羅沙司他對(duì)CKD大鼠腸生物屏障功能的影響*

何荃 渠寧 雷子彤 陳蕾 蔣紅利 劉華

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院重癥腎臟病·血液凈化科,陜西 西安 710061)

目前越來越多的證據(jù)表明,腸道菌群參與了慢性腎臟病的進(jìn)展以及并發(fā)癥的發(fā)生,包括腸屏障功能的維持,而慢性腎臟病(Chronic renal disease,CKD)狀態(tài)下腸道菌群發(fā)生了明顯的失調(diào)[1],在早期CKD患者中就可以觀察到腸道細(xì)菌的定量和定性發(fā)生變化[2]。因此,腸道菌群的變化與腸屏障功能息息相關(guān)[3]。在CKD中恢復(fù)腸道菌群的共生關(guān)系,減少尿毒癥毒素、氧化應(yīng)激和炎癥的產(chǎn)生很有必要[4]。缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)的破壞可導(dǎo)致緊密連接蛋白表達(dá)的降低和腸上皮通透性的增加,因此防止HIF-1α的降低可能是維持上皮屏障功能的一種潛在途徑[5-6]。羅沙司他是一種用于穩(wěn)定HIF的脯氨酸羥化酶抑制劑,既往研究[7]多是在治療腎性貧血方面,而羅沙司他對(duì)CKD狀態(tài)下腸屏障功能的影響目前尚少有研究。因此,本研究探究羅沙司他是否可以改善CKD腸屏障功能,明確羅沙司他調(diào)控腸屏障功能的機(jī)制,為羅沙司他在腸道保護(hù)方面的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)(無特殊病原體)成年健康雄性SD大鼠,體重180～220 g,購買于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[SCXK(陜)2018-001]。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵照國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)與使用指南。飼養(yǎng)于清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物飼養(yǎng)室,12 h明暗循環(huán),所有大鼠給予普通標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng),自由攝食和飲水,溫度(25±2)℃,濕度50%～70%。本研究嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用指南的標(biāo)準(zhǔn),經(jīng)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(項(xiàng)目號(hào):XJTULAC2019-1274)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及藥物 羅沙司他(琺博進(jìn)醫(yī)藥技術(shù)開發(fā)有限公司,中國)溶液配置:低劑量溶液,150 mg膠囊內(nèi)粉末,加入雙蒸水,定容至20 mL;高劑量溶液,150 mg膠囊內(nèi)粉末,加入雙蒸水,定容至15 mL,現(xiàn)配現(xiàn)用。大鼠IL-6、TNF-α、鐵調(diào)素ELISA試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司。HE染液、Masson染液套裝購自武漢Servicebio公司。16SrRNA測(cè)序所需DNeasy PowerSoil Kit、QIAamp 96 PowerFecal QIAcube HT kit(德國QIAGEN公司)、Qubit dsDNA Assay Kit(美國Thermo Fisher Scientific公司)、Tks Gflex DNA Polymerase(日本Takara公司)。

1.3 方法

采用5/6腎切除術(shù)構(gòu)建CKD大鼠模型,檢測(cè)腎功能確定造模成功后分組給予高低劑量羅沙司他灌胃;給藥后檢測(cè)Scr、BUN及Hb;收集腎臟標(biāo)本,用HE和Masson染色觀察腎臟病理表現(xiàn);ELISA法檢測(cè)血清炎癥因子TNF-α、IL-6和血清鐵調(diào)素水平;對(duì)大鼠糞便樣本進(jìn)行16S rRNA微生物組測(cè)序,分析腸道微生物組成改變。

1.3.1 建模及分組 選取SPF級(jí)SD大鼠22只,自由飲水和攝食,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,適應(yīng)動(dòng)物房環(huán)境并且無異常發(fā)現(xiàn)后開始建立動(dòng)物模型。大鼠隨機(jī)先分為假手術(shù)組(Sham組,n=4)、腎切組(5/6腎切除,n=18)。腎切組大鼠以2%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后,常規(guī)固定、消毒。首先在左側(cè)腎區(qū)作一長約2 cm的縱行切口,暴露左腎并分離腎周脂肪囊,分離出腎動(dòng)脈及其分支,切除2/3腎組織,逐層縫合切口。一周后右腎區(qū)作一長約2 cm縱行切口,暴露右腎分離出右腎蒂,結(jié)扎并摘除右腎。Sham組只進(jìn)行血管分離而不進(jìn)行結(jié)扎或右腎切除。術(shù)后各組大鼠自由飲水?dāng)z食。20周后各組大鼠眼內(nèi)眥靜脈采血測(cè)定大鼠腎功能及血紅蛋白,評(píng)估腎切組大鼠模型構(gòu)建情況。評(píng)估過腎切組模型成功后,將腎切組大鼠隨機(jī)分為CKD組(n=6)、 CKD+羅沙司他低劑量(7.5 mg/kg, tiw)灌胃組(CKD-LOW組,n=6)、 CKD+羅沙司他高劑量(10 mg/kg, tiw)灌胃組(CKD-HIGH組,n=6)。每周1、3、5固定時(shí)間進(jìn)行大鼠灌胃,共6周。Sham組及CKD組大鼠同時(shí)灌胃雙蒸水1 mL。

1.3.2 血清及腎臟組織標(biāo)本采集與檢測(cè) 2%戊巴比妥鈉溶液(30 mg/kg)腹腔注射麻醉,取材并處死大鼠。標(biāo)本采集過程嚴(yán)格無菌操作。腹主動(dòng)脈采血:大鼠麻醉后仰位固定,打開暴露腹腔,將腸管移開,用紗布擦拭分離腰椎旁的脂肪,即可見腹主動(dòng)脈。以動(dòng)脈夾夾住近心端,選取5 mL 注射器刺入,用鑷子夾住針頭,松開動(dòng)脈夾,即可抽血。根據(jù)大鼠的體重可采至少6～10 mL血。委托金域醫(yī)學(xué)檢測(cè)各組大鼠血紅蛋白、尿素氮和肌酐水平。血紅蛋白采用比色法檢測(cè)、尿素氮及肌酐均采用酶法檢測(cè)。采用ELISA檢測(cè)IL-6、TNF-α、鐵調(diào)素水平。按照試劑盒說明書操作。逐層打開腹腔,充分暴露一側(cè)腎臟,以縫線結(jié)扎腎蒂后摘取腎臟。取 2 cm×0.2 cm×0.2 cm腎組織以 4%多聚甲醛固定,4 ℃固定過夜,后包埋成石蠟標(biāo)本,后續(xù)對(duì)蠟塊進(jìn)行切片,行HE及馬松三色(Masson)染色。剩余腎臟組織置于凍存管內(nèi),標(biāo)記后置于液氮(-190 ℃)中凍存過夜,后轉(zhuǎn)存于-80 ℃冰箱中長期保存用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 蛋白免疫印跡(Western Blotting) 腎組織(40 μg)在含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液中冰上勻漿,4℃離心,取上清提取總蛋白。用BSA測(cè)定試劑盒(USA)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后,每個(gè)樣品的等量蛋白質(zhì)用10% SDS-PAGE在70 V下分離30 min,然后用110 V分離到底。將分離蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Millipore, USA)上。將PVDF膜與一抗(Abcam Technology,UK:TGF-β1,1:10 00;α-SMA,1:10 00;β-actin,1:2000)在4 ℃下孵育過夜,然后與相應(yīng)HRP標(biāo)記的二抗在室溫下孵育1 h。用化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測(cè)系統(tǒng)(Pierce, Rockford IL,USA)檢測(cè)蛋白含量。檢測(cè)到的蛋白濃度以β-actin的比值表示。采用ImageJ軟件分析印跡濃度。

1.3.4 糞便標(biāo)本采集及基因組DNA提取 2%戊巴比妥鈉溶液(30 mg/kg)腹腔注射麻醉,取材并處死大鼠。標(biāo)本采集過程嚴(yán)格無菌操作。在暴露的腹腔組織中,找到回盲部,向下找到結(jié)腸,從直腸上面的結(jié)腸中取出1～2粒大鼠糞便,置于無菌凍存管內(nèi),標(biāo)記后置于液氮(-190 ℃)中凍存,后轉(zhuǎn)存于-80 ℃冰箱用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用DNA抽提試劑盒對(duì)樣本的基因組DNA進(jìn)行提取,之后利用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop2000檢測(cè)DNA的濃度。以基因組DNA為模板,根據(jù)測(cè)序區(qū)域的選擇,使用帶barcode的特異引物,Takara公司的Tks Gflex DNA Polymerase進(jìn)行PCR,確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。細(xì)菌多樣性鑒定對(duì)應(yīng)區(qū)域:16S V3-V4 區(qū)(引物343F和798R)。PCR產(chǎn)物使用電泳檢測(cè),檢測(cè)后使用磁珠純化,純化后作為二輪PCR模板,并進(jìn)行二輪PCR擴(kuò)增,并再次使用電泳檢測(cè),檢測(cè)后使用磁珠純化,純化后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行Qubit定量。根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣,并上機(jī)測(cè)序。引物序列,見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3.5 信息分析流程 將以上步驟得到的擴(kuò)增產(chǎn)物定量混樣,在Illumina NovaSeq 6000設(shè)備上機(jī)測(cè)序,得到原始測(cè)序序列。原始數(shù)據(jù)以FASTQ格式存儲(chǔ)。使用Trimmomatic軟件對(duì)原始雙端序列進(jìn)行去雜。去雜參數(shù)為:檢測(cè)并截去模糊堿基N;使用滑窗法檢查平均堿基質(zhì)量,當(dāng)質(zhì)量低于20時(shí),截取前面高質(zhì)序列。去雜后的雙端序列利用FLASH軟件進(jìn)行拼接,參數(shù)為:最小的overlap為10 bp、最大的Overlap為200 bp、最大錯(cuò)配率為20%。為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性,可進(jìn)行精準(zhǔn)去雜,去除含有模糊堿基、單堿基高重復(fù)區(qū)的序列以及長度過短的序列。精準(zhǔn)去雜的參數(shù)為:去掉含有N堿基的序列,保留堿基質(zhì)量分?jǐn)?shù)Q20達(dá)到至少75%的序列。同時(shí),利用UCHIME檢測(cè)并去除序列中的嵌合體序列。測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理生成優(yōu)質(zhì)序列之后,采用Vsearch軟件,根據(jù)序列的相似性,按照97%的相似度進(jìn)行OTU分類,并選取每個(gè)OTU中豐度最大的序列作為該OTU的代表序列,采用RDP classifier Naive Bayesian分類算法對(duì)代表序列與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)注釋,得到OTU的注釋信息。16S使用Greengenes或者Silva(version123)數(shù)據(jù)庫比對(duì),保留置信區(qū)間大于0.7的注釋結(jié)果。按照最小深度對(duì)所有樣本隨機(jī)抽取,完成數(shù)據(jù)的均一化處理,得到抽齊后的OTU表格。統(tǒng)計(jì)各樣本中微生物群落在各分類水平,包括kingdom(界)、phylum(門)、class(綱)、order(目)、family(科)、genus(屬)、species(種)的組成與豐度。根據(jù)聚類結(jié)果,對(duì)糞便菌群進(jìn)行物種多樣性(α多樣性、β多樣性)、物種分類學(xué)組成、差異物種篩選、代謝功能預(yù)測(cè)等進(jìn)一步分析。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 CKD組大鼠出現(xiàn)多尿、多飲,精神萎靡,并逐漸出現(xiàn)食物攝入量明顯減少,體重下降、體重增長緩慢,毛發(fā)豎立、毛色干燥、枯黃無光澤,口唇顏色蒼白,目色淡紅,耳廓濕冷,性情淡漠、易激、身體蜷縮、活動(dòng)度減少等。5/6腎切除慢性腎臟病模型建立及給藥過程中大鼠死亡4只。20周后大鼠眼內(nèi)眥靜脈取血檢測(cè)腎功能,大鼠血BUN、SCr是對(duì)照組的2～3倍即判定為造模成功。在腎切組模型成功的基礎(chǔ)上,構(gòu)建羅沙司他給藥組模型。

2.2 各組大鼠腎功能及Hb檢測(cè)結(jié)果 與Sham組相比,其他3組大鼠Scr及BUN水平顯著增高(P<0.05);CKD-HIGH組大鼠的BUN、SCr水平低于CKD-LOW組(均P<0.05);CKD-HIGH組大鼠的BUN、SCr水平低于CKD組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與Sham組相比,CKD組大鼠Hb顯著降低,CKD-LOW組及CKD-HIGH組大鼠Hb較CKD組均顯著升高(P<0.05),CKD-LOW組及CKD-HIGH組Hb差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠給藥后腎功能及血紅蛋白Figure 1 Renal function and hemoglobin of rats in each group after administration注:A.各組大鼠SCr;B.各組大鼠BUN;C.各組大鼠Hb。組間比較,①P<0.05;②P<0.01;③P<0.001。

2.3 腎臟組織病理學(xué)改變 CKD組腎臟組織發(fā)生明顯病理改變,腎小球結(jié)構(gòu)紊亂、腎小球硬化、系膜增生、腎小管廣泛擴(kuò)張、腎小管上皮細(xì)胞脫落、腎間質(zhì)纖維化、大量炎癥細(xì)胞浸潤;CKD-LOW組也發(fā)生了病理改變,但是其腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化的程度明顯輕于CKD組;CKD-HIGH組的病理改變最輕,腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化及腎小管擴(kuò)張的程度進(jìn)一步降低(見圖2A)。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示CKD組大鼠腎間質(zhì)纖維化指標(biāo)α-SMA, TGF-β1表達(dá)顯著增加(P<0.001),CKD-LOW組和CKD-HIGH組的表達(dá)則顯著被抑制(P<0.01),見圖2B。

圖2 各組大鼠腎臟組織病理染色及蛋白免疫印跡結(jié)果Figure 2 Pathological staining of kidney tissue in each group of rats and Western blotting results注:A.各組大鼠腎臟組織病理染色;B.蛋白免疫印跡結(jié)果。a、b、c、d.各組大鼠腎臟病理H&E染色改變(HE,200×);e、f、g、h.各組大鼠腎臟病理Masson染色改變(Masson,200×)。黑色細(xì)箭頭示腎小球結(jié)構(gòu);黃色寬箭頭示腎間質(zhì);黑色小三角示增生的膠原纖維組織。組間比較,①P<0.05;②P<0.01;③P<0.001。

2.4 血清炎癥因子及鐵調(diào)素檢測(cè) 與Sham組相比,CKD組血清IL-6、TNF-α、血清鐵調(diào)素水平均顯著升高,CKD-HIGH組IL-6、TNF-α較CKD組顯著降低(均P<0.05);CKD-LOW組IL-6較CKD組顯著降低(P<0.05),TNF-α僅有降低趨勢(shì)(P>0.05);CKD-LOW組與CKD-HIGH組間IL-6、TNF-α水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);CKD-HIGH組和CKD-LOW組較CKD組血清鐵調(diào)素水平顯著降低(均P<0.05),CKD-HIGH組和CKD-LOW組組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠血清IL-6、TNF-α、鐵調(diào)素水平Figure 3 IL-6, TNF-α and hepcidin levels in four groups注:A.血清IL-6水平;B.血清TNF-α水平;C.血清鐵調(diào)素水平。組間比較,①P<0.05;②P<0.01;③P<0.001。

2.5 16S rRNA測(cè)序結(jié)果

2.5.1 腸道菌群OUT聚類分析 各組腸道微生物組成具有顯著差異,4組樣本共有376個(gè)重疊的OUT,Sham組、CKD組、CKD-LOW組及CKD-HIGH組分別獨(dú)有202、302、290及64個(gè)OUT,見圖4。

圖4 花瓣圖與韋恩圖Figure 4 Flower blot and Venn blot in four groups

2.5.2 α多樣性分析 與Sham組相比,CKD組的PD_whole_tree指數(shù)顯著升高(P<0.05),而Chao1、Shannon、Simpson指數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);其他各組間多樣性指數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但是Chao1、Shannon、PD_whole_tree指數(shù)在CKD組有相對(duì)Sham組的上升趨勢(shì),給藥組相對(duì)CKD組有降低趨勢(shì)。結(jié)果提示羅沙司他對(duì)腸道菌群α多樣性影響較小。見表2。

表2 各組大鼠α多樣性指數(shù)結(jié)果Table 2 α Diversity index results of rats in each group

2.5.3 β多樣性分析 PCA分析顯示, CKD組和Sham組在PC2水平上呈明顯分開,表明CKD組大鼠腸道菌群組成結(jié)構(gòu)較Sham組有改變且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而給藥后CKD-LOW組及CKD-HIGH組在PC2水平上均偏離CKD組且向Sham組靠近(見圖5A)。采用ANOSIM方法分析,基于unweighted unifrac算法,PCoA分析也顯示四個(gè)組的腸道菌群組成差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.4232,P=0.001),提示樣品組間差異突出而組內(nèi)的差異性較低,分組效果較好,見圖5B。

圖5 β多樣性分析Figure 5 β diversity analysis注:A.PCA分析;B.基于unweighted unifrac距離的三維PCoA分析。

2.5.4 菌落組成分析 在門水平上,各組大鼠腸道菌群包括擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、螺旋體門(Spirochaete)、埃普西隆桿菌門(Epsilonbacteraeota)等主要門類。其中,擬桿菌門和厚壁菌門占到菌門的85%以上。各組大鼠腸道菌群中厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門為優(yōu)勢(shì)菌門,除此以外,CKD-HIGH組螺旋體門豐度較大,其余組別埃普西隆桿菌門豐度較大。CKD組厚壁菌門比例較Sham組升高,擬桿菌門比例下降,厚壁菌門與擬桿菌門比值(Firmicutes/Bacteroidetes,F/B)也呈上升趨勢(shì),CKD-LOW及CKD-HIGH組,F/B值進(jìn)一步上升。見圖6。

圖6 各組厚壁菌門與擬桿菌門比值Figure 6 Firmicutes/Bacteroidetes (F/B) ratio in each group

在屬水平上,各組大鼠腸道菌群主要包括普雷沃氏菌屬(Prevotella-9)、擬桿菌屬(Bacteroides)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、擬普雷沃氏菌屬(Alloprevotella)、毛螺菌屬(Lachnospiraceae)、瘤胃球菌屬(Ruminococcaceae)、玫瑰菌屬(Roseburia)等。優(yōu)勢(shì)菌屬為普雷沃氏菌屬、擬桿菌屬、乳酸桿菌屬及Alloprevotella菌屬。用T test算法統(tǒng)計(jì)組間差異顯著性的物種。與Sham組相比,CKD組共0個(gè)門、0個(gè)綱、3個(gè)目、6個(gè)科的物種豐度存在顯著性差異(均P<0.05);共19個(gè)屬存在顯著差異,其中相對(duì)豐度靠前的片球菌屬(Pediococcus)、果膠桿菌屬(Pectobacterium)、Ruminiclostridium_5菌屬在CKD組降低(均P<0.05);而Coprococcus_3菌屬、弧菌屬(Vibrio)、消化球菌屬(Peptococcus)、里克內(nèi)拉菌屬(Rikenella)、Delftia菌屬等在CKD組富集。與Sham組相比,相對(duì)豐度靠前的屬中有3個(gè)菌屬在CKD組中豐度降低,且經(jīng)羅沙司他干預(yù)后,豐度升高(均P<0.05),包括Pediococcus、Pectobacterium和Blautia菌屬;有3個(gè)菌屬在CKD組中豐度升高,經(jīng)羅沙司他干預(yù)后,豐度降低(均P<0.05),包括弧菌屬、Delftia菌屬和Pseudomonas菌屬。見圖7。

圖7 組間差異顯著的菌種Figure 7 Bacteria with significant differences between groups 注:組間比較,①P<0.05;②P<0.01;③P<0.001;④P<0.0001。

3 討論

在CKD狀態(tài)下,腸道菌群紊亂產(chǎn)生多種代謝毒素,通過受損的腸道屏障進(jìn)入循環(huán),促進(jìn)心血管和腎臟損害,進(jìn)一步加劇CKD進(jìn)展,與臨床不良預(yù)后密切相關(guān)?；谀c與腎的這些聯(lián)系, “腸-腎軸”理論形成。腸屏障是該理論的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,目前對(duì)于CKD腸屏障損傷的治療尚少研究[8]。據(jù)文獻(xiàn)[9]報(bào)道,HIF-1α信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)維持腸道屏障和免疫反應(yīng)具有重要作用,而用于穩(wěn)定HIF-1α的脯氨酰羥化酶抑制劑和低氧誘導(dǎo)因子脯氨酰羥化酶2(HPH-2)抑制劑已被證明在幾種炎癥性腸病模型中具有保護(hù)作用。由于CKD腸屏障損傷和炎癥性腸病表現(xiàn)的相似性,認(rèn)為脯氨酰羥化酶抑制劑羅沙司他或許也具有腸屏障保護(hù)作用。為驗(yàn)證這一假設(shè),我們構(gòu)建了CKD大鼠模型并進(jìn)行了羅沙司他給藥。

本研究中羅沙司他高劑量給藥組大鼠的BUN、SCr與CKD組相比有降低趨勢(shì);在腎臟組織病理圖片上也可以發(fā)現(xiàn)同樣的結(jié)果,腎切組大鼠腎臟組織均有腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化、腎小管擴(kuò)張等病理改變,但是CKD組病理改變最重,而羅沙司他高劑量給藥組最輕,各組TGF-β1、α-SMA表達(dá)趨勢(shì)與病理改變一致,這提示羅沙司他或許可以延緩CKD進(jìn)展。目前已有文獻(xiàn)[10]報(bào)道了HIF-PHDs抑制劑在急性和慢性腎臟疾病中的作用:羅沙司他預(yù)處理可以激活HIF-1α和核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2(Nrf2),減少葉酸誘導(dǎo)的急性腎損傷早期的鐵死亡,并延緩纖維化進(jìn)展;在缺血再灌注誘導(dǎo)的急性腎損傷小鼠模型中,羅沙司他預(yù)處理通過減弱炎癥反應(yīng)顯著緩解腎損傷;在腺嘌呤誘導(dǎo)的腎病模型中羅沙司他也有類似的減毒作用,這與我們的結(jié)果一致。

炎癥因子的異常表達(dá)可破壞腸道內(nèi)局部免疫的平衡,激活腸黏膜固有層淋巴細(xì)胞,引起促炎因子如TNF-α等的生成增加,部分炎癥因子又可促進(jìn)其他炎性介質(zhì)的釋放,進(jìn)一步引起或加重腸道炎癥反應(yīng)及腸組織破壞。HIF通路能激活免疫細(xì)胞中的適應(yīng)性反應(yīng),對(duì)炎癥期間上皮和免疫細(xì)胞的功能和發(fā)育產(chǎn)生強(qiáng)烈影響[11]。HIF-1α在所有免疫細(xì)胞中都有表達(dá),而HIF-2α的表達(dá)模式僅限于幾種亞型。據(jù)報(bào)道[12],HIF-1α能直接調(diào)節(jié)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的產(chǎn)生;葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型中,HIF-1α的缺失增加IL-6和IL-23的產(chǎn)生,導(dǎo)致腸道炎癥加重[13];而羥化酶抑制劑可通過穩(wěn)定HIF-1α顯著降低結(jié)腸炎小鼠模型疾病嚴(yán)重程度和炎癥標(biāo)志物 IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α的水平。本研究結(jié)果表明羅沙司他可降低CKD大鼠血清炎癥因子的水平,改善微炎癥狀態(tài),或可有益于CKD腸道健康。

鐵調(diào)素[14]在炎癥性貧血的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用,并且由于腎臟清除率降低和尿毒癥物質(zhì)的存在,在CKD患者中升高[15];本研究中同樣發(fā)現(xiàn)在給予羅沙司他后,高低劑量組血清鐵調(diào)素呈劑量依賴性降低,提示羅沙司他可以明顯降低循環(huán)鐵調(diào)素濃度,改善鐵代謝,且與給藥劑量有關(guān)。研究[16]發(fā)現(xiàn),CKD患者的雙歧桿菌科定植率較低,主要是雙歧桿菌、乳桿菌科、擬桿菌科和普氏菌屬,而腸桿菌科的腸道水平較高,尤其是腸桿菌、克雷伯氏菌和埃希氏菌,腸球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的水平也升高。本研究發(fā)現(xiàn),與假手術(shù)組相比,CKD組大鼠α多樣性有差異變化,代表菌群豐富度及多樣性的Chao1、Shannon、PD_whole_tree指數(shù)呈上升趨勢(shì),盡管統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著,可以看出CKD組大鼠腸道菌群存在過度生長態(tài)勢(shì)。而給予羅沙司他干預(yù)后,以上各項(xiàng)α多樣性指數(shù)出現(xiàn)了下降趨勢(shì)。提示CKD組腸道菌群物種多樣性增加,羅沙司他給藥限制了這種變化;而也有一些研究發(fā)現(xiàn)CKD時(shí)腸道菌群的豐富度及多樣性降低,出現(xiàn)差異可能與不同研究的樣本量、菌群檢測(cè)方法及環(huán)境的影響等有關(guān)。進(jìn)一步分析各組大鼠腸道菌群β多樣性發(fā)現(xiàn),CKD組大鼠腸道菌群組成結(jié)構(gòu)較假手術(shù)組有顯著差異,而羅沙司他給藥后菌群組成偏離CKD組且向假手術(shù)組靠近。進(jìn)一步分析各組大鼠腸道菌群物種發(fā)現(xiàn),與假手術(shù)組相比,CKD組大鼠門水平、屬水平部分腸道菌群組成發(fā)生明顯變化。如在門水平上,CKD組厚壁菌門Firmicutes比例較假手術(shù)組升高,擬桿菌門Bacteroidetes比例下降,F/B數(shù)值上升;羅沙司他給藥后F/B值仍持續(xù)上升。在屬水平上,CKD組大鼠腸道菌群組成也發(fā)生明顯變化。各組大鼠均具有差異性菌屬,假手術(shù)組的差異菌屬多為有益菌;CKD組的差異菌屬多為條件致病菌;羅沙司他給藥后則有益菌所占比例上升,條件致病菌所占比例下降。在相對(duì)豐度排名比較靠前的菌屬中,CKD組片球菌屬、果膠桿菌屬和Blautia菌屬較假手術(shù)組豐度降低,經(jīng)羅沙司他干預(yù)后,豐度呈不同程度回升;弧菌屬、Delftia菌屬和Pseudomonas菌屬豐度升高,經(jīng)羅沙司他干預(yù)后,豐度呈不同程度降低。以上結(jié)果表明,羅沙司他可調(diào)控CKD大鼠腸道菌群物種多樣性及組成,而上述菌屬可能是其主要調(diào)控的菌屬種類。片球菌屬及乳桿菌科,在免疫調(diào)節(jié)、腸道上皮屏障完整性維持、抗氧化能力方面具有促進(jìn)健康和預(yù)防疾病的功能,根據(jù)分類學(xué)和物種水平的適當(dāng)鑒定,片球菌屬已被認(rèn)為是安全的,是益生菌的一種[17]。果膠桿菌屬,被認(rèn)為是有益的[18]。Blautia菌屬通過上調(diào)腸道調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和產(chǎn)生SCFAs,在維持腸道環(huán)境平衡和預(yù)防炎癥方面發(fā)揮重要作用[19];研究發(fā)現(xiàn)炎癥性腸病患者盲腸黏膜菌群Blautia菌屬的豐度顯著低于正常人。CKD所導(dǎo)致的腸道菌群變化,會(huì)增加腸源性毒素的產(chǎn)生并改變腸上皮屏障,進(jìn)而導(dǎo)致腎損傷過程加速[20]。而羅沙司他給藥增加了3種有益菌的豐度,因此我們認(rèn)為這種改變是有益的。

4 結(jié)論

羅沙司他干預(yù)能夠減輕腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化、腎小管擴(kuò)張的程度,或可改善腎臟損傷,延緩CKD進(jìn)展;降低CKD時(shí)升高的血清炎癥因子TNF-α和IL-6水平,改善微炎癥狀態(tài);降低了CKD時(shí)升高的鐵調(diào)素水平,改善鐵代謝,改善貧血;同時(shí)具有調(diào)節(jié)CKD大鼠腸道菌群的組成及結(jié)構(gòu),在屬水平上增加片球菌屬、果膠桿菌屬和Blautia菌屬等有益菌的豐度,減少弧菌屬、Delftia菌屬和Pseudomonas菌屬等有害菌的豐度,糾正腸道菌群紊亂狀態(tài),從而發(fā)揮腸道生物屏障功能保護(hù)作用。