小鼠骨髓和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化能力的比較研究

鐘家?guī)? 馮玉梅

摘要：目的 探討小鼠骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSCs）和脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞（AD-MSCs）的定向分化能力。方法 從C57BL/6J小鼠股骨骨髓和腹股溝白色脂肪組織中分別分離和培養(yǎng)BM-MSCs和AD-MSCs，分別使用成骨、成軟骨和成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)兩種細(xì)胞定向分化。采用茜素紅、阿利新藍(lán)和油紅O染色檢測(cè)成骨、成軟骨和成脂分化程度；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）鑒定MSCs并檢測(cè)定向分化相關(guān)基因Runx2、Sp7（成骨），Sox9、Col2a1（成軟骨），Pparg和Cebpa（成脂）表達(dá)水平，確定細(xì)胞的定向分化能力?；贕EO數(shù)據(jù)庫(kù)中GSE43804和GSE122778數(shù)據(jù)集的小鼠和人類BM-MSCs和AD-MSCs基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，分析差異表達(dá)基因及其富集的信號(hào)通路。結(jié)果 分離培養(yǎng)得到的BM-MSCs和AD-MSCs細(xì)胞形態(tài)不同，AD-MSCs梭形形態(tài)更明顯；兩種細(xì)胞均表達(dá)CD29、CD44和CD90，不表達(dá)CD34和CD45。定向誘導(dǎo)后AD-MSCs的成骨和成脂分化程度高于BM-MSCs，而成軟骨分化程度低于BM-MSCs（P＜0.05）；定向誘導(dǎo)后AD-MSCs中Runx2、Pparg和Cebpa mRNA表達(dá)水平高于BM-MSCs，Sox9 mRNA表達(dá)水平低于BM-MSCs（P＜0.05）。小鼠和人的AD-MSCs高表達(dá)的基因富集于PPAR和WNT信號(hào)通路，BM-MSCs高表達(dá)的基因富集于軟骨和骨發(fā)育信號(hào)通路。結(jié)論 小鼠AD-MSCs成骨和成脂分化能力強(qiáng)于BM-MSCs，而成軟骨分化能力弱于BM-MSCs，PPAR、WNT、軟骨和骨發(fā)育信號(hào)通路的活化狀態(tài)在決定BM-MSCs和AD-MSCs不同定向分化潛能中起重要調(diào)節(jié)作用。

關(guān)鍵詞：間質(zhì)干細(xì)胞；骨髓；脂肪類；PPARγ；Wnt信號(hào)通路；成骨分化；成軟骨分化；成脂分化

中圖分類號(hào)：R329.24文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.11958/20230437

Comparative study on the directed differentiation ability of mouse bone marrow and?adipose-derived mesenchymal stem cells

Abstract： Objective To investigate the targeted differentiation ability of mouse bone marrow derived mesenchymal stem cells （BM-MSCs） and adipose-derived mesenchymal stem cells （AD-MSCs）. Methods BM-MSCs and AD-MSCs were isolated and cultured from bone marrow of femur and white adipose tissue of groin of C57BL/6J mice respectively， and the two types of cells were induced by osteogenic， chondrogenic and adipogenic differentiation medium respectively. Alizarin red， alcian blue and oil red O staining were used to detect the differentiated degree of osteogenic， chondrogenic and lipogenic differentiation. Real-time fluorescence quantitative PCR （qPCR） was used to identify MSCs and detected expression levels of directed differentiation-related genes Runx2， Sp7 （osteoblast）， Sox9， Col2a1 （chondroblast）， Pparg and Cebpa （lipogenesis） to determine the directed differentiation ability of cells. Based on gene expression profiles of mouse and human BM-MSCs and AD-MSCs in GEO database GSE43804 and GSE122778， the differentially expressed genes and their enrichment signal pathways were analyzed. Results The cell morphology of BM-MSCs and AD-MSCs obtained by isolation and culture was different， and spindle-shaped morphology was more obvious in AD-MSCs. Both cells expressed CD29， CD44 and CD90， but did not express CD34 and CD45. AD-MSCs showed higher osteogenic and lipogenic differentiation than those of BM-MSCs after directed induction， while chondrogenic differentiation was lower in AD-MSCs than that of BM-MSCs （P＜0.05）. After directional induction， expression levels of Runx2， Pparg and Cebpa mRNA were higher in AD-MSCs than those in BM-MSCs， and Sox9 mRNA expression levels were lower than those in BM-MSCs （P＜0.05）. Highly expressed genes of AD-MSCs in mice and human were enriched in PPAR and WNT signaling pathways. Highly expressed genes of BM-MSCs were enriched in cartilage and bone developmental signaling pathways. Conclusion The osteogenic and adipogenic differentiation ability of mouse AD-MSCs is stronger than those of BM-MSCs， while the chondrogenic differentiation ability AD-MSCs is weaker than that of BM-MSCs. The activation status of PPAR， WNT， cartilages and skeletal system development signaling pathways plays an important regulatory role in determining the different directional differentiation potential of AD-MSCs and BM-MSCs.

Key words： mesenchymal stem cells; bone marrow; fats; PPAR gamma; Wnt signaling pathway; osteogenic differentiation; chondrogenic differentiation; adipogenic differentiation

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是胚胎發(fā)育期間產(chǎn)生于中胚層的具有多譜系分化潛能和自我更新能力的成體干細(xì)胞，可分化為中胚層起源的所有細(xì)胞類型，如骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等。MSCs廣泛存在于骨髓和脂肪等成體組織和器官中［1］，根據(jù)其多譜系分化潛能以及通過趨化遷移到損傷部位的能力用于再生醫(yī)學(xué)和腫瘤靶向治療［2］。骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BM-MSCs）和脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，AD-MSCs）可分別在機(jī)體骨髓基質(zhì)和脂肪組織基質(zhì)中分離和培養(yǎng)，并均可在定向誘導(dǎo)條件下分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等多種細(xì)胞類型［3-5］，是組織修復(fù)和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用較多的MSCs［6-8］。但BM-MSCs與AD-MSCs向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞定向分化能力的差異和機(jī)制尚不明確。本研究通過定向誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)比較小鼠BM-MSCs和AD-MSCs向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞定向分化能力的差異，并通過小鼠和人類BM-MSCs和AD-MSCs基因表達(dá)譜差異表達(dá)基因及其富集的信號(hào)通路分析潛在的分子機(jī)制，以期為BM-MSCs和AD-MSCs的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡的C57BL/6J雄鼠購(gòu)于賽業(yè)（蘇州）生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2022-0016，使用許可證號(hào)：SYXK（津）2023-0001。小鼠飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，環(huán)境溫度20～26 ℃，晝夜溫差≤4 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，12 h交替明暗燈光。本研究通過天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查（倫理編號(hào)：AE-2022034），依據(jù)動(dòng)物倫理與福利的相關(guān)規(guī)定實(shí)施。

1.2 試劑和儀器 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購(gòu)于Gibco公司；Ⅰ型膠原酶和Trizol試劑購(gòu)于ThermoFisher公司；胰蛋白酶-EDTA、青霉素、鏈霉素和SuperScriptTM Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Invitrogen公司；胰島素購(gòu)于Selleckchem公司；抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒、阿利新藍(lán)染色液購(gòu)于Sigma公司；地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、吲哚美辛購(gòu)于MCE公司；油紅O染色液和1%茜素紅染色液購(gòu)于Solarbio公司；2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑購(gòu)于Vazyme公司。倒置顯微鏡Axio Observe購(gòu)于Zeiss公司；Alpha UnitTM Block Assembly for PTC DNA EngineTM Systems PCR儀購(gòu)于MJ Research公司；7500 Real-time PCR儀購(gòu)于Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 BM-MSCs和AD-MSCs的分離和培養(yǎng) 頸椎脫臼法處死小鼠，將其置于75%乙醇中浸泡15 min。在無(wú)菌條件下分離小鼠雙下肢和腹股溝區(qū)白色脂肪組織。（1）BM-MSCs的分離。取股骨并剔除肌肉組織與筋膜，剪去長(zhǎng)骨兩端，使用1 mL注射器針頭吸取含10%滅活FBS和1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔。骨髓懸液在37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)貼壁。（2）AD-MSCs的分離。將脂肪組織剪碎至1 mm3大小，加入4.5 mL含1%青-鏈霉素的PBS，500 μL的Ⅰ型膠原酶（10 g/L），37 ℃消化1 h，加入含10%滅活FBS和1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基終止消化。1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，用DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，40 μm濾網(wǎng)過濾后再次離心，重懸細(xì)胞后吹打均勻。將其接種至培養(yǎng)皿，在37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁。BM-MSCs和AD-MSCs置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)，定期觀察細(xì)胞形態(tài)，使用P2或P3代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖1。

1.3.2 MSCs的誘導(dǎo)分化 將BM-MSCs、AD-MSCs分別接種于12孔板中（每孔2×104個(gè)細(xì)胞）。BM-MSCs、AD-MSCs先用含10%滅活FBS和1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度約50%時(shí)，分別用成骨分化條件培養(yǎng)基（DMEM培養(yǎng)基中添加10%未滅活FBS、50 mg/L抗壞血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、10 nmol/L地塞米松和1%青-鏈霉素）、成軟骨分化條件培養(yǎng)基（DMEM培養(yǎng)基中添加10%未滅活FBS、100 nmol/L地塞米松、50 nmol/L抗壞血酸、6.5 mg/L胰島素、50 nmol/L轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒和1%青-鏈霉素）和成脂分化條件培養(yǎng)基（DMEM培養(yǎng)基中添加10%未滅活FBS、0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、100 μmol/L吲哚美辛、1 μmol/L地塞米松，10 μmol/L胰島素、1%青-鏈霉素）替換生長(zhǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行定向誘導(dǎo)分化，每2～3 d更換培養(yǎng)基，分化期間細(xì)胞置于5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。成骨和成軟骨分化21 d終止，成脂分化25 d終止。

1.3.3 染色鑒定MSCs分化程度 定向誘導(dǎo)分化結(jié)束后，對(duì)2組MSCs細(xì)胞進(jìn)行染色鑒定。棄掉培養(yǎng)液，用PBS清洗3次，4%多聚甲醛在室溫下固定30 min，蒸餾水清洗3次。1%茜素紅染色2～3 min鑒定誘導(dǎo)成骨MSCs的分化程度；1%阿利新藍(lán)染色15 min鑒定誘導(dǎo)成軟骨MSCs的分化程度；油紅O染色液染色15 min鑒定誘導(dǎo)成脂MSCs的分化程度（油紅O染前使用60%異丙醇浸洗細(xì)胞表面1 min，然使用異丙醇浸洗細(xì)胞表面2～3次，使間質(zhì)清晰），蒸餾水清洗3次。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，統(tǒng)計(jì)每組5個(gè)視野中平均鈣結(jié)節(jié)數(shù)、阿利新藍(lán)陽(yáng)性細(xì)胞比例和油紅O陽(yáng)性細(xì)胞比例以判斷誘導(dǎo)成骨、成軟骨和成脂分化程度。

1.3.4 逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-qPCR）鑒定MSCs并檢測(cè)定向分化相關(guān)基因表達(dá)水平 取定向誘導(dǎo)分化前和分化后的BM-MSCs和AD-MSCs，Trizol提取RNA，使用SuperScriptTMⅡ試劑盒配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：RNA 10 μL、Oligo（dT）1 μL、dNTP 4 μL、10×Buffer 2 μL、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL和RNase 1 μL，DEPC水補(bǔ)至20 μL。將其置于PCR儀中逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件：25 ℃ 5 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。以cDNA為模板，使用SYBR Mix試劑盒配制反應(yīng)體系：SYBR Mix 10 μL，上、下游引物各0.6 μL，cDNA 1 μL，無(wú)核酸水補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min；95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；檢測(cè)CD29、CD44，CD90、CD34和CD45 mRNA表達(dá)水平以鑒定MSCs；檢測(cè)成骨分化標(biāo)志基因：Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）和Sp7；成軟骨分化標(biāo)志基因：SRY-box轉(zhuǎn)錄因子（Sox9）和Ⅱ型α1膠原蛋白（Col2a1）；成脂分化標(biāo)志基因：過氧化物酶體增殖物激活受體γ（Pparg）和CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（Cebpa）的表達(dá)水平。所有引物序列均在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中利用Primer-Blast設(shè)計(jì)，經(jīng)Blast數(shù)據(jù)庫(kù)核酸序列比對(duì)無(wú)誤后，由北京生工工程有限生物公司合成，序列見表1。以樣本中的Gapdh mRNA表達(dá)水平作為內(nèi)參，依據(jù)公式ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH，后計(jì)算2-ΔCt值以表示目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.5 MSCs基因表達(dá)譜分析 鼠源BM-MSCs（mBM-MSCs）和鼠源AD-MSCs（mAD-MSCs）基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集（GSE43804）來自公開發(fā)表的GEO數(shù)據(jù)庫(kù)，包括3只8周齡朋友病毒B型（friend virus B-type，F(xiàn)VB）背景小鼠股骨骨髓和腹股溝白色脂肪的BM-MSCs和AD-MSCs全基因組基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)（n=3）。人源BM-MSCs（hBM-MSCs）和人源AD-MSCs（hAD-MSCs）基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集（GSE122778）中包括來自14名健康志愿者骨髓和白色脂肪的BM-MSCs和AD-MSCs全基因組基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)。所有數(shù)據(jù)歸一化處理，篩選Log2 fold change（LogFC）＞1且P＜0.05的表達(dá)差異基因，繪制帶基因標(biāo)注的火山散點(diǎn)圖。GO數(shù)據(jù)庫(kù)富集分析鼠源和人源MSCs不同組織部位中的差異基因。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以[[x] ±s

]表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MSCs的鑒定和細(xì)胞形態(tài)的比較 分離培養(yǎng)3 d時(shí)，BM-MSCs組中造血系細(xì)胞較多（圓形細(xì)胞），AD-MSCs中較少。6 d內(nèi)3次換液后，造血系細(xì)胞幾乎全部脫落，MSCs純化完成。培養(yǎng)至7 d時(shí)，2種MSCs均呈紡錘狀，但AD-MSCs較修長(zhǎng)，梭形更明顯，見圖2。qRT-PCR結(jié)果顯示BM-MSCs和AD-MSCs表達(dá)CD29、CD44和CD90，不表達(dá)CD34和CD45，見表2。

2.2 BM-MSCs和AD-MSCs成軟骨、成骨和成脂分化程度比較 茜素紅染色結(jié)果顯示，AD-MSCs組鈣結(jié)節(jié)數(shù)（個(gè)/視野）多于BM-MSCs組（8±1 vs. 4±1，n=3，t=4.472，P＜0.05），見圖3。阿利新藍(lán)染色結(jié)果顯示，AD-MSCs組阿利新藍(lán)陽(yáng)性細(xì)胞比例（%）低于BM-MSCs組（63.82±6.68 vs. 83.42±9.88，n=3，t=3.408，P＜0.05），見圖4。油紅O染色結(jié)果顯示，AD-MSCs組油紅O陽(yáng)性細(xì)胞比例（%）高于BM-MSCs組（71.26±9.97 vs. 32.93±10.31，n=3，t=4.111，P＜0.05），見圖5。

2.3 定向誘導(dǎo)分化前后BM-MSCs和AD-MSCs的標(biāo)志基因表達(dá)水平 2種MSCs定向成骨分化，誘導(dǎo)分化前，AD-MSCs組Sp7 mRNA表達(dá)水平低于BM-MSCs組（P＜0.05），而誘導(dǎo)后AD-MSCs組中Runx2 mRNA表達(dá)水平高于BM-MSCs組（P＜0.05）；定向誘導(dǎo)成軟骨分化前后，BM-MSCs中Sox9 mRNA表達(dá)水平均高于AD-MSCs組（P＜0.05）；成脂分化后，AD-MSCs組中Pparg和Cebpa mRNA水平高于BM-MSCs組（P＜0.05），而分化前無(wú)明顯差異。見表3—5。

2.4 BM-MSCs與AD-MSCs基因表達(dá)差異比較 小鼠和人類2種不同組織來源MSCs的分化相關(guān)基因有類似的差異水平。如圖6所示，篩選鼠源和人源兩種組織來源的MSCs共同的差異表達(dá)基因，基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)顯示，在mBM-MSCs和hBM-MSCs中，Runx2、Sp7、Sox9、Col2a1、蛋白聚糖（Acan）、無(wú)翼型MMTV結(jié)合位點(diǎn)家族配體5a（Wnt5a）、SRX-Box轉(zhuǎn)錄因子11（Sox11）和纖連蛋白（Fn1）等基因高表達(dá)，而在mAD-MSCs和hAD-MSCs中Pparg、Cebpa、脂肪酸結(jié)合蛋白5（Fabp5）、Wnt2b、Wnt4、卷曲類受體4（Fzd4）和分泌型卷曲類受體2（Sfrp2）等基因低表達(dá)。GO富集分析顯示鼠源和人源BM-MSCs高表達(dá)的基因均富集到軟骨和骨發(fā)育系統(tǒng)信號(hào)通路，而AD-MSCs高表達(dá)的基因均富集到PPAR信號(hào)通路和利于成骨的WNT信號(hào)通路，見圖7、8。

3 討論

體外分離和培養(yǎng)BM-MSCs和AD-MSCs是MSCs用于骨和軟骨組織修復(fù)和再生的最常用方法［3-5］，但BM-MSCs和AD-MSCs的定向分化能力的差異及其機(jī)制尚待深入研究。本研究從C57BL/6J小鼠股骨骨髓和腹股溝白色脂肪組織中分別分離和培養(yǎng)BM-MSCs和AD-MSCs，分別使用成骨、成軟骨和成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)2種細(xì)胞定向分化，發(fā)現(xiàn)定向誘導(dǎo)AD-MSCs的成骨和成脂分化程度高于BM-MSCs，而成軟骨分化程度低于BM-MSCs。

Huang等［9］對(duì)比FVB小鼠來源的mAD-MSCs和mBM-MSCs誘導(dǎo)成骨分化的能力，結(jié)果顯示AD-MSCs的成骨分化率高于BM-MSCs。Stukel等［10］誘導(dǎo)人類的BM-MSCs和AD-MSCs成骨分化，發(fā)現(xiàn)兩者具有相似的堿性磷酸酶活性，但在自適配形狀記憶聚合物支架上，在成骨培養(yǎng)基中只有使用AD-MSCs培養(yǎng)的支架在細(xì)胞培養(yǎng)和成骨分化21 d后硬度和局部模量比空白支架增加，且對(duì)骨缺損的治療效果表現(xiàn)最好。Grottkau等［11］誘導(dǎo)大鼠來源的BM-MSCs與AD-MSCs成骨分化48 h，BM-MSCs和AD-MSCs中Sp7和Runx2 mRNA的表達(dá)水平均顯著上調(diào)，而骨鈣素mRNA的表達(dá)水平僅在AD-MSCs中顯著上調(diào)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）2 mRNA在BM-MSCs中的上調(diào)速度明顯慢于AD-MSCs，表明AD-MSCs比BM-MSCs更有成骨分化潛能。Hiwatashi等［12］研究發(fā)現(xiàn)，比格犬來源的AD-MSCs在修復(fù)瘢痕過程中產(chǎn)生的膠原蛋白密度較BM-MSCs組低，提示AD-MSCs成軟骨能力較BM-MSCs弱。然而，Mohamed-Ahmed等［3，13］比較hBM-MSCs和hAD-MSCs在大鼠顱骨缺損支架上的骨再生能力，結(jié)果表明hBM-MSCs的堿性磷酸酶活性高于hAD-MSCs，hBM-MSCs支架比hAD-MSCs支架具有更高的細(xì)胞活性，骨再生速度比hAD-MSCs快。Hayashi等［14］通過體外培養(yǎng)和體內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)比較大鼠來源的BM-MSCs和AD-MSCs的成骨分化能力，結(jié)果顯示BM-MSCs具有更強(qiáng)的成骨分化能力。

由上述相關(guān)研究可知，目前對(duì)于BM-MSCs和AD-MSCs的定向分化潛能比較研究的結(jié)論并不一致。筆者推測(cè)BM-MSCs與AD-MSCs分化能力差異的不確定性與MSCs分化過程中啟動(dòng)的多個(gè)信號(hào)通路的調(diào)控有關(guān)，于是通過小鼠與人類MSCs基因表達(dá)譜的數(shù)據(jù)分析了造成這種差異的潛在分子機(jī)制。MSCs向特定細(xì)胞類型的分化受多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)分子和轉(zhuǎn)錄因子等的控制［15］。在MSCs向骨細(xì)胞分化過程中起關(guān)鍵作用的主要轉(zhuǎn)錄因子是Runx2和Sp7［16］。本研究誘導(dǎo)分化前mAD-MSCs中Sp7 mRNA表達(dá)水平低于mBM-MSCs，但成骨分化能力強(qiáng)于mBM-MSCs，筆者推測(cè)在成骨分化過程中，影響細(xì)胞干性的Wnt信號(hào)通路在AD-MSCs中被高度激活，大量Wnt配體的產(chǎn)生增強(qiáng)了AD-MSCs的細(xì)胞干性，提高了其成骨分化的能力。Su等［17］通過生物信息學(xué)分析C57BL/6J小鼠來源mBM-MSCs和mAD-MSCs在成骨潛能方面的差異，結(jié)果表明Wnt和BMP信號(hào)在mBM-MSCs和mAD-MSCs的成骨分化過程中被差異激活，mBM-MSCs和mAD-MSCs通過不同的信號(hào)通路促進(jìn)成骨分化，可能是造成2種MSCs成骨分化潛能差異的分子機(jī)制。Sox9通過控制膠原蛋白的表達(dá)，調(diào)控MSCs的軟骨分化過程［18］。本研究中2種MSCs的Col2a1 mRNA表達(dá)水平無(wú)顯著差異，筆者推測(cè)BM-MSCs和AD-MSCs的成軟骨分化能力的不同是由于Sox9差異調(diào)控了其他膠原蛋白表達(dá)而非Col2a1。Pparg是調(diào)節(jié)MSCs成脂分化過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子，抑制Pparg和Cebpa的表達(dá)可抑制脂肪的形成［19］。本研究中誘導(dǎo)分化后Pparg和Cebpa mRNA的表達(dá)差異證明了2種MSCs的定向分化能力不同，而分化前Pparg和Cebpa mRNA在2種MSCs中被差異激活，這可能是造成2種MSCs定向分化能力差異的分子機(jī)制。

基于對(duì)小鼠和人類BM-MSCs和AD-MSCs基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)的分析，筆者發(fā)現(xiàn)除了本文重點(diǎn)檢測(cè)的定向誘導(dǎo)分化相關(guān)的標(biāo)志基因外，在mBM-MSCs和hBM-MSCs中共同高表達(dá)的基因Acan、Sox11和Fn1是常被報(bào)道為調(diào)控MSCs成軟骨分化的細(xì)胞因子［18］，而Wnt5a則作為Wnt信號(hào)通路配體調(diào)控MSCs的成骨分化過程［15］。mAD-MSCs和hAD-MSCs中高表達(dá)基因Fabp5屬于PPARγ信號(hào)通路中分泌蛋白的一種，參與脂肪酸結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)過程，調(diào)控MSCs成脂分化過程［19］，而Wnt2b、Wnt4、Fzd4和Sfrp2都是Wnt信號(hào)通路中的配體，參與調(diào)控成骨分化過程［15］。這些差異表明無(wú)論鼠源還是人源BM-MSCs都有更強(qiáng)的成軟骨分化潛能，而AD-MSCs有更強(qiáng)的成脂分化潛能。AD-MSCs高表達(dá)的基因富集于PPAR和WNT信號(hào)通路，BM-MSCs高表達(dá)的基因富集于軟骨和骨發(fā)育信號(hào)通路。這說明PPAR、WNT、軟骨和骨發(fā)育信號(hào)通路表達(dá)水平不同導(dǎo)致了BM-MSCs和AD-MSCs定向分化潛能的差異。

綜上所述，本研究證明小鼠AD-MSCs具有更強(qiáng)的成骨、成脂分化能力，BM-MSCs具有更強(qiáng)的成軟骨分化能力，隨著未來對(duì)MSCs與分化關(guān)系的深入研究，將會(huì)為BM-MSCs和AD-MSCs的臨床應(yīng)用提供更為準(zhǔn)確深刻的實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

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