基于Wnt/β-catenin 信號(hào)通路探索芪蛭通絡(luò)方對(duì)糖尿病腎病大鼠腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制

申晨卉 常蕊蕊 張 堯 楊 冰 檀 淼 唐 淼 檀金川

（1.河北中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，河北石家莊 050200；2.河北省中醫(yī)院，河北石家莊 050011；3.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，河北石家莊 050010；4.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，河北石家莊 050004）

糖尿病腎?。╠iabetic kidney disease，DKD）是由糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）遷延日久發(fā)展而來(lái)，最終可能會(huì)演變?yōu)槁阅I臟?。╟hronic kidney disease，CKD）和終末期腎臟?。╡nd stage renal disease，ESRD）[1]，對(duì)人類(lèi)健康造成了巨大的威脅。DKD的病理變化包括結(jié)節(jié)性或彌漫性腎小球硬化、腎小管炎癥、萎縮和腎間質(zhì)纖維化（renal interstial fibrosis，RIF）[2]。其中，腎間質(zhì)纖維化是DKD晚期主要的病理改變，同時(shí)也是促進(jìn)疾病進(jìn)展的一個(gè)重要因素。腎間質(zhì)纖維化是纖維化基質(zhì)的沉積和因嚴(yán)重或持續(xù)損傷而形成的疤痕[3]，持續(xù)的纖維化狀態(tài)會(huì)損害腎臟組織結(jié)構(gòu)和器官功能。DKD是一種多系統(tǒng)性疾病，其發(fā)病過(guò)程涉及多個(gè)細(xì)胞因子和分子信號(hào)通路的相互作用，其中Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號(hào)通路的異?？赡苁荄KD發(fā)生發(fā)展的重要病理機(jī)制之一，該通路在進(jìn)化上高度保守，在高糖狀態(tài)下被異常激活，加劇足細(xì)胞損傷程度，從而引起腎間質(zhì)纖維化。相關(guān)研究表明，抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活可起到延緩RIF進(jìn)展的作用[4]，從而延緩DKD進(jìn)程。

大量研究證實(shí)，中醫(yī)藥可通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路延緩腎間質(zhì)纖維化，從而發(fā)揮對(duì)DKD的治療作用[5-7]?；谮w玉庸教授提出的“腎絡(luò)瘀阻”理論[8]，河北省名中醫(yī)檀金川教授進(jìn)一步提出DKD病機(jī)總屬脾腎兩虛、濁瘀互結(jié)，并總結(jié)經(jīng)驗(yàn)方芪蛭通絡(luò)方（黃芪、燙水蛭、黨參、丹參、川芎、全蝎、地龍、茯苓、醋龜甲）以健脾補(bǔ)腎、化濁祛瘀，臨床療效顯著[9]。前期藥理研究證實(shí)，單味藥黃芪、丹參、川芎、地龍均具有抑制腎纖維化作用[10]，因此本研究觀察復(fù)方芪蛭通絡(luò)方對(duì)DKD模型大鼠腎間質(zhì)纖維化的影響，并以Wnt/β-catenin信號(hào)通路為切入點(diǎn)探究其作用機(jī)制，以為臨床運(yùn)用該方治療DKD提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料 SPF級(jí)8周齡雄性SD大鼠，體質(zhì)量為（150±20）g，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（冀）2018-004，飼養(yǎng)于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)環(huán)境：（20±2）℃，（50±10）%濕度，12 h/12 h明暗交 替，自由進(jìn)食。本研究經(jīng)河北中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)：DWLL202302010）。普通飼料，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號(hào)SCXK（冀）2018-003。高糖高脂飼料，購(gòu)自吉林賽諾生物有限公司，批號(hào)：20180819。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 芪蛭通絡(luò)方，藥物組成：黃芪25 g，燙水蛭3 g，黨參15 g，丹參12 g，川芎9 g，全蝎3 g，地龍9 g，茯苓12 g，醋龜甲15 g。使用顆粒劑，購(gòu)自廣東一方制藥有限公司，批號(hào)分別為：1109623，1110473，1092273，1101773，1104393，1102783，1106103，1101343，1055703。臨用前使用蒸餾水配制成0.1215 g/mL、0.2430 g/mL、0.4860 g/mL的溶液。厄貝沙坦片，浙江華海藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：YBH06232017，規(guī)格：75 mg/片，臨用前碾碎，溶于蒸餾水中，配制成濃度為1.4 mg/mL的混懸液。

1.3 主要試劑 鏈脲佐菌素（STZ，批號(hào)：S0103），美國(guó)Sigma-Aldrich公司；β-肌動(dòng)蛋白（actin）抗體（批號(hào)：AF7018），美 國(guó)Affinity Biosciences公 司；24 h尿蛋白定量（24 h-UTP）試劑盒（批號(hào)：C035-2-1）、肌酐測(cè)定試劑盒（批號(hào)：C011-2-1）、血尿素氮（BUN）測(cè)試盒（批號(hào)：C013-2-1），南京建成生物工程研究所；蘇木素-伊紅（HE）染色液（批號(hào)：G1120）、馬松（Masson）染色液（批號(hào)：G1340），北京索萊寶科技有限公司；一抗Wnt1試劑（批號(hào)：40023）、一 抗β-catenin試 劑（批 號(hào)42536），美 國(guó)GeneTex公 司；一 抗GSK-3β試 劑（批 號(hào)：YT2082），美 國(guó)Immunoway Biotechnology公司；一抗CTGF試劑（批號(hào)：MAB91901-100），美國(guó)R&D Systems公司；二抗（批號(hào)SC2357），美國(guó)圣克魯斯生物技術(shù)有限公司；RIPA裂解液（批號(hào)：09271919023），上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PBS緩沖液粉末（批號(hào)：19022401），北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.4 主要儀器 H-7650型透射電子顯微鏡、7170A全自動(dòng)生化分析儀，日本日立有限公司；穩(wěn)豪型血糖儀，美國(guó)強(qiáng)生有限公司；Multiskan FC型酶標(biāo)儀，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；BX53顯微鏡，日本奧林巴斯有限公司；RM-2126RT切片機(jī)，上海徠卡公司；Mini PROTEAN型電泳槽、Mini Trans-Blot電泳轉(zhuǎn)移池，美國(guó)BIO-RAD公司；Kodak Image Station 2000MM成像系統(tǒng)，美國(guó)柯達(dá)公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模與分組 SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)后予造模：高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周，禁食12 h，腹腔注射1% STZ溶液35 mg/kg，3 d后尾靜脈處取血測(cè)血糖（GLU），GLU≥16.7 mmol/L即為DM造模成功，造模成功的大鼠繼續(xù)高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周，定期測(cè)量GLU及24 h-UTP，第4周末隨機(jī)處死1只大鼠，觀察腎組織，若24 h-UTP＞30 mg，且腎組織存在病理改變，即為DKD造模成功[11]。取造模成功的大鼠50只，隨機(jī)分為模型組、厄貝沙坦組及芪蛭通絡(luò)方低、中、高劑量組，每組10只。造模同時(shí)另取10只大鼠作為正常組，予普通飼料喂養(yǎng)4周，腹腔注射等體積檸檬酸緩沖液，繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)4周。

2.2 給藥 依據(jù)人與大鼠體表面積折算法計(jì)算大鼠的藥物臨床等效劑量[12]：芪蛭通絡(luò)方低、中、高劑量組給藥劑量分別為1.215、2.430、4.860 g/kg，厄貝沙坦組給藥劑量為14 mg/kg。每日上午各給藥組大鼠按10 mL/kg的劑量分別灌胃給予相應(yīng)藥物，正常組和模型組灌胃等體積蒸餾水，每日1次，連續(xù)8周。

2.3 取材 末次給藥后約5 h處死各組大鼠。處死前1日用代謝籠收集大鼠24 h尿液用于檢測(cè)24 h-UTP；末次給藥后禁食不禁水5 h，尾靜脈取血測(cè)GLU；隨后采用異氟烷吸入的方式麻醉大鼠，于腹主動(dòng)脈處取血，分離血清置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；取出雙腎，生理鹽水沖洗后用濾紙吸干，冰上取左腎皮質(zhì)，4%多聚甲醛固定，用于HE、Masson、免疫組化（IHC）染色；右腎保存于-80 ℃冰箱擬用于蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測(cè)。

2.4 指標(biāo)檢測(cè)

2.4.1 血糖及腎功能指標(biāo)檢測(cè) 取各組大鼠血清，使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠BUN、Scr水平；尾靜脈取血，使用血糖儀測(cè)GLU；采集24 h尿液，使用雙縮脲法檢測(cè)24 h-UTP。

2.4.2 腎臟病理學(xué)檢查

2.4.2.1 HE染色觀察腎臟病理學(xué)改變 取各組大鼠部分左腎組織浸泡于4%多聚甲醛48 h，乙醇脫水，石蠟包埋，切片，經(jīng)二甲苯、無(wú)水乙醇、95%乙醇、85%乙醇進(jìn)行逐級(jí)脫蠟水化，蘇木素染色1 min，流水沖洗，1%鹽酸酒精分化，流水沖洗，1%氨水水溶液返藍(lán)，流水沖洗，伊紅染色，最后乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)改變并拍照記錄。

2.4.2.2 Masson染色觀察腎臟病理學(xué)改變 按照HE染色步驟將切片脫蠟水化，鐵蘇木素染色8 min，流水沖洗，1%鹽酸酒精分化10 s，流水沖洗返藍(lán)，麗春紅染色8 min，流水沖洗，磷鉬酸處理，苯胺藍(lán)復(fù)染，1%冰醋酸分化，最后乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)改變并拍照記錄。

2.4.3 免疫組化法檢測(cè)腎組織Wnt1、β-catenin、CTGF、GSK-3β蛋白表達(dá) 取各組大鼠部分冷凍左腎組織，切片，烤片，二甲苯及乙醇脫蠟水化，抗原修復(fù)，PBS洗滌，加入內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑，山羊血清封閉，加入一抗（1∶500），4℃孵育過(guò)夜，復(fù)溫，PBS清洗，加入二抗，37℃孵育30 min，PBS清洗，DAB避光顯色，流水沖洗，蘇木素再次染色，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片，使用Image J軟件進(jìn)行半定量分析。

2.4.4 Western blot法 檢 測(cè) 腎 組 織Wnt1、β-catenin、CTGF、GSK-3β蛋白表達(dá) 取各組大鼠右腎組織100 g，研磨均勻，置于無(wú)菌離心管中，加入RIPA裂解液，提取腎組織總蛋白，制膠、上樣、電泳、電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2 h，分別加入Wnt1抗體（1∶1000）、β-catenin抗 體（1∶1000）、CTGF抗 體（1∶2000）、GSK-3β抗 體（1∶1000）、β-actin抗 體（1∶5000），4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜后加二抗（1∶2000），室溫孵育2 h，再次洗膜，采用ECL法進(jìn)行顯色，Image J軟件分析各組條帶灰度值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 27.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。本研究所有計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），方差齊則采用Tukey法，方差不齊則采用Games-Howell檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各 組 大 鼠GLU、Scr、BUN、24 h-UTP水 平 比較 模型組大鼠GLU、Scr、BUN、24 h-UTP水平均明顯高于正常組（P＜0.01）；各給藥組大鼠上述指標(biāo)均明顯低于模型組（P＜0.01）；芪蛭通絡(luò)方中、高劑量組大鼠GLU、Scr、BUN水平均明顯低于厄貝沙坦組（P＜0.01），高劑量組24 h-UTP水平明顯低于厄貝沙坦組（P＜0.01）；芪蛭通絡(luò)方對(duì)DKD模型大鼠血糖及腎功能指標(biāo)的改善作用表現(xiàn)出一定的劑量依賴(lài)性。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠GLU、Scr、BUN、24 h-UTP水平比較（±s）

表1 各組大鼠GLU、Scr、BUN、24 h-UTP水平比較（±s）

注： 與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與厄貝沙坦組比較，ΔΔP＜0.01；與芪蛭通絡(luò)方低劑量組比較，▲▲P＜0.01；與芪蛭通絡(luò)方中劑量組比較，☆P＜0.05，☆☆P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù)/只 GLU/（mmol/L） Scr/（μmol/L） BUN/（μmol/L） 24 h-UTP/mg正常組 10 5.02±0.89 31.94±1.53 6.62±0.38 9.37±0.49模型組 10 27.65±1.73## 89.73±5.01## 10.89±0.54## 56.04±3.33##厄貝沙坦組 10 21.15±1.72##** 80.41±2.51##** 8.59±0.26##** 36.92±1.64##**芪蛭通絡(luò)方低劑量組 10 20.80±1.55##** 77.80±4.21##** 8.94±0.50##** 43.56±2.39##**ΔΔ芪蛭通絡(luò)方中劑量組 10 15.87±1.43##**ΔΔ▲▲ 55.45±0.43##**ΔΔ▲▲ 7.70±0.34##**ΔΔ▲▲ 35.37±1.15##**▲▲芪蛭通絡(luò)方高劑量組 10 14.96±1.20##**ΔΔ▲▲ 45.30±2.54##**ΔΔ▲▲☆☆ 7.33±0.39##**ΔΔ▲▲☆ 30.89±2.20##**ΔΔ▲▲☆☆

3.2 各組大鼠腎組織病理形態(tài)比較 HE染色結(jié)果顯示：正常組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)正常，形態(tài)規(guī)則，腎小管排列有序，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)遭到破壞，體積增大，大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，基底膜增厚，系膜區(qū)變寬，間質(zhì)區(qū)彌漫性水腫，腎小管擴(kuò)張；芪蛭通絡(luò)方低劑量組大鼠腎組織病理形態(tài)較模型組變化不大，腎小球體積增大，系膜區(qū)增寬，基底膜增厚，腎小管擴(kuò)張；芪蛭通絡(luò)方中、高劑量組及厄貝沙坦組大鼠腎小球體積雖有增大但較模型組減小，系膜擴(kuò)張和基底膜較模型組明顯變薄，腎小管排列相對(duì)緊密整齊，其中芪蛭通絡(luò)方高劑量組和厄貝沙坦組改善最為明顯。見(jiàn)圖1。

圖1 HE染色各組大鼠腎組織病理形態(tài)（×400）

Masson染色結(jié)果顯示：模型組大鼠腎組織藍(lán)色膠原纖維分泌增多且伴病理?yè)p傷；芪蛭通絡(luò)方低劑量組大鼠腎組織膠原纖維沉積稍有減少；芪蛭通絡(luò)方中、高劑量組及厄貝沙坦組大鼠腎組織膠原纖維明顯減少，以芪蛭通絡(luò)方高劑量組改善最為明顯。見(jiàn)圖2。

圖2 Masson染色各組大鼠腎組織病理形態(tài)（×400）

3.3 各組大鼠腎組織Wnt1、β-catenin、CTGF、GSK-3β蛋白表達(dá)比較 免疫組化法結(jié)果顯示：模型組大鼠腎組織Wnt1、β-catenin、CTGF、GSK-3β蛋白表達(dá)均明顯高于正常組（P＜0.01）；各給藥組大鼠上述指標(biāo)均明顯低于模型組（P＜0.01）；芪蛭通絡(luò)方高劑量組與厄貝沙坦組大鼠上述指標(biāo)均明顯低于芪蛭通絡(luò)方低、中劑量組（P＜0.01）；芪蛭通絡(luò)方高劑量組大鼠上述指標(biāo)均明顯低于厄貝沙坦組（P＜0.05，P＜0.01）；芪蛭通絡(luò)方對(duì)DKD模型大鼠腎組織Wnt1、β-catenin、CTGF、GSK-3β蛋白表達(dá)的抑制作用表現(xiàn)出一定的劑量依賴(lài)性。見(jiàn)表2、圖3～圖6。

圖3 各組大鼠腎組織Wnt1蛋白表達(dá)比較（IHC，×400）

圖5 各組大鼠腎組織CTGF蛋白表達(dá)比較（IHC，×400）

圖6 各組大鼠腎組織GSK-3β蛋白表達(dá)比較（IHC，×400）

表2 免疫組化法各組大鼠腎組織Wnt1、β-catenin、CTGF、GSK-3β蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表2 免疫組化法各組大鼠腎組織Wnt1、β-catenin、CTGF、GSK-3β蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注： 與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與厄貝沙坦組比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；與芪蛭通絡(luò)方低劑量組比較，▲▲P＜0.01；與芪蛭通絡(luò)方中劑量組比較，☆☆P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù)/只 Wnt1 β-catenin CTGF GSK-3β正常組 10 0.288±0.002 0.252±0.009 0.311±0.008 0.229±0.007模型組 10 0.387±0.003## 0.485±0.016## 0.521±0.024## 0.404±0.017##厄貝沙坦組 10 0.331±0.006##** 0.311±0.010##** 0.380±0.003##** 0.264±0.010##**芪蛭通絡(luò)方低劑量組 10 0.371±0.002##**ΔΔ 0.396±0.010##**ΔΔ 0.476±0.010##**ΔΔ 0.338±0.010##**ΔΔ芪蛭通絡(luò)方中劑量組 10 0.349±0.004##**ΔΔ▲▲ 0.361±0.009##**ΔΔ▲▲ 0.414±0.011##**ΔΔ▲▲ 0.288±0.005##**Δ▲▲芪蛭通絡(luò)方高劑量組 10 0.307±0.006##**ΔΔ▲▲☆☆ 0.288±0.007##**Δ▲▲☆☆ 0.353±0.009##**Δ▲▲☆☆ 0.244±0.003**Δ▲▲☆☆

蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示：模型組大鼠腎組織Wnt1、β-catenin、CTGF、GSK-3β蛋白表達(dá)水平均明顯高于正常組（P＜0.01）；各給藥組大鼠上述蛋白表達(dá)水平均明顯低于模型組（P＜0.05，P＜0.01）；芪蛭通絡(luò)方高劑量組大鼠腎組織Wnt1、GSK-3β蛋白表達(dá)水平均明顯低于厄貝沙坦組（P＜0.01，P＜0.05），β-catenin、CTGF蛋白表達(dá)水平與厄貝沙坦組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；芪蛭通絡(luò)方對(duì)DKD模型大鼠腎組織Wnt1、β-catenin、CTGF、GSK-3β蛋白表達(dá)的抑制作用表現(xiàn)出一定的劑量依賴(lài)性。見(jiàn)表3、圖7。

圖7 各組大鼠腎組織Wnt1、β-catenin、CTGF、GSK-3β蛋白條帶圖

表3 蛋白免疫印跡法各組大鼠腎組織Wnt1、β-catenin、CTGF、GSK-3β蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表3 蛋白免疫印跡法各組大鼠腎組織Wnt1、β-catenin、CTGF、GSK-3β蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注： 與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與厄貝沙坦組比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；與芪蛭通絡(luò)方低劑量組比較，▲▲P＜0.01；與芪蛭通絡(luò)方中劑量組比較，☆P＜0.05，☆☆P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù)/只 Wnt1 β-catenin CTGF GSK-3β正常組 10 0.229±0.043 0.246±0.043 0.311±0.050 0.317±0.050模型組 10 0.922±0.057## 0.878±0.168## 0.919±0.116## 0.714±0.038##厄貝沙坦組 10 0.513±0.090##** 0.534±0.058##** 0.463±0.057#** 0.590±0.043##**芪蛭通絡(luò)方低劑量 10 0.796±0.064##*ΔΔ 0.679±0.051##* 0.621±0.073##**Δ 0.616±0.027##*芪蛭通絡(luò)方中劑量 10 0.722±0.092##**ΔΔ 0.559±0.071##** 0.521±0.067##** 0.574±0.034##**芪蛭通絡(luò)方高劑量 10 0.387±0.059#**Δ▲▲☆☆ 0.410±0.026#**▲▲☆ 0.346±0.038**▲▲☆ 0.424±0.058#**ΔΔ▲▲☆☆

4 討論

DKD發(fā)病隱蔽，早期僅有持續(xù)的微量白蛋白尿及腎小球高濾過(guò)率，極易忽視，若不及時(shí)加以干預(yù)，可能導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化，最終進(jìn)展為尿毒癥。目前DKD發(fā)病機(jī)制尚不清晰，西醫(yī)亦無(wú)特異性治療，主要以降壓、控糖、減少蛋白尿等對(duì)癥治療為主，起不到關(guān)鍵作用。近年來(lái)中醫(yī)藥治療DKD療效顯著，諸多研究表明中藥復(fù)方辨證施治，多靶點(diǎn)整體調(diào)節(jié)，可在根本上增強(qiáng)體質(zhì)，顧護(hù)正氣，減輕腎纖維化程度，降低死亡率[13]。

DKD以腎病綜合征、高血壓等臨床表現(xiàn)為主，可歸屬于中醫(yī)學(xué)“水腫”“虛勞”等范疇。檀金川教授根據(jù)多年臨證經(jīng)驗(yàn)提出DKD病機(jī)總屬本虛標(biāo)實(shí)，以脾腎兩虛為本，濕、濁、瘀互結(jié)為標(biāo)[14]。《諸病源候論》云：“夫水腫病者，皆由榮衛(wèi)痞澀，腎脾虛弱所為。”脾虛無(wú)以運(yùn)化，腎虛則氣化不利、開(kāi)闔失司，致使精微下注，水液代謝失常，發(fā)為蛋白尿、水腫；《血證論》[15]曰：“故氣不得通，不能載水津上升，是以發(fā)渴，名曰血渴，瘀血去則不渴矣……”濕濁內(nèi)蘊(yùn)，氣血運(yùn)行不暢，氣滯則血瘀，血瘀則濕濁內(nèi)生，三者相互影響、膠著，共同作用，推動(dòng)疾病進(jìn)展。芪蛭通絡(luò)方以健脾補(bǔ)腎、化濁祛瘀為出發(fā)點(diǎn)。方中黃芪、黨參健脾益氣，現(xiàn)代藥理研究表明黃芪有增強(qiáng)免疫、改善腎臟微循環(huán)、降低蛋白尿的功效[16]，為臨床治療腎臟病常用中藥；醋龜甲滋陰潛陽(yáng)，在補(bǔ)腎的同時(shí)亦能顧護(hù)肝陰；丹參、川芎相須為用，活血祛瘀，丹參中的丹酚酸、鞣酸等成分具有降血脂、抗炎的作用[17]；茯苓健脾寧心、利水消腫；蟲(chóng)類(lèi)藥燙水蛭、全蝎、地龍，善行走竄之勢(shì)，搜風(fēng)通絡(luò)化濁，檀師臨床善用此類(lèi)藥物，因其活血化瘀力強(qiáng)，又能引諸藥直達(dá)病所[18]。

DKD發(fā)病機(jī)制與高糖環(huán)境、血流動(dòng)力學(xué)改變、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)等有關(guān)，多種信號(hào)通路的異常激活可導(dǎo)致DKD細(xì)胞損傷、細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)剩[19]。研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路在DKD腎纖維化中起著關(guān)鍵作用[20]，通過(guò)介導(dǎo)上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）來(lái)引發(fā)RIF。該通路在正常腎臟中處于沉默狀態(tài)，Wnt1、β-catenin、CTGF、GSK-3β蛋白表達(dá)很低或無(wú)表達(dá)[21]，GSK-3β、β-catenin參與細(xì)胞增殖、分化及凋亡[22]。GSK-3β作為Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的傳遞器之一，以“破壞復(fù)合物”的形式存在，在磷酸化β-catenin后再降解方面發(fā)揮著重要作用。研究表明，GSK-3β在纖維化的腎小管上皮細(xì)胞中高度表達(dá)，特異性的GSK-3β抑制劑可以減少GSK-3β表達(dá)，緩解RIF[23]。在高糖條件下，Wnt/β-catenin信號(hào)通路可被異常激活，Wnt1蛋白在腎臟中表達(dá)水平增加，此時(shí)Wnt1與其跨膜受體卷曲受體家族蛋白（Fzd）、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（LRP）5和6 結(jié)合，蓬亂蛋白（Dishevelled，Dvl）被激活，GSK-3β被磷酸化，導(dǎo)致β-catenin不能降解而積累轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，然后與轉(zhuǎn)錄因子聚合成復(fù)合物，誘導(dǎo)靶基因的過(guò)度表達(dá)，從而促進(jìn)EMT的進(jìn)程，進(jìn)而引發(fā)RIF[24-25]。CTGF是一種促纖維因子，大量實(shí)驗(yàn)證明，CTGF作為預(yù)測(cè)RIF進(jìn)展的指標(biāo)，其表達(dá)隨著DKD的進(jìn)展而增加[21]。CTGF下游可促進(jìn)成纖維細(xì)胞合成、分泌大量膠原纖維，并通過(guò)與Wnt通路LRP6結(jié)合以異常激活Wnt通路，從而加重RIF[26]?？拙S瑋[27]發(fā)現(xiàn)Nrf2可以通過(guò)下調(diào)CTGF表達(dá)水平來(lái)抑制Wnt通路以減輕RIF程度。由此表明，Wnt1、β-catenin、CTGF、GSK-3β蛋白均在RIF進(jìn)展中發(fā)揮著重要的作用。本研究結(jié)果表明，模型組大鼠腎組織Wnt1、β-catenin、CTGF、GSK-3β蛋白含量均明顯高于正常組，與前述報(bào)道一致；芪蛭通絡(luò)方及厄貝沙坦對(duì)上述指標(biāo)均有明顯的干預(yù)作用，推測(cè)這可能是其干預(yù)DKD的作用機(jī)制，其中芪蛭通絡(luò)方高劑量對(duì)上述指標(biāo)的改善或明顯優(yōu)于厄貝沙坦，或與厄貝沙坦相當(dāng)，部分指標(biāo)甚至接近正常組水平。本研究部分指標(biāo)免疫組化法與蛋白免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果存在不一致的現(xiàn)象，推測(cè)可能與樣本量偏小或者樣本誤差有關(guān)，未來(lái)將進(jìn)一步觀察若延長(zhǎng)給藥時(shí)間，芪蛭通絡(luò)方高劑量是否較厄貝沙坦療效顯著。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高糖高脂飲食與STZ注射制備DKD大鼠模型，選取臨床療效顯著的厄貝沙坦為陽(yáng)性藥物。結(jié)果表明，芪蛭通絡(luò)方及厄貝沙坦對(duì)DKD大鼠血糖及腎功能指標(biāo)、腎組織病理改變均有明顯的改善作用，說(shuō)明兩種藥物對(duì)DKD均有治療作用，而芪蛭通絡(luò)方療效更優(yōu)。在對(duì)比芪蛭通絡(luò)方各劑量組各指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，芪蛭通絡(luò)方對(duì)DKD大鼠血糖、腎功能指標(biāo)、腎組織病理改變的改善作用均表現(xiàn)出一定的劑量依賴(lài)性，提示藥物濃度與治療效果可能存在著正相關(guān)，可為臨床用藥劑量提供參考。

綜上，我們推測(cè)芪蛭通絡(luò)方高劑量可抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活，減少Wnt1、CTGF活性，防止GSK-3β磷酸化，使泛素介導(dǎo)的β-catenin磷酸化后降解而處于沉默狀態(tài)，從而起到減輕RIF、保護(hù)腎臟的作用。然而本研究仍存在一定的局限性，如樣本量偏少、給藥和觀察期較短等，同時(shí)中藥復(fù)方成分復(fù)雜，可能涉及多個(gè)信號(hào)通路，下一步本課題組將增加樣本量，延長(zhǎng)給藥時(shí)間，進(jìn)一步挖掘芪蛭通絡(luò)方通過(guò)作用于其他靶點(diǎn)延緩RIF，保護(hù)腎臟的作用機(jī)制。