20 min、40 min時，總黃酮測定結(jié)果分別為7.34%、7.52%、7.65%。通過對比，超聲提取5 min，提取不完全，總黃酮測定結(jié)果偏小，超聲提取20 min和40 min的測定結(jié)果差別不大；振蕩提取時間越長，提取越完全，測定結(jié)果越高；且相同時間下，超聲提取比振蕩提取效果好、測定結(jié)果高。因此，考慮時間、操作簡單快捷等因素，實驗采用超聲提取20 min。

2.2 樣品顯色溶液的改進(jìn)

按國標(biāo)方法測定時，溶液出現(xiàn)渾濁，搖勻后出現(xiàn)較多小氣泡，比色時吸光度不穩(wěn)定，分光光度法測定時需溶液澄清透明。嘗試將渾濁樣液用濾紙過濾，發(fā)現(xiàn)過濾后溶液仍然不澄清，又嘗試將溶液離心，均不能得到澄清透明的測定液。最后本文將國標(biāo)加水稀釋至刻度，改為加95%乙醇稀釋至刻度，溶液比加水至刻度更加渾濁，離心后，離心管底部有大量白色沉淀，溶液澄清透明，可直接用于比色。國標(biāo)法與改進(jìn)后吸光度穩(wěn)定性對比詳見表1，發(fā)現(xiàn)改進(jìn)后吸光度值更穩(wěn)定。

2.3 顯色時間的改進(jìn)

國標(biāo)方法搖勻后需靜置1 h，時間較長，本文研究了不同顯色時間對吸光度的影響。選取標(biāo)準(zhǔn)曲線0.6 mg單點，分別在顯色時間2 min、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min和60 min進(jìn)行吸光度測定，吸光度詳見表2，發(fā)現(xiàn)10 min后吸光度值趨于穩(wěn)定，所以將顯色時間改為10 min。

2.4 方法確認(rèn)實驗

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以蘆丁含量為橫坐標(biāo)（x），吸光度為縱坐標(biāo)（y），得到線性回歸方程為y=0.734 1x-0.005 6，相關(guān)系數(shù)R=0.999 8。由表3可知，蘆丁質(zhì)量在0.2～1.2 mg，與溶液的吸光度值有著良好的線性關(guān)系。

2.4.2 方法重復(fù)性和加標(biāo)回收率實驗

（1）重復(fù)性測定。稱6份試樣，按改進(jìn)后的方法進(jìn)行測定，結(jié)果詳見表4。6次總黃酮含量測定的平均值為7.69%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%，RSD值≤5%，方法重復(fù)性良好。

（2）加標(biāo)回收率實驗。稱取蜂膠軟膠囊樣品3份，分別加入一定量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，使樣品中總黃酮含量增加0.5%、1.0%、3.0%，結(jié)果詳見表5，加標(biāo)回收率為92.0%～97.0%，滿足實驗分析要求。

3 結(jié)論

分光光度法對設(shè)備要求簡單、具有較好的穩(wěn)定性，易于推廣普及。通過對國標(biāo)方法的前處理條件、定容溶液、顯色時間進(jìn)行改進(jìn)，研究并確定檢測蜂膠軟膠囊中總黃酮含量的最佳方法。將蜂膠軟膠囊內(nèi)容物超聲提取20 min，用95%乙醇定容，顯色10 min后，離心后測定，方法準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好、操作簡便，結(jié)果可靠，可用于蜂膠軟膠囊中總黃酮的測定。

參考文獻(xiàn)

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[2]王光新.北方部分地區(qū)蜂膠成分分析及抗糖尿病機(jī)理的研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[3]張愛武.蜂膠膠囊中總黃酮提取方法的優(yōu)化與研究[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，2019，31（6）：46-51.

[4]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.蜂膠中總黃酮含量的測定方法 分光光度比色法：GB/T 20574—2006[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會，2006.

[5]楊歡，劉越，杜旭剛.等.蕎麥及其制品中總黃酮含量測定的方法篩選[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2021，12（8）：3313-3320.

作者簡介：周璐（1990—），女，江蘇南京人，本科，工程師。研究方向：食品安全分析測試。