BMAL1減輕H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷機(jī)制研究

易娜 肖雯 田源 袁李禮

摘要：目的 探討腦和肌肉組織芳香烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的類似蛋白1（BMAL1）通過(guò)核因子E2相關(guān)因子2（NRF2）調(diào)節(jié)活性氧（ROS）/NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）炎癥小體通路對(duì)過(guò)氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響。方法 體外培養(yǎng)H9c2細(xì)胞和BMAL1穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的H9c2細(xì)胞，建立H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷模型，并將細(xì)胞分為對(duì)照（Control）組、H2O2組、BMAL1過(guò)表達(dá)（BMAL1-OE）組、BMAL1過(guò)表達(dá)+H2O2（BMAL1-OE+H2O2）組、BMAL1過(guò)表達(dá)+NRF2抑制劑（BMAL1-OE+ML385）組、BMAL1過(guò)表達(dá)+NRF2抑制劑+H2O2（BMAL1-OE+ML385+H2O2）組。采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，熒光探針2'，7'-二氯熒光素二乙酸酯檢測(cè)ROS生成，Western blot檢測(cè)BMAL1、NRF2和NLRP3蛋白表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)白細(xì)胞介素（IL）-1β釋放。結(jié)果 與Control組相比，H2O2組H9c2心肌細(xì)胞活力減弱，ROS生成增多，BMAL1和NRF2蛋白表達(dá)水平降低，NLRP3蛋白表達(dá)水平升高，IL-1β釋放增多（P＜0.05）；與H2O2組相比，BMAL1-OE+H2O2組H9c2心肌細(xì)胞活力升高，ROS生成減少，BMAL1和NRF2蛋白表達(dá)水平升高，NLRP3蛋白表達(dá)水平降低，IL-1β釋放減少（P＜0.05）。與BMAL1-OE+H2O2組相比，BMAL1-OE+ML385+H2O2組H9c2心肌細(xì)胞活力減弱，ROS生成增多，NLRP3蛋白表達(dá)水平升高，IL-1β釋放增多（P＜0.05）。結(jié)論 BMAL1可減輕H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能與NRF2調(diào)節(jié)ROS/NLRP3炎癥小體通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞：ARNTL轉(zhuǎn)錄因子類；NF-E2相關(guān)因子2；活性氧；NLR家族，熱蛋白結(jié)構(gòu)域包含蛋白3；腦和肌肉組織芳香烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的類似蛋白1；炎癥小體

中圖分類號(hào)：R542.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.11958/20231027

Mechanism of BMAL1 attenuating H2O2-induced cardiomyocyte injury

Abstract： Objective To investigate the effect of BMAL1 on H2O2-induced cardiomyocyte injury through NRF2-regulated ROS/NLRP3 inflammasome pathway. Methods H9c2 cells and H9c2 cells with stable over-expressed BMAL1 were cultured and divided into the control group， the H2O2 group， the BMAL1-OE group， the BMAL1-OE+H2O2 group， the BMAL1-OE+ML385 group and the BMAL1-OE+ML385+H2O2 group. All groups were pre-intervened with corresponding inhibitors， and then treated with 0.2 mmol/L H2O2， except for the control group and the BMAL1-OE group. After the intervention， CCK-8 assay was used to measure cell viability， fluorescent probe DCFH-DA was used to measure ROS generation and Western blot assay was used to detect BMAL1， NRF2 and NLRP3 protein expressions. ELISA was used to determine IL-1β release. Results Compared with the control group， the cell viability was decreased， ROS generation was increased， BMAL1 and NRF2 protein expressions were decreased， NLRP3 expression and IL-1β release were increased in the H2O2 group （P＜0.05）. Compared with the H2O2 group， the cell viability was increased， ROS generation was decreased， BMAL1-OE and NRF2 protein expressions were increased， NLRP3 expression and IL-1β release were decreased in the BMAL1-OE+H2O2 group （P＜0.05）. Compared with the BMAL1-OE+H2O2 group， the cell viability was decreased， ROS generation was increased， NLRP3 expression and IL-1β release were increased in the BMAL1-OE+ML385+H2O2 group （P＜0.05）. Conclusion BMAL1 attenuates H2O2-induced H9c2 cardiomyocyte injury， and its mechanism may be related to the regulation of ROS/NLRP3 inflammasome pathway through NRF2.

Key words： ARNTL transcription factors; NF-E2-related factor 2; reactive oxygen species; NLR family， pyrin domain-containing 3 protein; BMAL1; inflammasome

心血管疾病的發(fā)病率和死亡率較高，為我國(guó)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題［1］。炎癥免疫因素在心血管疾病中發(fā)揮重要作用［2］，NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）炎癥小體在心血管疾病中的作用受到廣泛關(guān)注［3］。多種心血管疾病的危險(xiǎn)因素均能激活NLRP3炎癥小體［4］。因此，探討NLRP3炎癥小體通路對(duì)心血管疾病的調(diào)控有助于尋找新的心肌細(xì)胞保護(hù)策略和靶點(diǎn)。心血管疾病的發(fā)作有晝夜變化的特點(diǎn)。生物鐘相關(guān)基因參與心血管疾病的病理生理學(xué)過(guò)程［5］。本課題組前期研究證實(shí)，作為生物鐘晝夜節(jié)律調(diào)控重要元件之一的腦和肌肉組織芳香烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的類似蛋白1（BMAL1）可通過(guò)核因子E2相關(guān)因子2（NRF2）減輕過(guò)氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷［6］，但具體機(jī)制尚未明確。BMAL1是否通過(guò)調(diào)控NLRP3炎癥小體通路而減輕心血管疾病時(shí)的細(xì)胞損傷尚不清楚。本文在前期研究基礎(chǔ)上，選用H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，探討B(tài)MAL1通過(guò)NRF2調(diào)節(jié)活性氧（ROS）/NLRP3炎癥小體的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 H9c2心肌細(xì)胞和BMAL1穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的H9c2心肌細(xì)胞為本室保存；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液（PBS）、胰蛋白酶、100×青霉素/鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；H2O2購(gòu)自Sigma公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑-8（CCK-8）購(gòu)自東仁化學(xué)公司；ROS檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；白細(xì)胞介素（IL）-1β酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司；兔抗大鼠BMAL1、NRF2、NLRP3和GAPDH抗體以及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗購(gòu)自Abcam公司；NRF2特異性抑制劑ML385購(gòu)自MCE公司；全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自Biotek公司，蛋白電泳分離、轉(zhuǎn)膜和化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)自Bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和模型構(gòu)建 采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)H9c2細(xì)胞。BMAL1穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的H9c2心肌細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)另添加1 mg/L的嘌呤霉素。采用終濃度為0.2 mmol/L的H2O2誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞損傷模型，處理24 h后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 細(xì)胞分為對(duì)照（H9c2心肌細(xì)胞，Control）組、H2O2（0.2 mmol/L H2O2處理H9c2心肌細(xì)胞24 h）組、BMAL1過(guò)表達(dá)（BMAL1穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的H9c2心肌細(xì)胞，BMAL1-OE）組、BMAL1過(guò)表達(dá)+H2O2（0.2 mmol/L H2O2處理BMAL1穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的H9c2心肌細(xì)胞24 h，BMAL1-OE+H2O2）組、BMAL1過(guò)表達(dá)+NRF2抑制劑（2 μmol/L ML385預(yù)處理BMAL1穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的H9c2心肌細(xì)胞12 h，BMAL1-OE+ML385）組、BMAL1過(guò)表達(dá)+NRF2抑制劑+H2O2（2 μmol/L ML385預(yù)處理BMAL1穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的H9c2心肌細(xì)胞12 h后再予以0.2 mmol/L H2O2繼續(xù)處理24 h，BMAL1-OE+ML385+H2O2）組。

實(shí)驗(yàn)分為2個(gè)部分：實(shí)驗(yàn)1分組設(shè)置為Control組、H2O2組、BMAL1-OE組、BMAL1-OE+H2O2組，研究BMAL1對(duì)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響；實(shí)驗(yàn)2分組設(shè)置為BMAL1-OE組、BMAL1-OE+H2O2組、BMAL1-OE+ML385組、BMAL1-OE+ML385+H2O2組，研究NRF2在BMAL1參與心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷過(guò)程中的作用。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 細(xì)胞按1×104個(gè)/孔接種于96孔板，分組干預(yù)后，每孔更換為含10 μL CCK-8試劑的PBS溶液，37 ℃培養(yǎng)1 h后，采用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處吸光度（A450）值。

1.2.4 熒光探針2'，7'-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）檢測(cè)細(xì)胞ROS 細(xì)胞按1×104個(gè)/孔接種于96孔板，分組干預(yù)后，每孔更換含終濃度為10 μmol/L DCFH-DA的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)20 min，采用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基清洗細(xì)胞3次以去除未進(jìn)入細(xì)胞的DCFH-DA，通過(guò)全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀488 nm波長(zhǎng)激發(fā)，測(cè)定525 nm發(fā)射波長(zhǎng)的吸光度值（A525），并計(jì)算各組的相對(duì)ROS比率（各實(shí)驗(yàn)組A525/對(duì)照組A525×100%）。

1.2.5 Western blot檢測(cè)細(xì)胞BMAL1、NRF2和NLRP3蛋白表達(dá) 細(xì)胞按1×106個(gè)/孔接種于6孔板，分組干預(yù)后收集細(xì)胞，RIPA裂解液提取總蛋白，BCA定量蛋白后變性。通過(guò)10% SDS-PAGE對(duì)蛋白進(jìn)行電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，加入BMAL1（1∶1 000）、NRF2（1∶1 000）、NLRP3（1∶1 000）和GAPDH抗體（1∶2 000），4 ℃孵育12 h，TBST清洗后用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（1∶2 000）室溫孵育1 h，TBST清洗后加入ECL液后化學(xué)發(fā)光，應(yīng)用成像系統(tǒng)采集，Image Lab分析灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算各目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞IL-1β釋放 細(xì)胞按1×104個(gè)/孔接種于96孔板，分組干預(yù)后收集細(xì)胞上清液，1 000 r/min離心5 min，去除細(xì)胞殘留，采用ELISA法檢測(cè)IL-1β含量，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以[[x] ±s

]表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMAL1對(duì)H2O2誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞損傷和ROS生成的影響 與Control組相比，H2O2組H9c2心肌細(xì)胞活力減弱，ROS水平增高（P＜0.05），BMAL1-OE組H9c2心肌細(xì)胞活力和ROS水平無(wú)明顯變化（P＞0.05）；與H2O2組相比，BMAL1-OE+H2O2組H9c2心肌細(xì)胞活力升高，ROS水平降低（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.2 BMAL1對(duì)H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞NRF2和NLRP3蛋白表達(dá)的影響 與Control組相比，H2O2組H9c2心肌細(xì)胞BMAL1和NRF2蛋白表達(dá)水平降低，NLRP3蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），BMAL1-OE組H9c2心肌細(xì)胞BMAL1和NRF2蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），NLRP3蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化（P＞0.05）；與H2O2組相比，BMAL1-OE+H2O2組H9c2心肌細(xì)胞BMAL1和NRF2蛋白表達(dá)水平升高，NLRP3蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

2.3 BMAL1對(duì)H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞IL-1β釋放的影響 與Control組相比，H2O2組H9c2心肌細(xì)胞IL-1β釋放增多（P＜0.05），BMAL1-OE組H9c2心肌細(xì)胞IL-1β釋放無(wú)明顯變化（P＞0.05）；與H2O2組相比，BMAL1-OE+H2O2組H9c2心肌細(xì)胞IL-1β釋放減少（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

2.4 BMAL1通過(guò)NRF2影響H2O2誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞損傷和ROS生成 與BMAL1-OE組相比，BMAL1-OE+ML385組H9c2心肌細(xì)胞活力和ROS水平無(wú)明顯變化（P＞0.05）；與BMAL1-OE+H2O2組相比，BMAL1-OE+ML385+H2O2組H9c2心肌細(xì)胞活力減弱，ROS水平增高（P＜0.05），見(jiàn)表2。

2.5 BMAL1通過(guò)NRF2影響H2O2誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞NLRP3蛋白表達(dá) 與BMAL1-OE組相比，BMAL1-OE+ML385組H9c2心肌細(xì)胞NLRP3表達(dá)無(wú)明顯差異（P＞0.05）；與BMAL1-OE+H2O2組相比，BMAL1-OE+ML385+H2O2組H9c2心肌細(xì)胞NLRP3表達(dá)升高（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

2.6 BMAL1通過(guò)NRF2影響H2O2誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞IL-1β釋放 與BMAL1-OE組相比，BMAL1-OE+ML385組H9c2心肌細(xì)胞IL-1β釋放無(wú)明顯變化（P＞0.05）；與BMAL1-OE+H2O2組相比，BMAL1-OE+ML385+H2O2組H9c2-心肌細(xì)胞IL-1β釋放增多（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

3 討論

心血管疾病受到生物鐘節(jié)律因素的影響［7］。本課題組前期研究表明生物鐘節(jié)律調(diào)控的核心基因之一的BMAL1能減輕H2O2誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞損傷，并成功構(gòu)建BMAL1穩(wěn)定過(guò)表達(dá)H9c2細(xì)胞［6］。本研究采用經(jīng)典的H2O2誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型［8］，結(jié)果顯示，H9c2細(xì)胞經(jīng)H2O2誘導(dǎo)后，細(xì)胞活力降低、ROS生成增多，H9c2細(xì)胞發(fā)生損傷，模型建立成功。BMAL1穩(wěn)定過(guò)表達(dá)能抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞活力降低和ROS產(chǎn)生，提示BMAL1可減輕H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷，具有潛在的保護(hù)作用。

NLRP3炎癥小體與多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其在心肌細(xì)胞損傷中的作用也日益受到重視［9］。NLRP3炎癥小體的活化包含啟動(dòng)和激活兩個(gè)方面，其中ROS的生成是NLRP3炎癥小體激活最主要的機(jī)制［10］，而ROS生成增多引起的氧化應(yīng)激亦是心肌損傷的核心機(jī)制之一［11］。針對(duì)ROS/NLRP3炎癥小體激活的調(diào)控能影響細(xì)胞的病理生理進(jìn)程［12-13］，但BMAL1的心肌細(xì)胞保護(hù)作用是否與NLRP3炎癥小體有關(guān)尚不明確。Hong等［14］研究表明BMAL1能調(diào)控巨噬細(xì)胞NLRP3介導(dǎo)的IL-1β釋放。本研究結(jié)果顯示，BMAL1穩(wěn)定過(guò)表達(dá)能抑制H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞NLRP3蛋白高表達(dá)和IL-1β釋放，提示BMAL1能減輕心肌細(xì)胞ROS/NLRP3炎癥小體通路活化，這也可能是其減輕H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷的機(jī)制之一。

生物體內(nèi)有著復(fù)雜的抗氧化還原體系，用于控制ROS水平并防止其過(guò)量積累［15］，NRF2則是其中的一種重要的氧化還原敏感性轉(zhuǎn)錄因子，能激活下游一系列抗氧化基因，降低ROS水平，從而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)［16-17］。有研究報(bào)道BMAL1可通過(guò)調(diào)節(jié)NRF2來(lái)影響氧化還原穩(wěn)態(tài)［18-19］。本研究結(jié)果亦顯示，BMAL1高表達(dá)能促進(jìn)NRF2表達(dá)。為探究NRF2在其中的作用，采用抑制劑ML385處理H9c2細(xì)胞，結(jié)果顯示ML385減少BMAL1對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞活力和ROS生成的抑制作用，提示NRF2參與BMAL1對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。而Early等［20］研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞BMAL1通過(guò)NRF2調(diào)控IL-1β釋放。本研究結(jié)果顯示，ML385增加BMAL1對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞NLRP3和IL-1β的蛋白表達(dá)釋放，提示BMAL1通過(guò)NRF2調(diào)節(jié)ROS/NLRP3炎癥小體通路及H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。

綜上所述，BMAL1能減輕H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能與NRF2調(diào)節(jié)ROS/NLRP3炎癥小體通路有關(guān)。本研究為BMAL1在心血管疾病中發(fā)揮氧化和炎癥反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)作用提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但本研究?jī)H通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)了BMAL1對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響機(jī)制，在體內(nèi)的作用機(jī)制還需繼續(xù)探索。

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