基于Nrf2通路姜黃素抑制卡介苗感染巨噬細胞氧化應激①

趙劍秋 韓曉群 鄧 琴 楊 婧 吳快英 黃 歡 （宜春學院，宜春 336000）

巨噬細胞是結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）的主要靶細胞和寄居場所，也是人體感染MTB 后免疫反應的關鍵免疫細胞［1-2］。巨噬細胞可通過炎癥反應、脂質(zhì)代謝、自噬、凋亡等一系列機制發(fā)揮抗MTB 作用，反過來，MTB 亦可通過一系列機制調(diào)控巨噬細胞的功能，以利于其在巨噬細胞內(nèi)的存活和復制，其中重要機制之一MTB 對巨噬細胞氧化應激的調(diào)節(jié)。研究證實，MTB 感染會導致細胞和組織的氧化性損傷，最終引起脂質(zhì)過氧化和 細 胞 死 亡［3］?；?性 氧（reactive oxygen species，ROS）的積累是活動性肺結(jié)核發(fā)生強烈氧化應激的特征之一［4］。

核因子NF-E2 相關因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）是抗氧化應激最重要的轉(zhuǎn)錄因子之一［5］，通過調(diào)控下游抗氧化酶基因轉(zhuǎn)錄及表達產(chǎn)生大量保護性酶，如醌氧化還原酶1［NAD（P）H：quinone oxidoreductase 1，NQO1］和血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HO-1）等，進一步發(fā)揮抗氧化應激作用［6］。已有報道，Nrf2 激活劑能夠增強MTB 感染巨噬細胞活性，降低ROS 水平，減輕細胞脂質(zhì)損傷［7］。表明Nrf2信號通路可能是保護巨噬細胞免受氧化損傷的潛在靶標。

姜黃素是姜黃的主要活性成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化等廣泛的藥理作用［8］。研究報道，姜黃素可通過抑制炎癥反應增強巨噬細胞對MTB 感染的控制作用，近年來被認為是一種很有前途的抗結(jié)核藥物［9-10］。但其能否通過Nrf2 通路對MTB 感染巨噬細胞氧化應激產(chǎn)生影響，尚未見相關報道。

由于強毒性MTB 的培養(yǎng)條件和安全性等方面有著多重限制，卡介苗（bacillus calmette-guerin vaccine，BCG）來源于牛型MTB，其毒性雖然相對于MTB 明顯降低，但仍然能夠激活宿主的免疫細胞，引起機體一系列的免疫反應，考慮到BCG 的安全性、可行性和經(jīng)濟性，因此BCG 廣泛用于結(jié)核病細胞模型建立。

本研究通過BCG 感染巨噬細胞建立體外氧化應激模型，探討姜黃素對BCG 感染巨噬細胞氧化應激的影響及機制，以期為探討結(jié)核病發(fā)病機制、開展宿主導向治療方法提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株和細胞 BCG 購于成都生物制品研究所有限責任公司；THP-1 細胞系由廣東省第二人民醫(yī)院傳染病重點實驗室友情贈送。

1.1.2 主要試劑 姜黃素（GC14787）及ML385（Nrf2抑制劑GC19254）均購自GLPBIO公司；ROS測定試劑盒（E004-1-1）及微量還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）測定試劑盒（A006-2-1）購自南京建成生物工程研究所；細胞核蛋白提取試劑盒（P0027）購自碧云天公司；BCA 蛋白定量試劑盒（PW0104）購自Biomiga 公司；超敏化學發(fā)光檢測試劑盒（S6009-100 ml）購自上海百賽生物公司；Nrf2（16396-1-AP-50 μl）、β-actin（66009-1-1 g）抗體均購自Proteintech 公司；HO-1（AF1333）、NQO1（AF7614）抗體購自碧云天公司；TBP（bsm-33227M）抗體購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和分化 人源單核細胞THP-1 在37 ℃、5%CO2恒溫恒濕的條件下，每隔2～3 d 以半換液方式于含1%青鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中進行傳代培養(yǎng)。待細胞生長至對數(shù)期，加入終濃度為100 nmol·L 的佛波酯（Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）誘導48 h 貼壁后，PBS 清洗細胞2～3 次以清除PMA，更換新鮮培養(yǎng)基進行后續(xù)實驗。

1.2.2 細菌培養(yǎng)與計數(shù) BCG 接種于改良羅氏培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)，3～4周后培養(yǎng)基上可見淡黃色、菜花樣菌落。無菌操作，取適量菌落置滅菌磨菌器中研磨，取適量菌懸液進行抗酸染色，顯微鏡下觀察可見紅色分枝狀細菌。紫外分光光度計測定菌懸液吸光度［11］，平板計數(shù)法調(diào)整其濃度為1×108CFU/ml，分裝冷藏于4 ℃冰箱1周內(nèi)，備用。

1.2.3 實驗分組 對照組：用含10%FBS 的RPMI-1640 完全培養(yǎng)液培養(yǎng)；BCG 組：予BCG（MOI=1∶10）干預24 h 后用不含F(xiàn)BS 的RPMI1640 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h；BCG+姜黃素組：用含10 μmol/L 姜黃素的完全 培 養(yǎng) 基 預 先 干 預4 h 后 重 復BCG 組 培 養(yǎng)［12-13］；BCG+姜黃素+ML385 組：用含5 μmol/L 的ML385 完全培養(yǎng)基預先干預24 h 后重復BCG+姜黃素組培養(yǎng)［14-15］。

1.2.4 熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)ROS 水平 按照

1.2.3 分組方法處理細胞后，采用DCFH-DA 探針對各組巨噬細胞ROS 進行檢測。按照試劑盒說明，倒置熒光顯微鏡觀察細胞綠色熒光著染情況，熒光強弱可反映細胞內(nèi)活性氧水平。

1.2.5 比色法檢測GSH 含量 將收集好的細胞手動研磨，取破碎后的細胞懸液加同等比例的沉淀劑混勻，3 500 r/min 離心10 min，取上清液，按照試劑盒說明書，測定GSH的含量。

1.2.6 Western blot 檢測細胞Nrf2 及NQO1、HO-1表達 收集各組細胞置于冰上，分別抽提細胞核及胞質(zhì)蛋白，BCA 法測蛋白濃度；分別取20 μg 蛋白樣品上樣，聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離2 h，冰上將目的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜；5%脫脂奶粉溶液室溫下?lián)u床封閉1.5 h；分別加入一抗，4 ℃孵育過夜；再分別加入二抗，室溫搖床孵育1 h；ECL 顯影法在凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)曝光成像。蛋白表達量以TBP 和β-actin作內(nèi)參，Image J軟件進行定量分析。

1.2.7 MTT 法檢測巨噬細胞增殖率 細胞接種于96孔板中，按照1.2.3分組方法處理24 h后，加入含10%MTT（5 mg/ml）的完全培養(yǎng)基100 μl，孵育3～4 h，加150 μl二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），室溫下?lián)u床振蕩10 min，酶標儀檢測各孔吸光度（OD）值。按照說明書公式計算細胞增殖率，每組設3 個復孔。

1.3 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)使用SPSS26.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料采用±s表示。多組獨立、正態(tài)、方差齊資料組間比較采用單因素方差分析，事后兩兩比較采用LSD 檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對BCG 感染巨噬細胞ROS 熒光強度的影響 對各組巨噬細胞DCFH-DA 染色，結(jié)果顯示，與Control 組比較，BCG 感染顯著增強了細胞ROS 熒光強度，證明BCG 誘導巨噬細胞產(chǎn)生了大量ROS；而給予姜黃素預處理后再感染BCG，細胞ROS 熒光強度較單純BCG 感染組明顯減弱；Nrf2 抑制劑ML385使得細胞內(nèi)ROS熒光強度再次增強，見圖1。

圖1 姜黃素對BCG 感染巨噬細胞ROS 熒光強度的影響（×100）Fig.1 Effect of curcumin on ROS fluorescence intensity in BCG-infected macrophages （×100）

2.2 姜黃素對BCG 感染巨噬細胞GSH 含量的影響 采用比色法檢測各組巨噬細胞GSH 含量，結(jié)果顯示，與Control組比較，BCG 組GSH 含量顯著降低；與BCG 組比較，加入姜黃素處理后，GSH 含量明顯升高；而Nrf2 抑制劑ML385 則逆轉(zhuǎn)了姜黃素的上述作用，見圖2。

圖2 姜黃素對BCG感染巨噬細胞GSH含量的影響Fig.2 Effect of curcumin on GSH content in BCG-infected macrophages

2.3 姜黃素影響B(tài)CG 感染巨噬細胞氧化應激的機制 為進一步研究姜黃素影響B(tài)CG 感染巨噬細胞氧化應激的機制，Western blot 檢測各組巨噬細胞Nrf2及下游基因NQO1、HO-1蛋白表達。結(jié)果顯示，各組細胞間Nrf2、NQO1、HO-1 蛋白表達比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與Control 組相比，BCG感染明顯降低了細胞Nrf2、NQO1、HO-1 蛋白表達（P<0.05）；采用姜黃素預處理后，BCG 感染巨噬細胞Nrf2、NQO1、HO-1 蛋白表達明顯升高（P<0.01）；在BCG+姜黃素處理細胞的基礎上加入Nrf2 抑制劑ML385，Nrf2、NQO1、HO-1 蛋白表達再次顯著下降（P<0.01），見圖3。

圖3 姜黃素對BCG 感染巨噬細胞Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表達的影響Fig.3 Effect of curcumin on expressions of Nrf2，NQO1 and HO-1 proteins in BCG-infected macrophages

2.4 姜黃素對BCG 感染巨噬細胞增殖率的影響

MTT 法檢測各組細胞增殖率，與Control 組相比，BCG 組巨噬細胞增殖率明顯下降（P<0.01）；與BCG組相比，BCG+姜黃素組巨噬細胞增殖率明顯升高（P<0.01）；但BCG+姜黃素+ML385 組細胞增殖率下降（P<0.01），見圖4。

圖4 姜黃素對BCG感染巨噬細胞增殖率的影響Fig.4 Effect of curcumin on BCG-infected macrophage proliferation rate

3 討論

巨噬細胞是MTB 感染后決定人類免疫功能的關鍵免疫細胞［16］。MTB 入侵人體后能夠激活宿主免疫系統(tǒng)，繼而激活巨噬細胞和中性粒細胞，誘導活性氧的產(chǎn)生［17］。研究證實，谷胱甘肽水平的降低導致人類免疫缺陷病毒感染者對MTB 的易感性增加，而補充谷胱甘肽脂質(zhì)體有助于提高免疫細胞功能，控制MTB 感染［18］。證明氧化應激與結(jié)核病發(fā)病存在緊密聯(lián)系。本研究采用BCG 建立感染細胞模型，結(jié)果顯示，與對照組相比，BCG 感染巨噬細胞后，ROS 水平明顯升高，而GSH 水平明顯下降，進一步表明氧化應激在結(jié)核感染中扮演著重要角色。

有研究發(fā)現(xiàn)，中低劑量姜黃素不僅可以抑制ROS 的生成，而且可以提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性，促進細胞對ROS 的清除，但高劑量姜黃素則會加劇氧化應激［19］。因而本研究在BCG 感染前采用低劑量姜黃素預處理巨噬細胞，結(jié)果顯示細胞內(nèi)ROS 熒光強度較單純BCG 感染組顯著減弱，而GSH 水平明顯升高。可見姜黃素可以通過降低活性氧水平和誘導抗氧化反應直接或間接發(fā)揮抗氧化活性［20］。

Nrf2是參與細胞抗氧化防御機制的重要轉(zhuǎn)錄因子［21］。當暴露于氧化應激條件下，Nrf2 從其抑制劑Keap-1（Kelch-like ECH2 associated protein 1）上解離并轉(zhuǎn)運到細胞核，與抗氧化反應元件（antioxidant responsive element，ARE）結(jié)合，調(diào)控下游抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄及表達，產(chǎn)生大量保護性酶，如HO-1、NQO1 等，從而減輕氧化應激引起的細胞損害［6，22］。研究發(fā)現(xiàn)，與Nrf2（+/-）小鼠相比，在Nrf2（-/-）小鼠巨噬細胞中，姜黃素抗氧化作用明顯降低［23］。且低、中劑量姜黃素可上調(diào)Nrf2 蛋白質(zhì)表達并促進Nrf2 向細胞核遷移［12］。本研究結(jié)果顯示，BCG 感染降低了巨噬細胞核Nrf2 表達及下游NQO1、HO-1 水平，姜黃素能夠增加BCG 感染巨噬細胞Nrf2、NQO1、HO-1 表達，進而減弱細胞氧化應激，Nrf2 抑制劑ML385 則逆轉(zhuǎn)了姜黃素的上述作用。進一步支持了Nrf2 級聯(lián)的激活參與了姜黃素抑制BCG 感染巨噬細胞氧化應激的機制。

研究表明，持續(xù)的活性氧可促進細胞程序性壞死和細胞死亡［24］。ROS 的產(chǎn)生和氧化應激可能是MTB 誘導的細胞凋亡和程序性壞死的關鍵上游信號［25］。本研究結(jié)果顯示，BCG 感染顯著降低了巨噬細胞的增殖率，姜黃素預處理細胞后，細胞增殖率明顯升高，而Nrf2 抑制劑ML385 卻使得細胞增殖率再度下降，表明姜黃素通過降低ROS 水平，升高GSH 表達，即通過抑制氧化應激進而抑制BCG 感染所誘導的巨噬細胞增殖率下降，但其潛在機制尚需進一步探討。

綜上所述，本研究證實了姜黃素能夠抑制BCG感染巨噬細胞氧化應激反應，進而保護巨噬細胞免受氧化性損傷。這種抑制作用與Nrf2 信號通路有關，從而提示姜黃素或許可以作為抗結(jié)核治療的潛在候選藥物。