葉面肥對不同葉色茶樹品種新梢理化成分的影響

關(guān)鍵詞：茶樹；葉面肥；品質(zhì)成分；基因表達

中圖分類號：S571.1 文獻標識碼：A 文章編號：1000－3150 （2024） 12-41-7

茶樹[Camellia sinensis（L.）O.Kuntze]起源于中國西南地區(qū)，是一種多年生常綠葉用經(jīng)濟作物。茶葉中富含多種對人體有益的次生代謝產(chǎn)物，包括茶多酚、兒茶素、咖啡堿和茶氨酸等，這些物質(zhì)影響茶湯的苦、澀、鮮感官品質(zhì)，賦予了茶葉獨特和豐富的風味。氮素是一種重要的大量營養(yǎng)元素，參與植物光合作用、生長發(fā)育和代謝調(diào)節(jié)，影響許多生物過程[1]。氮素是影響茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素之一，合理的施氮能顯著提高茶葉產(chǎn)量并改善其品質(zhì)。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，茶樹氮肥的利用率僅為10%～50%，有超過一半的氮營養(yǎng)流失，過量施用氮肥會造成水體富營養(yǎng)化和環(huán)境污染[2]。

茶樹不僅能夠通過根部獲取養(yǎng)分，還可以通過葉片或莖來吸收營養(yǎng)，這種方式被稱為植物的葉部營養(yǎng)或根外營養(yǎng)。葉面肥的特點是用量少、吸收迅速且利用效率高，能夠有效補充根部營養(yǎng)吸收的不足。據(jù)文獻表明，在減少化肥施用量25%的情況下，噴施葉面肥不僅有利于茶樹春梢的萌發(fā)，還能使產(chǎn)量增加12.8%[3]。Liu等[4]研究表明，在茶樹休眠期對葉面噴施2次氨基酸液肥可增加成熟葉片的氮濃度，并提高春茶的品質(zhì)和產(chǎn)量。李偉等[5]研究明確了在早春噴施營養(yǎng)型葉面肥能夠使茶樹增產(chǎn)9.17%～18.44%，該措施能夠有效降低綠茶的酚氨比，提高可溶性糖含量，對改善茶葉品質(zhì)有積極作用。

植物葉片對氮素的吸收效率依次為尿素gt;硝酸鹽gt;銨鹽[5]。影響葉面營養(yǎng)吸收的因素有葉面肥類型、濃度，以及作物品種、營養(yǎng)狀況等。茶樹新梢葉片顏色的變異，如紫色、黃色和白色等，通常具有較高的生產(chǎn)利用價值。這些顏色特異的茶樹品種，不僅在新梢色澤上與常規(guī)綠色茶樹有所區(qū)別，而且在內(nèi)含物成分上也表現(xiàn)出各自的特點。例如，紫化茶樹新梢含有較高水平的花青素，而白化和黃化茶樹新梢則通常含有較高水平的氨基酸?，F(xiàn)已培育出的葉色特異品種有白葉1號、黃金芽、中白1號、中黃1號等，經(jīng)濟效益明顯[6]。

目前，關(guān)于茶樹葉面肥的應用已取得一些進展[7]，然而，關(guān)于葉面肥對不同葉色茶樹施用效果差異，特別是對茶葉理化成分的影響鮮有報道。本研究以常規(guī)綠葉品種龍井43與葉色特異品種中黃2號、新安4號為研究對象，進行尿素葉面肥施用，分析新梢中茶多酚、氨基酸、咖啡堿、葉綠素含量，同時運用實時熒光定量PCR技術(shù)（Quantitativereal-time PCR，qRT-PCR）分析茶多酚、葉綠素和氮代謝途徑相關(guān)基因的表達模式。研究結(jié)果可為不同葉色茶樹品種的葉面肥施用效果提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料與處理

試驗布置于杭州市農(nóng)業(yè)科學研究院大清谷基地（北緯30.182°，東經(jīng)120.072°），以龍井43、新安4號及中黃2號茶樹品種為試驗材料，試驗設(shè)置2個處理，分別為清水組（對照組）和葉面肥組（處理組），3次重復，每個小區(qū)3m2，2024年3月9日分別用細嘴噴霧器將清水或0.5%的尿素葉面肥均勻噴灑于茶樹葉片正反面，直至葉面有液滴下流為適度。于2024年4月13日采摘生長健壯、長勢均勻的一芽二葉，液氮保存?zhèn)溆?，用于后續(xù)理化成分含量的測定和qRT-PCR分析。

1.2分析方法

1.2.1總RNA的提取和cDNA的合成

茶樹材料總RNA的提取參照Quick RNA IsolationKit試劑盒（北京華越洋公司）說明書。利用Nanodrop ND 1000微量紫外分光光度計（上海譜元儀器有限公司）檢測RNA樣品濃度；用1.2%凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA則參照Prime Script RT Reagent Kit（大連TaKaRa公司）。

1.2.2茶樹基因表達量分析

為分析施用葉面肥對龍井43、新安4號及中黃2號茶樹品種氮代謝、茶多酚代謝及葉綠素代謝相關(guān)基因表達的影響，對其進行qRT-PCR分析，選用茶樹GAPDH作為內(nèi)參基因，氮代謝、茶多酚代謝及葉綠素代謝相關(guān)基因qRT-PCR引物參考之前的研究（表1）[8-10]。使用CFX96real-time PCR system進行qRT-PCR分析（美國伯樂公司），qRTPCR反應體系為：10μL Hieff qPCR SYBR Green Master Mix（上海翌圣公司），7.2μL ddH2O，0.8μL上下游引物，2μLcDNA。程序為：95℃，30s；95℃，10s；60℃，30s，循環(huán)40次。采用2-△△CT方法計算基因相對表達水平[11]，每個樣品進行3次生物重復。

1.2.3新梢理化成分含量測定

茶多酚和兒茶素的提取參照國家標準《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》（GB/T8313—2008）和崔宏春等[12]所描述的方法。

采用福林酚法測定茶多酚含量，在1mL上清液中加入5mL10%的福林酚試劑。搖勻后靜置8min，隨后加入4mL7.5%碳酸鈉溶液，混合物在室溫下靜置1h。用分光光度計測定每個樣品在765nm波長的吸光度。

采用高效液相色譜法進行兒茶素單體和咖啡堿含量的測定。將上清液用0.22μm的濾膜過濾。采用Hypersil ODS C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）進行色譜分離。流動相A為2%乙酸，流動相B為100%乙腈。流速設(shè)定為1mL/min，檢測波長為280nm，色譜柱溫度為35℃。

采用茚三酮比色法測定游離氨基酸總量，在1mL上清液中加入0.5mLpH8.0的磷酸鹽緩沖液和0.5mL的2%茚三酮溶液。隨后沸水中加熱15min，冷卻后定容至25mL，用分光光度計測定每個樣品在570nm波長的吸光度。

葉綠素的提取和測定方法參考前人研究[13]。將待測樣品葉片切成小塊混勻，稱取0.1g放入10mL提取液（95%乙醇）中，置黑暗處浸提24h，待葉片完全變白。以95%乙醇為空白對照，使用分光光度法分別在645、663nm處測定各樣品的吸光度。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用Excel2019及SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差表示。Duncan多重比較方法評估數(shù)值之間的差異顯著性（Plt;0.05）。

2結(jié)果與分析

2.1葉面肥對新梢主要理化成分含量的影響

噴施葉面肥后，不同茶樹品種新梢理化成分含量變化呈現(xiàn)差異。如圖1所示，噴施葉面肥后，龍井43、中黃2號及新安4號品種新梢茶多酚含量均無顯著變化；龍井43和中黃2號施肥處理游離氨基酸含量分別較對照顯著提高0.62和0.86個百分點，新安4號品種與對照相比顯著下降了0.58個百分點；龍井43、中黃2號葉面肥處理后的酚氨比較對照下降，新安4號較對照有所上升；3個茶樹品種在噴施葉面肥后咖啡堿含量較對照均降低，尤其是新安4號顯著降低了0.48個百分點；龍井43、中黃2號及新安4號施肥處理的葉綠素含量與對照相比分別增加了8.58%、5.63%和26.30%。

對葉面肥處理下3個茶樹品種兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、沒食子兒茶素（GC）、表沒食子兒茶素（EGC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）和兒茶素沒食子酸酯（CG）8種兒茶素單體含量的檢測結(jié)果（表2）顯示，與對照相比，龍井43葉面肥處理的EGC、C、EGCG、EC、ECG含量均顯著降低；中黃2號葉面肥處理的GC、EGC和C含量均顯著降低；新安4號葉面肥處理則是除ECG含量提高外，其他兒茶素單體含量均有所降低。

2.2葉面肥處理對茶多酚代謝基因表達的影響

采用qRT-PCR對葉面肥處理后3個茶樹品種葉片中茶多酚代謝基因的表達進行分析。結(jié)果（圖2）顯示，葉面肥處理后，CsSCPL、CsANR基因在龍井43中顯著下調(diào)表達；CsUGT84A、CsANR、CsANS、CsDFR基因在新安4號中均顯著下調(diào)表達；噴施葉面肥顯著上調(diào)了中黃2號中CsUGT84A、CsSCPL、CsANS、CsLAR、CsDFR基因的表達。

2.3葉面肥處理對葉綠素代謝基因表達的影響

如圖3所示，與對照相比，龍井43在葉面肥處理后，CsHEMA1、CsERS1、CsNYE2基因均顯著上調(diào)表達；中黃2號在葉面肥處理后，CsHEMA1、CsLIN2、CsERS1均上調(diào)表達，CsNYE2顯著下調(diào)表達；CsHEMA1、CsNYE2基因在新安4號中均下調(diào)表達，且達到顯著水平。

2.4葉面肥處理對氮代謝基因表達的影響

如圖4所示，與對照相比，龍井43在葉面肥處理后，CsAAP6、CsGS1、CsATG7基因均顯著上調(diào)表達；葉面肥處理后，CsAAP6、CsGS1、CsATG7基因在中黃2號中均上調(diào)表達，其中CsAAP6顯著上調(diào)；葉面肥處理后，CsAAP6和CsATG7基因在新安4號中顯著下調(diào)表達，CsGS1顯著上調(diào)表達。

3小結(jié)與討論

目前，茶園化肥施用量大，栽培管理領(lǐng)域的若干瓶頸問題正制約著茶產(chǎn)業(yè)的深度拓展。在此背景下，茶園土壤化肥減施增效技術(shù)的推廣應用顯得尤為重要，噴施葉面肥便是其中一項重要的技術(shù)措施。本研究結(jié)果表明，在早春萌芽前噴施葉面肥，龍井43、新安4號及中黃2號茶樹品種新梢茶多酚的含量無顯著變化；龍井43和中黃2號新梢中游離氨基酸含量在葉面肥處理后顯著增加，3個茶樹品種中咖啡堿含量均降低。李偉等[5]研究表明，噴施氨基酸葉面肥會減少茶葉中茶多酚含量，使游離氨基酸含量增加，這一結(jié)論與本文中龍井43品種變化趨勢一致。葉色特異品種受多種生化和環(huán)境因素的影響，葉綠素含量下降，葉綠體的基粒片層消失，類囊體數(shù)量減少，出現(xiàn)白化或者黃化現(xiàn)象。馬立鋒等[14]研究表明，過量施用氮肥，會提升白化、黃化茶樹品種新梢中葉綠素的含量。本文研究發(fā)現(xiàn)，早春萌芽前噴施葉面肥會使龍井43、新安4號及中黃2號新梢葉綠素含量增加，可能是由于葉面肥的施用使茶樹體內(nèi)存儲了氮素，氮的內(nèi)部循環(huán)使氮素從成熟葉片運輸?shù)叫碌纳L點[10]。

代謝物的合成是一個多酶參與的復雜過程，CsSCPL、CsANR、CsANS、CsDFR、CsUGT84A、CsLAR參與了兒茶素單體的合成。在葉面肥處理下，龍井43新梢中CsSCPL、CsANR基因表達與EGC、C、EGCG、EC、ECG含量趨勢一致；新安4號中CsUGT84A、CsANR、CsANS、CsLAR、CsDFR基因表達與GC、EGC、C、EGCG、EC、GCG、CG含量趨勢一致。在葉面肥處理后，龍井43和中黃2號新梢中游離氨基酸含量與CsAAP6、CsGS1、CsATG7基因表達均呈現(xiàn)上升趨勢；Fan等[10]研究報道茶樹新芽生長前，對成熟葉片施用15N-尿素葉面肥，能夠使新芽中的15N含量、氨基酸含量增加，15N和氨基酸的轉(zhuǎn)運受參與自噬、蛋白質(zhì)降解、氨基酸轉(zhuǎn)運基因，如CsGS、CsATG、CsASN3、CsGLT和CsAAP等基因的調(diào)控[10]。

葉面肥的施用效果與濃度、次數(shù)、種類都有一定關(guān)系，此外，不同茶種品種（龍井43、新安4號及中黃2號）間也存在差異。龍井43和中黃2號在噴施尿素后，新梢酚氨比下降，新安4號咖啡堿含量顯著減少，一定程度上改善了綠茶滋味品質(zhì)。