麝香酮調(diào)節(jié)SHH介導(dǎo)的自噬對卵巢癌細(xì)胞惡性進(jìn)展的影響

汪愛華 張飛忠 王紅英

摘要：目的 探究麝香酮調(diào)節(jié)超音刺猬蛋白（SHH）介導(dǎo)的自噬對卵巢癌細(xì)胞惡性進(jìn)展的影響。方法 檢測0、2、4、8、16、24 μmol/L的麝香酮處理后的人卵巢癌細(xì)胞SKOV3存活率，篩選出麝香酮最佳細(xì)胞作用濃度。體外培養(yǎng)SKOV3細(xì)胞并構(gòu)建其移植瘤小鼠模型，隨機(jī)均分為對照組，麝香酮組，麝香酮+自噬抑制劑氯喹（CQ）組，麝香酮+空載組，麝香酮+SHH過表達(dá)組，按照分組分別以麝香酮、CQ、空載質(zhì)粒及SHH過表達(dá)質(zhì)粒處理后，檢測各組移植瘤小鼠腫瘤體積和質(zhì)量；分別以EdU染色、TUNEL染色、細(xì)胞劃痕、Transwell侵襲實驗、免疫印跡法、實時熒光定量PCR檢測SKOV3細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲、SKOV3細(xì)胞及其移植瘤小鼠腫瘤組織自噬相關(guān)蛋白（LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1）與SHH表達(dá)。結(jié)果 與對照組相比，麝香酮組細(xì)胞增殖率、遷移率、侵襲數(shù)目、腫瘤體積和質(zhì)量、腫瘤組織SHH mRNA及蛋白表達(dá)水平均降低（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞及腫瘤組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin-1蛋白表達(dá)水平均升高（P＜0.05）。與麝香酮組相比，麝香酮+CQ組和麝香酮+SHH過表達(dá)組細(xì)胞增殖率、遷移率、侵襲數(shù)目、腫瘤體積和質(zhì)量升高（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞及腫瘤組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin-1蛋白表達(dá)水平均降低（P＜0.05）；麝香酮+SHH過表達(dá)組細(xì)胞及腫瘤組織SHH mRNA及蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；麝香酮+空載組細(xì)胞各指標(biāo)變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 麝香酮可通過下調(diào)SHH而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞自噬，進(jìn)而抑制其增殖、體內(nèi)生長、遷移及侵襲，促進(jìn)其凋亡，最終抑制其惡性進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：卵巢腫瘤；麝香酮；超音刺猬蛋白；自噬；惡性進(jìn)展

中圖分類號：R737.31文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.11958/20230541

Impacts of muscone on malignant progression of ovarian cancer cells by regulating SHH mediated autophagy

Abstract： Objective To investigate the effect of muscone on malignant progression of ovarian cancer cells mediated by regulating sonic hedgehog （SHH） mediated autophagy. Methods Survival rates of human ovarian cancer cell line SKOV3 treated with 0， 2， 4， 8， 16， and 24 μmol/L muscone were detected， and the optimal cell action concentration of muscone was selected. SKOV3 cells were cultured in vitro， and their transplanted tumor mouse models were constructed. Cells were randomly grouped into the control group， the muskone group， the muskone+chloroquine （CQ，an autophagy inhibitor） group， the muskone+empty group and the muskone+SHH overexpression group. After grouping and treatment with musconeand， CQ， empty plasmid and SHH overexpression plasmid， the tumor volume and weight in transplanted tumor mice were detected. EdU staining， TUNEL staining， cell scratch， Transwell invasion assay， immunoblotting and real-time fluorescence quantitative PCR were used to detect proliferation， apoptosis， migration and invasion of SKOV3 cells， the expression of autophagy related proteins （LC3Ⅱ/LC3Ⅰ， Beclin-1） and SHH in SKOV3 cells and transplanted tumor mice in each. Results Compared with the control group， the cell proliferation rate， cell migration rate， number of invasions， tumor volume and weight， and the expression of SHH mRNA and protein in tumor tissue were decreased in the muskone group （P＜0.05）， and the apoptosis rate， LC3Ⅱ/LC3Ⅰ， Beclin-1 protein in cells and tumor tissue were increased （P＜0.05）. Compared with the muscone group， the cell proliferation rate， cell migration rate， number of invasion， tumor volume and weight were increased in the muscone+CQ group and the muskone+SHH overexpression group （P＜0.05）， and the apoptosis rate， LC3Ⅱ/LC3Ⅰ and the expression of Beclin-1 protein in cells and tumor tissue were decreased （P＜0.05）. There were no significant differences in the above indicators in the muscone+empty group （P＞0.05）. Conclusion Muscone can promote autophagy of ovarian cancer cells by down-regulating SHH， thereby inhibiting their proliferation， in vivo growth， migration and invasion， promoting their apoptosis， and ultimately inhibiting their malignant progression.

Key words： ovarian neoplasms; muscone; sonic hedgehog; autophagy; malignant progression

卵巢癌是全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，因其發(fā)病早期不易察覺，患者就診時病情大多已進(jìn)入晚期，病死率很高，已成為女性癌癥死亡的主要原因之一［1-2］。自噬是一種細(xì)胞自我降解過程，在包括卵巢癌在內(nèi)的癌癥發(fā)生發(fā)展中起重要作用，觸發(fā)并增強(qiáng)自噬可對抗促炎細(xì)胞因子促進(jìn)的卵巢癌過量糖酵解及轉(zhuǎn)移擴(kuò)散，進(jìn)而抑制其惡性進(jìn)展［3-4］。麝香酮是麝香的主要活性成分，可用于抗癌、抗炎、抗腫瘤多藥耐藥等，且療效顯著［5］。有研究顯示，麝香酮可通過結(jié)合雄激素受體、孕激素受體等多個靶標(biāo)對乳腺癌發(fā)揮潛在治療作用［6］；其可顯著抑制肺癌A549細(xì)胞的順鉑耐藥性，并抑制小鼠皮下移植瘤的生長［7］。超音刺猬蛋白（sonic hedgehog，SHH）在大腸癌、卵巢癌等惡性腫瘤的發(fā)生及惡性進(jìn)展中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。研究顯示，SHH在癌癥干細(xì)胞中過表達(dá)，下調(diào)其表達(dá)可明顯抑制大腸癌的體內(nèi)生長［8］。SHH與卵巢癌總生存期短有關(guān)，并與卵巢型子宮內(nèi)膜異位癥惡變相關(guān)，其高表達(dá)提示子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)卵巢癌患者預(yù)后不良［9-10］。另有研究顯示，SHH介導(dǎo)癌細(xì)胞自噬過程，抑制SHH信號可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期停滯和自噬來抑制前列腺癌的體內(nèi)外生長，并減輕其骨轉(zhuǎn)移［11］。由此推測SHH可能通過調(diào)控自噬介導(dǎo)卵巢癌的惡性進(jìn)展。本研究通過體外培養(yǎng)人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3，探究麝香酮調(diào)節(jié)SHH介導(dǎo)的自噬對卵巢癌細(xì)胞惡性進(jìn)展的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與細(xì)胞 BALB/c小鼠購自山東博安生物技術(shù)股份有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（魯）2020-0006，SPF級，6周齡左右，雌性，體質(zhì)量18～22 g，飼養(yǎng)在25～27 ℃、濕度40%～55%的動物房內(nèi)，維持明暗各12 h循環(huán)照明；人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3購自上海蓋寧生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑及儀器 麝香酮（批號110719-201716）購自天津西瑪科技有限公司；氯喹（chloroquine，CQ，批號200-191-2）購自北京謹(jǐn)明生物科技有限公司；SHH過表達(dá)質(zhì)粒及空載質(zhì)粒購自吉滿生物科技（上海）有限公司；McCoys 5A培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；一步法熒光定量PCR試劑盒、總RNA提取試劑盒購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；EdU染色增殖試劑盒、CCK-8試劑盒、TUNEL檢測試劑盒、結(jié)晶紫溶液、兔源抗人Anti-LC3、Beclin1、SHH、GAPDH一抗，HRP偶聯(lián)山羊抗兔二抗購自英國Abcam公司等。

LD-96A小型酶標(biāo)儀購自山東萊恩德智能科技有限公司；MF53-M倒置熒光顯微鏡購自山東千司科學(xué)儀器有限公司；TE62全濕蛋白電轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、SE400垂直蛋白電泳系統(tǒng)購自美國Amersham公司等。

1.2 方法

1.2.1 麝香酮最佳細(xì)胞作用濃度篩選 快速取出凍存的SKOV3細(xì)胞，于39.5 ℃水浴內(nèi)凍融，1 000 r/min離心5 min，洗滌細(xì)胞沉淀，加入McCoys 5A培養(yǎng)基（含1%青-鏈霉素雙抗及10%胎牛血清）進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)。傳代后接種于96孔板，接種密度為1×104個/孔，培養(yǎng)24 h后，以終濃度0、2、4、8、16、24 μmol/L的麝香酮處理［7］，0 μmol/L麝香酮處理的細(xì)胞為對照組，同時設(shè)空白對照組（不接種細(xì)胞只加入培養(yǎng)基）。48 h后每孔加入20 μL CCK-8試劑繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h，采用酶標(biāo)儀于450 nm波長處測定細(xì)胞光密度（OD）值，計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=（麝香酮處理組OD值-空白對照組OD值）/（對照組OD值-空白對照組OD值）×100%，篩選出麝香酮最佳細(xì)胞作用濃度進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.2 SKOV3移植瘤小鼠模型構(gòu)建及分組 參照文獻(xiàn)［12］構(gòu)建SKOV3移植瘤小鼠模型。SKOV3細(xì)胞傳代后計數(shù)并配制1×107個/mL的細(xì)胞懸液，將其接種至BALB/c小鼠右腋皮下，每只接種0.1 mL，1周后觀察到小鼠右腋下長出米粒大小腫塊即表示移植瘤模型構(gòu)建成功。按照隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為對照組、麝香酮組、麝香酮+CQ組、麝香酮+空載組、麝香酮+SHH過表達(dá)組，每組10只。除對照組外，其余各組于腫瘤部位皮下注射16 mg/kg麝香酮（1.6 g/L麝香酮溶液注射10 mL/kg，1次/d）［7］。同時麝香酮組小鼠腹腔注射10 mL/kg生理鹽水；麝香酮+CQ組小鼠腹腔注射50 mg/kg CQ（5 g/L CQ溶液注射10 mL/kg）［12］；麝香酮+空載組小鼠于腫瘤部位皮下注射空載質(zhì)粒（注射劑量參考說明書），并腹腔注射10 mL/kg生理鹽水；麝香酮+SHH過表達(dá)組小鼠于腫瘤部位皮下注射SHH過表達(dá)質(zhì)粒（注射劑量參考說明書），并腹腔注射10 mL/kg生理鹽水；對照組小鼠分別于腫瘤部位皮下、腹腔注射與麝香酮+SHH過表達(dá)組等劑量的生理鹽水，各組小鼠均每隔1 d注射1次，連續(xù)處理28 d。

1.2.3 移植瘤小鼠腫瘤體積和質(zhì)量檢測及標(biāo)本采集 各組處理完成24 h后，頸椎脫臼處死小鼠，剪開右腋下皮膚剝離出腫瘤組織塊，測量其腫瘤長徑a及短徑b，計算腫瘤體積=（a×b2）/2；用手術(shù)剪取下約0.4 g腫瘤組織置于適量RAPI緩沖液內(nèi)，研碎并勻漿，3 000 r/min離心20 min，收集上清液得到總蛋白樣品液，以BCA法檢測其總蛋白濃度并調(diào)至各組相同，分組標(biāo)記后存在-80 ℃?zhèn)溆茫辉俅渭粝录s0.4 g腫瘤組織存于液氮備用。

1.2.4 SKOV3細(xì)胞分組處理及標(biāo)本收集 SKOV3傳代后接種于24孔板，接種密度為1×105個/孔，培養(yǎng)24 h后根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、麝香酮組、麝香酮+CQ組、麝香酮+空載組、麝香酮+SHH過表達(dá)組。對照組細(xì)胞不進(jìn)行處理，麝香酮組細(xì)胞以終濃度16 μmol/L的麝香酮處理，麝香酮+CQ組細(xì)胞以終濃度16 μmol/L的麝香酮和5 μmol/L的CQ［12］聯(lián)合處理，麝香酮+空載組以終濃度16 μmol/L的麝香酮處理的同時轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒，麝香酮+SHH過表達(dá)組以終濃度16 μmol/L的麝香酮處理的同時轉(zhuǎn)染SHH過表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染步驟按照脂質(zhì)體2000說明進(jìn)行。處理48 h后收集細(xì)胞沉淀，以RAPI緩沖液于冰水浴內(nèi)裂解2 h，3 000 r/min離心20 min，收集上清液，得到總蛋白樣品液，以BCA法檢測其總蛋白濃度并調(diào)至各組相同，分組標(biāo)記后存于-80 ℃?zhèn)溆?；重?fù)上述實驗操作后再次收集各組細(xì)胞沉淀存于液氮備用。

1.2.5 EdU及TUNEL染色法分別檢測各組SKOV3細(xì)胞增殖、凋亡 （1）EdU染色。SKOV3傳代后接種于24孔板，接種密度為1×105個/孔，培養(yǎng)24 h后分組處理48 h（方法同1.2.4），每組添加適量EdU溶液繼續(xù)培養(yǎng)3 h，PBS洗滌、10%甲醛固定細(xì)胞，然后按照EdU細(xì)胞增殖試劑盒說明進(jìn)行EdU染色，PBS洗滌、DAPI染色、PBS洗滌后，于熒光顯微鏡下采集細(xì)胞圖像，用Image J軟件定量各組細(xì)胞（核呈現(xiàn)紅色的EdU陽性細(xì)胞與呈藍(lán)色的總細(xì)胞）數(shù)目，計算其增殖率，增殖率=EdU陽性細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)目×100%。（2）TUNEL染色。SKOV3傳代后接種于24孔板，接種密度為1×105個/孔，培養(yǎng)24 h后分組處理48 h（方法同1.2.4），PBS洗滌、10%甲醛固定細(xì)胞后行TUNEL染色，具體染色按照TUNEL檢測試劑盒說明書進(jìn)行，PBS洗滌、DAPI染色液孵育10 min、PBS洗滌后，于熒光顯微鏡下采集細(xì)胞圖像，用Image J軟件定量各組細(xì)胞（核呈現(xiàn)紅色的凋亡細(xì)胞與呈藍(lán)色的總細(xì)胞）數(shù)目，計算其凋亡率。凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)目×100%。

1.2.6 細(xì)胞劃痕及Transwell侵襲實驗分別檢測各組SKOV3細(xì)胞遷移、侵襲 （1）細(xì)胞劃痕實驗。SKOV3傳代后接種于12孔板，接種密度為2×105個/孔，培養(yǎng)24 h后，用1 mL槍頭在每孔中央劃出1條直線，將劃痕中細(xì)胞沖洗掉后，于顯微鏡下采集細(xì)胞圖像，用Image J軟件定量各組劃痕面積并記為S1，然后分組處理細(xì)胞48 h（方法同1.2.4），再次測量各組劃痕面積并記為S2，計算各組細(xì)胞遷移率。遷移率=（S1-S2）/S1×100%。（2）Transwell侵襲實驗。SKOV3傳代后接種于24孔板，接種密度為1×105個/孔，培養(yǎng)24 h后分組處理48 h（方法同1.2.4），收集細(xì)胞計數(shù)后每組取出2.5×105個細(xì)胞，以不含胎牛血清的McCoys 5A培養(yǎng)基重懸后混勻，接種在24孔Transwell板上室并同時在其下室加入適量含10%胎牛血清的McCoys 5A培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后以PBS洗滌、10%甲醛固定下室內(nèi)細(xì)胞，結(jié)晶紫染色液孵育10 min、PBS洗滌、DAPI染色液孵育10 min、PBS洗滌后，于顯微鏡下采集細(xì)胞圖像，用Image J軟件定量各組細(xì)胞數(shù)目即為侵襲數(shù)。

1.2.7 實時熒光定量PCR檢測各組SKOV3細(xì)胞及其移植瘤小鼠腫瘤組織SHH表達(dá) 取出1.2.2中的腫瘤組織和1.2.4中的細(xì)胞沉淀，用總RNA提取試劑盒并按照其說明指導(dǎo)分別提取兩者中總RNA，然后取適量總RNA采用一步法進(jìn)行實時熒光定量PCR擴(kuò)增，具體步驟按照一步法熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，42個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算SHH基因相對表達(dá)量，引物序列見表1。

1.2.8 免疫印跡法檢測各組SKOV3細(xì)胞及其移植瘤小鼠腫瘤組織自噬相關(guān)蛋白及SHH蛋白表達(dá) 取出1.2.2中的腫瘤組織和1.2.4中的細(xì)胞蛋白樣品液，于4 ℃冰箱內(nèi)放置2 h解凍后，加入適量上樣緩沖液煮沸變性，每組取含20 mg總蛋白的樣品液，于SDS-PAGE濃縮膠內(nèi)上樣。100 V恒壓下電泳80 min，使蛋白于SDS-PAGE分離膠內(nèi)按分子質(zhì)量大小分開，40 mA穩(wěn)流下濕轉(zhuǎn)1.5 h，將分離膠內(nèi)蛋白全部移到PVDF膜上。以5%脫脂奶粉封閉非特異性抗原后將LC3、GAPDH、Beclin-1、SHH蛋白條帶裁下，分別浸入均稀釋2 000倍的兔源LC3、GAPDH、Beclin-1、SHH一抗溶液，4 ℃孵育12 h后以TBST緩沖液洗膜（3次，5 min/次），孵育稀釋1 000倍的HRP偶聯(lián)山羊抗兔二抗溶液2 h，TBST緩沖液洗膜（3次，5 min/次），以化學(xué)發(fā)光試劑孵育顯色，攝制各組檢測蛋白圖像后用Image J軟件定量其灰度，算出其與內(nèi)參GAPDH的灰度比值后統(tǒng)計分析其相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（[[x] ±s

]）表示，多組間差異比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 麝香酮對SKOV3細(xì)胞存活率的影響 2、4、8、16、24 μmol/L的麝香酮均可降低SKOV3細(xì)胞存活率（P＜0.05），見圖1。半數(shù)抑制濃度為15.30 μmol/L，選擇16 μmol/L的麝香酮進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.2 麝香酮對SKOV3移植瘤小鼠腫瘤體積與質(zhì)量的影響 與對照組相比，麝香酮組小鼠腫瘤體積和質(zhì)量降低（P＜0.05）。與麝香酮組相比，麝香酮+CQ組、麝香酮+SHH過表達(dá)組小鼠腫瘤體積和質(zhì)量升高（P＜0.05）；麝香酮+空載組小鼠腫瘤體積和質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.3 麝香酮對SKOV3細(xì)胞增殖與凋亡的影響 與對照組相比，麝香酮組細(xì)胞增殖率降低，凋亡率升高（P＜0.05）。與麝香酮組相比，麝香酮+CQ組、麝香酮+SHH過表達(dá)組細(xì)胞增殖率升高，凋亡率降低（P＜0.05）；麝香酮+空載組細(xì)胞凋亡率、增殖率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2、3，表3。

2.4 麝香酮對SKOV3細(xì)胞遷移與侵襲的影響 與對照組相比，麝香酮組細(xì)胞遷移率與侵襲數(shù)目降低（P＜0.05）。與麝香酮組相比，麝香酮+CQ組、麝香酮+SHH過表達(dá)組細(xì)胞遷移率與侵襲數(shù)目升高（P＜0.05）；麝香酮+空載組細(xì)胞遷移率與侵襲數(shù)目差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4、5，表4。

2.5 麝香酮對SKOV3細(xì)胞及其移植瘤小鼠腫瘤組織自噬的影響 與對照組相比，麝香酮組細(xì)胞及小鼠腫瘤組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。與麝香酮組相比，麝香酮+CQ組、麝香酮+SHH過表達(dá)組細(xì)胞及小鼠腫瘤組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；麝香酮+空載組細(xì)胞及小鼠腫瘤組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖6、表5。

2.6 麝香酮對SKOV3細(xì)胞及其移植瘤小鼠腫瘤組織SHH表達(dá)的影響 與對照組相比，麝香酮組細(xì)胞及小鼠腫瘤組織SHH mRNA、蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。與麝香酮組相比，麝香酮+SHH過表達(dá)組細(xì)胞及小鼠腫瘤組織SHH mRNA、蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；麝香酮+CQ組、麝香酮+空載組細(xì)胞及小鼠腫瘤組織SHH mRNA、蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖7、表6。

3 討論

卵巢癌在我國的發(fā)病率較高，目前主要依靠手術(shù)切除后輔以放化療進(jìn)行綜合治療，但因耐藥性、擴(kuò)散轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等原因易導(dǎo)致治療失敗，因而迫切需要探尋更有效的新型治療手段［13-14］。麝香酮是提取自珍貴中藥麝香的一種3-甲基十五酮化合物，具有顯著的抗腫瘤、逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性等藥理作用，可通過減弱肺癌細(xì)胞順鉑耐藥性發(fā)揮顯著的抗癌功效［5-7，15］。本研究結(jié)果顯示，以麝香酮處理SKOV3細(xì)胞及其移植瘤小鼠，細(xì)胞增殖率、遷移率、侵襲數(shù)目以及小鼠腫瘤體積和質(zhì)量降低，細(xì)胞凋亡率升高。既往研究亦發(fā)現(xiàn)，麝香酮作為惡性腫瘤治療藥西黃丸的主要起效成分之一，能通過改善腫瘤微環(huán)境而起到抗癌作用［16］。本研究證實麝香酮可降低卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲活性，促使其凋亡，抑制其在小鼠體內(nèi)生長，最終延緩卵巢癌惡性進(jìn)展，提示麝香酮在卵巢癌臨床治療中極具開發(fā)價值。

自噬可通過降解受損細(xì)胞器以修復(fù)惡變細(xì)胞，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮腫瘤抑制作用［3-4］。本研究結(jié)果顯示，以麝香酮處理SKOV3細(xì)胞及其移植瘤小鼠的腫瘤組織自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及Beclin-1蛋白表達(dá)水平升高。既往研究發(fā)現(xiàn)，激活自噬可抑制卵巢癌細(xì)胞耐藥性、增殖和遷移，發(fā)揮明顯抗癌作用［17-18］。本研究表明自噬參與麝香酮對卵巢癌惡性進(jìn)展的抑制過程，且麝香酮可增強(qiáng)自噬；以自噬抑制劑CQ和麝香酮聯(lián)合處理SKOV3細(xì)胞及其移植瘤小鼠，與麝香酮單獨處理相比，可減弱麝香酮對卵巢癌細(xì)胞增殖、體內(nèi)生長、遷移及侵襲的抵抗作用，消除其對卵巢癌細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用，最終逆轉(zhuǎn)麝香酮對卵巢癌惡性進(jìn)展的抑制作用，提示麝香酮是通過誘導(dǎo)自噬抑制卵巢癌惡性進(jìn)展的。

SHH可通過調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及自噬介導(dǎo)腫瘤發(fā)生及惡性進(jìn)展，抑制其表達(dá)可顯著降低高級別漿液性卵巢癌細(xì)胞的運動性、遷移性，并抑制其腫瘤干細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)生長［19］，還可提高髓母細(xì)胞瘤小鼠的存活率［20］。本研究結(jié)果顯示，麝香酮處理后SKOV3細(xì)胞及小鼠腫瘤組織SHH mRNA及蛋白表達(dá)水平降低。既往研究發(fā)現(xiàn)，抑制SHH信號可誘導(dǎo)自噬，并抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移及體內(nèi)生長［12］。而本研究證實麝香酮亦可抑制SHH信號，提示SHH參與麝香酮對卵巢癌惡性進(jìn)展的抑制過程；以麝香酮處理SKOV3細(xì)胞及其移植瘤小鼠的同時過表達(dá)SHH，可減弱麝香酮對卵巢癌細(xì)胞增殖、體內(nèi)生長、遷移及侵襲的抵抗作用，消除其對卵巢癌細(xì)胞自噬與凋亡的增強(qiáng)作用，最終逆轉(zhuǎn)麝香酮對卵巢癌惡性進(jìn)展的抑制作用，提示麝香酮誘導(dǎo)自噬來抑制卵巢癌惡性進(jìn)展是通過下調(diào)SHH實現(xiàn)的。

綜上所述，麝香酮可通過下調(diào)SHH而誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞自噬，進(jìn)而降低其增殖、體內(nèi)生長、遷移及侵襲活性，促進(jìn)其凋亡，抑制其惡性進(jìn)展，對卵巢癌發(fā)揮抗腫瘤作用，通過抑制SHH信號誘導(dǎo)自噬是其藥理機(jī)制之一。本研究揭示了麝香酮在卵巢癌臨床治療中具有開發(fā)應(yīng)用潛力，對于改進(jìn)卵巢癌治療技術(shù)具有積極價值。

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