miR-10b靶向TGFBR1/SMAD3通路對(duì)特發(fā)性矮小癥的軟骨細(xì)胞增殖、肥大的影響機(jī)制

胡娜 李正宇 葉春風(fēng) 吳英 姚慶 黃世祥 李文 朱海琴

摘要：目的 研究miR-10b對(duì)特發(fā)性矮小癥（ISS）的影響及作用機(jī)制。方法 收集ISS患兒（ISS組）和體檢健康兒童（健康對(duì)照組）各54例，qPCR檢驗(yàn)血清miR-10b表達(dá)量，分析ISS組患兒血清miR-10b表達(dá)與患兒臨床資料的關(guān)系。采用miR-10b inhibitor、si-TGFBR1及各自陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染C28/I2細(xì)胞，利用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測C28/I2細(xì)胞增殖能力，Western blot檢測侏儒相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（RUNX2）、X型膠原α1鏈（COL10A1）、轉(zhuǎn)化生長因子β受體1（TGFBR1）、SMAD3、pSMAD3蛋白表達(dá)量。在StarBase數(shù)據(jù)庫篩選miR-10b靶點(diǎn)，利用雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-10b與TGFBR1的靶向關(guān)系。結(jié)果 ISS組血清miR-10b表達(dá)量高于健康對(duì)照組，且miR-10b表達(dá)越高，患兒的身高、IGF-1、骨特異性堿性磷酸酶的下降越明顯（P＜0.05）。與NC組相比，miR-10b inhibitor組細(xì)胞增殖能力升高，RUNX2、COL10A1、TGFBR1、pSMAD3蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）；StarBase數(shù)據(jù)庫提示miR-10b存在TGFBR1的結(jié)合位點(diǎn)，雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)兩者結(jié)合。與si-NC相比，si-TGFBR1組TGFBR1表達(dá)量下調(diào)，細(xì)胞增殖能力下降（P＜0.05）。結(jié)論 miR-10b通過靶向TGFBR1/SMAD3通路在特發(fā)性矮小癥中抑制軟骨細(xì)胞的增殖、肥大。

關(guān)鍵詞：特發(fā)性矮小癥；受體，轉(zhuǎn)化生長因子βⅠ型；miR-10b；Smad3蛋白質(zhì)

中圖分類號(hào)：R752.8文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.11958/20230659

The mechanism of miR-10b targeting TGFBR1/SMAD3 pathway on chondrocyte?proliferation and hypertrophy in idiopathic short stature

Abstract： Objective To investigate the effect and mechanism of microRNA-10b （miR-10b） on idiopathic short stature （ISS）. Methods A total of 54 children with ISS and 54 healthy children were collected. The serum expression of miR-10b was detected by RT-qPCR， and the relationship between serum miR-10b expression and clinical data of children with ISS was analyzed. miR-10b inhibitor， si-TGFBR1 and their negative control transfection C28/I2 cells were used. CCK-8 experimental detection was used to detect C28/I2 cell proliferation. Western blot assay was used to detect gnome related transcription factor 2 （RUNX2）， collagen type X alpha 1 chain （COL10A1）， transforming growth factor beta receptor 1 （TGFBR1）， SMAD3 and pSMAD3 protein expression. The target of miR-10b was screened in StarBase database， and the targeting relationship between miR-10b and TGFBR1 was verified by dual luciferase reporter gene assay. Results The serum expression of miR-10b was higher in the ISS group than that of the healthy control group， and the higher the miR-10b expression， the more obvious the decrease of child height， IGF-1 and alkaline phosphatase? （P＜0.05）. Compared with the NC group， the cell proliferation ability and RUNX2， COL10A1， TGFBR1， and pSMAD3 protein expression were up-regulated in the miR-10b inhibitor group （P＜0.05）. StarBase database suggested that miR-10b had a binding site of TGFBR1， and dual luciferase reporter gene assay confirmed that TGFBR1 interacted with miR-10b （P＜0.05）. Compared with the si-NC group， the expression of TGFBR1 was down-regulated and the cell proliferation ability was decreased in the si-TGFBR1 group （P＜0.05）. Conclusion miR-10b inhibits chondrocyte proliferation and hypertrophy in idiopathic short stature by targeting TGFBR1/SMAD3 pathway.

Key words： idiopathic short stature; receptor， transforming growth factor-beta type Ⅰ; miR-10b; Smad3 protein

特發(fā)性矮小（idiopathic short stature，ISS）是矮小癥中最常見的類型，即患者生長激素水平正常，而身高在不伴有潛在病理狀態(tài)下低于同齡、同性別人群身高平均值2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差（SD）［1］。ISS病因不明，占所有身材矮小兒童的60％～80％，嚴(yán)重影響兒童生長發(fā)育與生活質(zhì)量，給心理健康造成極大影響，早發(fā)現(xiàn)、早診斷對(duì)改善患兒終身高至關(guān)重要。近年來，非編碼RNA生物標(biāo)志物研究成為熱點(diǎn)。研究表明，血液中微小RNA（microRNA，miRNA）在不同生理、病理狀態(tài)下具有特定的表達(dá)水平和模式，穩(wěn)定性、重復(fù)性較好，有助于疾病的早期診斷［2-3］。轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）信號(hào)通路在胚胎骨發(fā)育和出生后骨穩(wěn)態(tài)中都有重要作用，與早期胚胎發(fā)育和器官發(fā)生、免疫監(jiān)督、組織修復(fù)密切相關(guān)［4］。本課題組前期預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-10b在ISS兒童血清中上調(diào)表達(dá)量最高，本文進(jìn)一步研究miR-10b與ISS的關(guān)系及作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年8月—2021年8月在我院接受治療的54例ISS患者（ISS組）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）身高低于同性別、同年齡、同地區(qū)、同種族正常參考值平均數(shù)-2 SD。（2）出生時(shí)身長和體質(zhì)量正常，而且身材勻稱。（3）無明顯的慢性器質(zhì)性疾病（肝、腎、心、肺、內(nèi)分泌代謝病和骨骼發(fā)育障礙）。（4）無心理和嚴(yán)重的情感障礙，飲食正常。（5）生長速率稍慢或正常，一般每年生長速率＜5 cm。（6）染色體正常。（7）生長激素（GH）激發(fā)試驗(yàn)GH峰值≥10 μg/L，且胰島素樣生長因子1（IGF-1）濃度正常。（8）骨齡正常或延遲。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）資料不全者。（2）伴有系統(tǒng)性慢性疾病，如先天性心臟病、哮喘、營養(yǎng)不良等疾病者。ISS組男30例，女24例，年齡5～12歲，平均（8.77±0.35）歲，平均身高（122.3±11.42）cm。選取同期進(jìn)行體檢的健康兒童54例（健康對(duì)照組），男29例，女25例，年齡5～12歲，平均（8.69±0.46）歲，平均身高（133.2±10.61）cm，2組性別（χ2=0.037）、年齡（t=1.017）比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。ISS組身高較健康對(duì)照組下降（t=37.311，P＜0.01）。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)（2019醫(yī)研倫審第10號(hào)），患兒或家屬均知情并簽署研究同意書。所有對(duì)象于入院后首次檢查時(shí)采集血液樣本，采集后立即在液氮中冷凍，-80 °C的冰箱中保存待用。

1.2 細(xì)胞及試劑 人軟骨細(xì)胞系C28/I2、293T細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）和鏈霉素-青霉素雙抗均購自美國Gibco公司。TGF-β受體1（TGFBR1）、重組人SMAD家族成員3（SMAD3）、磷酸化SMAD3（pSMAD3）、X型膠原α1鏈（COL10A1）、侏儒相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（RUNX2）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的兔抗IgG二抗均購自英國Abcam公司，紅細(xì)胞裂解液購自北京索萊寶科技有限公司。BeyoRTTM II cDNA第一鏈合成試劑盒及ECL發(fā)光試劑購自碧云天生物技術(shù)有限公司。TaqMan? Universal PCR Master Mix、TaqMan miRNA特異性引物、pmirGLO-TGFBR1螢光素酶載體（野生型或突變型質(zhì)粒）均購自深圳華大基因有限公司，StepOne Plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自上海凌儀生物科技有限公司。Lipofectamine 3000 購自Invitrogen公司。miR-10b抑制物（miR-10b inhibitor）、模擬物（miR-10b mimic）及其對(duì)照（miR-NC）、TGFBR1小干擾RNA（si-TGFBR1）及其陰性對(duì)照（si-NC）均購自廣州銳博生物科技有限公司，DAB顯色劑購自武漢博士德公司。雙螢光素酶報(bào)告基因購自美國Promega公司。IGF?1、骨特異性堿性磷酸酶（BAP）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購于英國Immunodiagnostic systems公司。

1.3 方法

1.3.1 人血miR-10b檢測 利用3倍體積的紅細(xì)胞裂解液與血液樣本混勻，3 000 r/min離心10 min后移除上清液，可見白色顆粒沉于管底。隨后利用Trizol試劑提取總RNA，使用TaqMan MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，使用SYBR Green PCR Master Mix進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR），以U6基因作為內(nèi)參。20 μL反應(yīng)體系：SYBR? Green Realtime PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，55℃ 45 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。

1.3.2 血清IGF-1和BAP檢測 取ISS組空腹靜脈血5 mL，5 000 r/min離心10 min后取血清，采用ELISA法檢測IGF-1和BAP表達(dá)水平，檢測步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng) 使用添加10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)人軟骨細(xì)胞系C28/I2，將細(xì)胞置于5%CO2和37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。利用胰蛋白酶按照1∶2的比例進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.3.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長期C28/I2細(xì)胞，消化后制成單細(xì)胞懸液，將2×104個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液接種至6孔板內(nèi)。待軟骨細(xì)胞融合度達(dá)到30%～40%時(shí)，使用Lipofectamine 3000行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-10b inhibitor、miR-NC、si-TGFBR1及si-NC，分別為miR-10b inhibitor組、NC組、si-TGFBR1組、si-NC組。

1.3.5 qPCR檢測基因表達(dá) 利用Trizol試劑提取細(xì)胞中總RNA，參照1.3.1進(jìn)行qPCR檢測miR-10b表達(dá)，以U6基因作為內(nèi)參。另使用BeyoRTTM II cDNA第一鏈合成試劑盒逆轉(zhuǎn)得到cDNA，以GAPDH為內(nèi)參，使用TaqMan? Universal PCR Master Mix進(jìn)行qPCR，檢測TGFBR1、pSMAD3的表達(dá)水平。反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同方法1.3.1，以2-ΔΔct法計(jì)算目的基因的表達(dá)量，引物序列由華大基因公司合成，見表1。

1.3.6 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖 4組細(xì)胞接種于96孔板（每孔1×103個(gè)細(xì)胞），加入培養(yǎng)基正常培養(yǎng)，各時(shí)間點(diǎn)（0、24、48、72 h）均于37 ℃下加入CCK-8試劑 1 h。在450 nm波長處檢測光密度（OD）值。

1.3.7 Western blot檢測蛋白表達(dá) 采用RIPA試劑提取細(xì)胞總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量。蛋白質(zhì)經(jīng)10% SDS-PAGE分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用5%脫脂奶粉孵育1 h，TBST洗滌5次后滴加TGFBR1、SMAD3、pSMAD3、RUNX2、COL10A1、GAPDH一抗（均為1∶1 000稀釋），于4 ℃孵育過夜。與HRP標(biāo)記的兔抗IgG（1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST洗滌5次后用ECL發(fā)光試劑檢測蛋白條帶。以GAPDH為內(nèi)參，使用Image J軟件分析目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3.8 miR-10b與TGFBR1靶向關(guān)系的預(yù)測與驗(yàn)證 使用StarBase v2.0數(shù)據(jù)庫（https：//starbase.sysu.edu.cn/index.php）預(yù)測miR-10b與TGFBR1的結(jié)合位點(diǎn)；進(jìn)行雙螢光素酶報(bào)告基因測定確認(rèn)TGFBR1和miR-10b之間的結(jié)合關(guān)系。在12孔板中，1×105個(gè)細(xì)胞懸液培養(yǎng)至40%，利用Lipofectamine 2000將miR-10b模擬物或NC（50 nmol/L）和1 μg pmirGLO-TGFBR1螢光素酶載體（野生型或突變型質(zhì)粒）共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后24 h進(jìn)行螢光素酶活性檢測。細(xì)胞分組：TGFBR1 3?-UTR-WT+miR-10b mimic/NC、TGFBR1 3?-UTR-MUT+ miR-10b mimic/NC。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以[x] ±s表示，2組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-10b在ISS中的表達(dá) qPCR結(jié)果表明，ISS組血清miR-10b表達(dá)量高于健康對(duì)照組（2.68±0.25 vs. 1.12±0.21，t=35.111，P＜0.01）。以miR-10b中位表達(dá)量2.54為界，將ISS組分為miR-10b高表達(dá)組（≥2.54）和低表達(dá)組（＜2.54）各27例。

2.2 ISS組患兒血清miR-10b表達(dá)與患兒臨床資料的關(guān)系 miR-10b高、低表達(dá)組患兒體質(zhì)量和BMI差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；miR-10b低表達(dá)組身高、IGF-1、BAP高于高表達(dá)組（P＜0.05）。見表2。

2.3 抑制miR-10b表達(dá)促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖、肥大 qPCR結(jié)果表明，miR-10b inhibitor組miR-10b表達(dá)量低于NC組。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抑制miR-10b后48、72 h，C28/I2軟骨細(xì)胞增殖能力較NC組升高（P＜0.05），見表3。Western blot結(jié)果顯示，抑制miR-10b表達(dá)后，RUNX2及COL10A1蛋白表達(dá)量上調(diào)（P＜0.05），見圖1。

2.4 miR-10b調(diào)控TGFBR1/SMAD3通路 Western blot結(jié)果顯示，與NC組相比，抑制miR-10b表達(dá)后TGFBR1、pSMAD3表達(dá)上調(diào)（P＜0.01），見圖2。

2.5 miR-10b靶向調(diào)控TGFBR1 StarBase數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，miR-10b能與TGFBR1 mRNA的3'-UTR結(jié)合，見圖3A。雙螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明，在TGFBR1 WT中，與NC組相比，miR-10b mimic組螢光素酶活性降低（P＜0.05），在TGFBR1 MUT中，2組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3B。

2.6 敲低TGFBR1表達(dá)可抑制C28/I2細(xì)胞增殖 qPCR結(jié)果表明，si-TGFBR1組TGFBR1表達(dá)量低于si-NC組，TGFBR1低表達(dá)模型構(gòu)建成功。CCK-8結(jié)果顯示，抑制TGFBR1表達(dá)72 h后，C28/I2細(xì)胞增殖能力較si-NC組降低（P＜0.05），見表4。

3 討論

ISS是一種內(nèi)分泌相關(guān)疾病，診斷困難，發(fā)病機(jī)制不明，其發(fā)病原因與遺傳、骨骼發(fā)育障礙等多因素有關(guān)，已成為嚴(yán)重影響兒童身心健康的疾病之一［5］。目前，ISS的主要治療方法是重組人生長激素，但I(xiàn)SS患者并不表現(xiàn)生長激素缺乏，因此重組人生長激素對(duì)ISS患者療效不一。同時(shí)，臨床上使用大劑量重組人生長激素還會(huì)引起高血糖、高胰島素血癥及骨和軟骨瘤等不良反應(yīng)［6］。因此，進(jìn)一步闡明ISS的發(fā)病機(jī)制，探討ISS生物標(biāo)志物是當(dāng)前臨床關(guān)注的重點(diǎn)，做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷，以期降低ISS患病率或提高ISS患者的生活質(zhì)量。

ISS患者的主要臨床癥狀為生長遲緩，具體表現(xiàn)為身高、體質(zhì)量、骨骼生長、發(fā)育異常。骨骼發(fā)育主要與骨縱向生長有關(guān)，研究表明縱向骨主要與生長板驅(qū)動(dòng)有關(guān)，軟骨細(xì)胞在生長板內(nèi)經(jīng)歷細(xì)胞增殖、分化肥大，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為骨，影響骨的縱向生長［7］。目前，非編碼RNA的穩(wěn)定性、特異性已引起臨床廣泛關(guān)注，在腫瘤、炎癥、發(fā)育異常等各類疾病中發(fā)揮作用［8］。例如，LncRNA MALAT-1通過吸附miR-22促進(jìn)上皮性卵巢癌的生長和轉(zhuǎn)移［9］，下調(diào)miR-21是克服結(jié)腸癌、肝癌等癌癥耐藥的一種有前景的策略［10］。非編碼RNA可調(diào)控軟骨細(xì)胞的增殖和凋亡［11-12］，從而可能影響骨的縱向生長。lncRNA對(duì)骨代謝平衡有重要調(diào)控作用，可通過多種信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄因子影響間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程［13］。miR-143可以調(diào)節(jié)生長板的損傷［14］。既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-10b過表達(dá)可以抑制乳腺癌［15］、胃癌［16］細(xì)胞株的生長。另有研究發(fā)現(xiàn)［17］，miR-10b-5p可促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖，抑制肌纖維形成，但關(guān)于miR-10b對(duì)ISS的影響尚未見報(bào)道。筆者前期預(yù)試驗(yàn)通過對(duì)ISS患者和健康人標(biāo)本進(jìn)行高通量測序，發(fā)現(xiàn)miR-10b在ISS患者血清中高表達(dá)，但其具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚。在本研究中，進(jìn)一步擴(kuò)大患者樣本量，采用RT-qPCR進(jìn)一步證實(shí)了miR-10b在ISS患者組的表達(dá)量較健康對(duì)照組上調(diào)，提示miR-10b可能與ISS的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，是一個(gè)潛在的診斷生物標(biāo)志物。IGF?1與營養(yǎng)、骨代謝密切相關(guān)，且在青少年時(shí)期隨年齡增長和身體發(fā)育而增高，BAP主要由活躍的成骨細(xì)胞釋放，其水平升高表示骨代謝增加。本研究中ISS患兒miR-10b表達(dá)越高，IGF?1、BAP表達(dá)量越低，表明miR-10b與骨代謝、發(fā)育有關(guān)。骨是體內(nèi)最具活力的器官，通過骨的形成和吸收不斷進(jìn)行重塑。一系列的分子和途徑導(dǎo)致成骨細(xì)胞分化，而成骨分化又歸因于骨生成或骨形成。RUNX2是一種對(duì)成骨細(xì)胞分化和軟骨細(xì)胞成熟至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子［18］。在成骨細(xì)胞分化過程中，RUNX2在未定向間充質(zhì)細(xì)胞中弱表達(dá)，在前成骨細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，在未成熟成骨細(xì)胞中達(dá)到最高水平，在成熟成骨細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。近年來發(fā)現(xiàn)，許多miRNA可調(diào)控RUNX2的表達(dá)或活性，從而影響成骨過程。如miR-135和miR-203靶向RUNX2會(huì)抑制乳腺癌和轉(zhuǎn)移性骨病的進(jìn)展［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-10b表達(dá)后，RUNX2與COL10A1表達(dá)量較NC組升高，提示敲除miR-10b顯著促進(jìn)了軟骨細(xì)胞的增殖、肥大。

為探討miR-10b的潛在作用機(jī)制，筆者進(jìn)一步預(yù)測并證明TGFBR1基因是miR-10b的直接靶基因。TGFBR1是TGF-β/SMAD通路的重要組成部分，可以將TGF-β信號(hào)從細(xì)胞表面轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞質(zhì)中，這一過程對(duì)于軟骨細(xì)胞的增殖和分化是必不可少的。TGF-β作為一種多功能多肽細(xì)胞因子，在早期胚胎發(fā)育和成人體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用。SMAD蛋白不僅是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，而且是介導(dǎo)多種信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，如TGF-β、BMP和Wnt信號(hào)通路。TGF-β在與Ⅱ型受體（TGFBR2）結(jié)合后，會(huì)將TGFBR1募集到高度保守的近膜區(qū)域；然后激活的TGFBR1會(huì)磷酸化其下游靶標(biāo)，包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子SMAD家族成員SMAD2和SMAD3［20］。Xiao等［21］發(fā)現(xiàn)TGF-β/SMAD信號(hào)通路通過調(diào)控miR-455-5p/RUNX2軸抑制icmt誘導(dǎo)的終板軟骨細(xì)胞退變。本研究發(fā)現(xiàn)敲低TGFBR1的表達(dá)可抑制軟骨細(xì)胞的增殖，另外抑制miR-10b表達(dá)可上調(diào)TGFBR1蛋白及SMAD3的磷酸化水平，表明miR-10b可能通過靶向調(diào)控TGFBR1表達(dá)抑制SMAD3信號(hào)通路，從而調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖、肥大。

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