高效液相色譜法測定新型促性腺激素釋放激素拮抗劑LPM7100328原料藥中的有關物質

李麗霞，王旭東，馬樹芝，閆娜娜，，周鳳梅，車鑫，*（1.煙臺大學藥學院，山東 煙臺 264005；2.煙臺大學分子藥理和藥物評價教育部重點實驗室，山東 煙臺 264005；.山東綠葉制藥有限公司長效和靶向制劑國家重點實驗室，山東 煙臺 264670）

促性腺激素釋放激素（GnRH）是由下丘腦分泌的一種十肽，可通過反饋控制垂體分泌促卵泡素和促黃體素，特異性和選擇性地作用于GnRH的拮抗劑或激動劑，可用于性激素依賴性失衡相關疾病的治療，其用于前列腺癌的治療一直備受關注[1]。前列腺癌是男性常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率僅次于肺癌。雄激素剝奪治療（ADT）是局部晚期、復發(fā)性和轉移性前列腺癌標準治療的關鍵組成部分，其中GnRH激動劑（如戈舍瑞林、亮丙瑞林等）的使用最為常見[2-4]，但GnRH激動劑在結合受體初始會暫時性促進促性腺激素的分泌，進而存在短暫性病情惡化的可能性，必要時還需聯(lián)用抗雄激素藥物[5]；與激動劑不同，GnRH拮抗劑立即快速可逆性地抑制促性腺激素的分泌[6]，可避免“點火效應”的發(fā)生[7]，降低心血管疾病的發(fā)生風險[8]。目前有兩種GnRH拮抗劑適用于晚期前列腺癌的治療，分別是地加瑞克（注射用多肽藥物）[9]和瑞盧戈利（Relugolix）（口服活性非肽類小分子藥物）[10-11]。在研的具有GnRH拮抗活性的化合物多為肽類化合物，鑒于肽類GnRH拮抗劑存在口服吸收性、穩(wěn)定性差等相關問題，仍需要繼續(xù)研究開發(fā)臨床效果更佳的口服非肽類小分子GnRH拮抗劑。

LPM7100328是山東綠葉制藥有限公司針對瑞盧戈利進行結構改造，設計合成的新化合物，是一種新型的口服小分子GnRH受體拮抗劑，可用于晚期前列腺癌的治療[12]。其結構式見圖1。LPM7100328于藥物研發(fā)早期的體外及動物實驗表明，其對人源GnRH受體有明顯的結合能力和抑制作用，與Relugolix相比，具有更高的口服生物利用度以及更小的心臟毒性。作為正處于Ⅰ期臨床研究的1類新藥，LPM7100328具有良好的臨床前景。

圖1 LPM7100328化學結構式Fig 1 Chemical structure of LPM7100328

在LPM7100328合成過程中，參與反應的物料以及引入的副產物未能在精制過程中隨母液去除而殘留在原料藥中，即雜質A、B、C。本研究首次建立了LPM7100328原料藥中有關物質檢查的HPLC分析方法，并針對雜質A、B、C進行了全面的方法學驗證，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

Agilent1260系列液相色譜儀（配有四元泵、自動進樣器、柱溫箱、紫外檢測器、二極管陣列檢測器和ChemStation工作站，美國Agilent公司）；XS105電子天平、S400-K pH計（梅特勒-托利多公司）；SK7210HP超聲波清洗器（上?？茖С晝x器有限公司）。

LPM7100328原料藥（批號：2209281、2209282、2209283）、LPM7100328對照品（批號：2203301，純度：99.2%）、雜質A對照品（批號：2200517，純度：95.2%）、雜質B對照品（批號：2200621，純度：98.8%）、雜質C對照品（批號：2204301，純度：98.9%）（山東綠葉制藥有限公司）；乙腈、甲醇均為色譜純；水為純化水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：ACE Excel Super C18（4.6 mm×150 mm，3 μm），雜質捕集小柱：Welch C18（4.6 mm×50 mm）；流動相A為0.01 mol·L－1磷酸二氫鉀水溶液（用磷酸調節(jié)pH值至2.5），流動相B為甲醇-乙腈（20∶80）；流速：1.0 mL·min－1；柱溫：40℃；檢測波長：248 nm；進樣量：5 μL；梯度洗脫，洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution program

2.2 溶液配制

2.2.1 溶劑 以0.1%磷酸水溶液-乙腈（1∶1）為溶劑，將溶劑作為空白對照溶液。

2.2.2 對照品溶液 取LPM7100328對照品約12.5 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加適量溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，得對照品儲備液；精密量取對照品儲備液0.5 mL置50 mL量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 雜質對照品儲備液 分別取雜質A、B、C對照品約10 mg、15 mg和25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加適量溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 系統(tǒng)適用性溶液 取LPM7100328對照品約25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加適量溶劑溶解，加入雜質對照品儲備液0.5 mL，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.5 供試品溶液 取LPM7100328原料藥約25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加適量溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

取“2.2”項下空白對照溶液和系統(tǒng)適用性溶液，進樣測定，記錄色譜圖，見圖2。空白對照溶液無干擾，系統(tǒng)適用性溶液中各色譜峰間分離度均大于1.5，各雜質均能得到良好分離。

2.4 強制降解試驗

稱取LPM7100328原料藥（批號：2209281）約20 mg于10 mL量瓶中，共8份，分別進行以下試驗。

① 未破壞：加適量溶劑超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得；② 酸破壞：加4 mL溶劑超聲溶解，加1 mol·L－1鹽酸溶液1 mL，80℃烘箱中放置30 min，冷卻，用1 mol·L－1氫氧化鈉溶液中和，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得；③ 堿破壞：加4 mL溶劑超聲溶解，加0.25 mol·L－1氫氧化鈉溶液1 mL，室溫放置10 min，用0.25 mol·L－1鹽酸溶液中和，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得；④ 氧化破壞：加適量溶劑超聲溶解，加3.0%的過氧化氫溶液1 mL，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，80℃烘箱中放置24 h，冷卻，即得；⑤ 固體高溫破壞：封口置于80℃烘箱中，10 d后取出，冷卻，加適量溶劑超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得；⑥ 液體高溫破壞：加適量溶劑超聲溶解，80℃烘箱中放置24 h，冷卻，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得；⑦ 高濕破壞：開口置于相對濕度為92.5%的干燥器內，10 d后取出，加適量溶劑超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得；⑧ 光照破壞：在（4500±500）lx照度下放置10 d后取出，加適量溶劑超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

通過考察LPM7100328的降解途徑及雜質峰（尤其是降解雜質）與主峰的分離度，驗證該方法的專屬性[13]。取上述破壞溶液進樣分析，記錄色譜圖，結果見圖3。LPM7100328在酸、堿、氧化和液體高溫破壞條件下不穩(wěn)定，在其他條件下具有一定的穩(wěn)定性。在各降解條件下雜質峰及主峰均能得到良好的分離，主峰純度均大于0.990；物料守恒均在98%～101%，表明該方法具有良好的專屬性。

圖3 LPM7100328強制降解試驗色譜圖Fig 3 HPLC chromatograms of forced degradation tests of LPM7100328

2.5 檢測限與定量限試驗

取雜質A、B、C對照品各約2.5 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加適量溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為定量限雜質儲備液，取定量限雜質儲備液和“2.2.2”項下對照品溶液配制定量限溶液（相當于0.05%供試品溶液濃度），平行配制6份，依法進樣，計算信噪比（S/N）及峰面積RSD值，以S/N≥10為定量限，結果LPM7100328及雜質A、B、C的定量限分別為0.2486、0.2380、0.2468、0.2471 μg·mL－1。

取定量限溶液3 mL置10 mL量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，依法進樣分析，記錄色譜圖，以S/N≥3為檢測限，結果LPM7100328及雜質A、B、C的檢測限分別為0.0746、0.0714、0.0740、0.0741 μg·mL－1，表明本方法靈敏度良好。

2.6 線性關系考察

分別配制LPM7100328及各雜質限度濃度為50%、100%、150%、200%和定量限濃度的線性溶液，進樣測定，記錄色譜圖。以LPM7100328及雜質A、B、C的質量濃度（X）為橫坐標，其對應的峰面積（Y）為縱坐標，進行線性回歸，并按F＝k主/k雜計算雜質A、B、C的校正因子，結果如表2所示。

表2 線性試驗結果Tab 2 Linearity test

2.7 準確度試驗

取LPM7100328原料藥（批號：2209281）25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶，加適量溶劑溶解后，分別加入定量限雜質儲備液0.5 mL、雜質對照品儲備液0.5、0.75 mL，制成LOQ（n＝3）、100%（n＝6）、150%（n＝3）各雜質限度水平的加標溶液，進樣測定，計算平均回收率。雜質A、B、C的平均回收率范圍為97.0%～107.1%，RSD為2.2%～4.7%，表明該方法準確度良好。

2.8 精密度試驗

2.8.1 重復性試驗 取“2.7”項下限度濃度為100%的6份準確度溶液作為重復性溶液，進樣測定，計算各雜質及總雜含量的RSD。結果顯示，雜質A、B、C及最大未知單雜含量的RSD分別為2.5%、0.90%、1.1%、0%，總雜含量的RSD為0.60%，表明該方法重復性良好。

2.8.2 中間精密度試驗 兩人分別取同一批LPM7100328原料藥樣品，按“2.7”項下方法平行配制6份100%濃度的加標供試品溶液，于同一實驗室不同日期，按“2.1”項下色譜條件在不同儀器上分別進樣測定，并計算各雜質及總雜含量的RSD。結果雜質A、B、C及最大未知單雜含量的RSD分別為8.4%、0.90%、1.8%、0%，總雜含量的RSD為1.3%，表明本方法可滿足精密度要求。

2.9 穩(wěn)定性試驗

取LPM7100328原料藥（批號：2209281）約25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加適量溶劑溶解，加入雜質對照品儲備液0.5 mL，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得加標供試品溶液；將加標供試品溶液和“2.2.2”項下對照品溶液室溫下放置72 h，分別于0、12、24、48、72 h進樣測定，記錄色譜圖，并計算LPM7100328及各雜質與0 h相比的峰面積回收率。結果表明，72 h內LPM7100328回收率在99.6%～100.6%，雜質A、B、C和未知單雜的回收率在98.5%～112.3%，且無其他雜質產生。表明對照品溶液及加標供試品溶液室溫放置72 h內穩(wěn)定。

2.10 耐用性試驗

按“2.2.5”項下方法配制供試品溶液，分別考察適當調節(jié)流動相pH（±0.2）、柱溫（±2℃）、有機相組成比例（±5%）以及不同儀器對LPM7100328與雜質分離效果及樣品含量測定的影響。結果表明，在不同色譜條件下，各色譜峰間分離度均大于1.5，各有關物質的檢出情況基本無變化，表明該方法耐用性良好。

2.11 樣品含量測定

取3批LPM7100328原料藥，按“2.2.5”項下方法配制供試品溶液，進樣測定，記錄色譜圖，按加校正因子的主成分自身對照法計算雜質A、B、C含量，未知雜質含量按不加校正因子的主成分自身對照法計算，結果如表3所示。雜質A、B、C，其他最大單雜及總雜檢出量均符合限度標準（雜質A限度為0.20%，雜質B限度為0.30%，雜質C限度為0.50%，其他單雜限度為0.50%，總雜限度為1.5%）。

表3 有關物質的含量(%)Tab 3 Content of related substances (%)

3 討論

用二極管陣列檢測器（DAD）對各個物質在200～400 nm內進行掃描，結果表明，主成分及已知雜質的吸收峰均在228 nm及248 nm附近，各已知雜質在248 nm波長下紫外吸收較強且基線平穩(wěn)。最終選擇248 nm作為LPM7100328有關物質的檢測波長。

本研究對流動相進行了優(yōu)化，嘗試了磷酸水-乙腈、磷酸緩沖鹽-乙腈、磷酸緩沖鹽-乙腈-甲醇的流動相體系，篩選并優(yōu)化了體系中各流動相組分的組成及比例，考察了LPM7100328及其有關物質的分離度、峰形和保留時間，最終確定的流動相A為0.01 mol·L－1磷酸二氫鉀水溶液（用磷酸調節(jié)pH值至2.5），流動相B為乙腈-甲醇（80∶20）。

為了更好地分離主峰與其相鄰雜質峰，本試驗選擇了Waters XBridge C18（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）（Ⅰ）、YMC Triart C18（3 mm×150 mm，3 μm）（Ⅱ）和ACE Excel Super C18（4.6 mm×150 mm，3 μm）（Ⅲ）3根不同型號的色譜柱。相較于色譜柱Ⅰ和Ⅱ，色譜柱Ⅲ具有主峰與其相鄰雜質峰的分離情況最佳以及主峰保留時間最穩(wěn)定的優(yōu)勢，最終選擇ACE Excel Super C18（4.6 mm×150 mm，3 μm）為色譜柱，并使用了Welch C18雜質捕集小柱，有效地排除了空白溶劑的干擾，提高了分析結果的準確度[14]。

LPM7100328為正處于Ⅰ期臨床研究的1類新藥，本研究首次建立了一種LPM7100328原料藥中有關物質測定的HPLC分析方法，并對其進行了全面的方法學驗證，結果表明該方法專屬性好，靈敏度高，可實現(xiàn)LPM7100328中有關物質的有效分離，為LPM7100328質量控制提供參考。