褪黑素調(diào)控MEG3/miR-223/NLRP3 軸對流感病毒感染小鼠模型肺損傷的影響①

靳 莉 徐 超 張 華 李振華 （鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，鄭州 450000）

甲型流感病毒一般感染禽類，部分亞型會感染豬、海豹、馬和人等哺乳動物，且變異性強(qiáng)，可實(shí)現(xiàn)跨種感染，感染最常見和多發(fā)的是急性呼吸系統(tǒng)傳染病，若不及時干預(yù)極易引起重癥肺炎［1］。甲型流感病毒引起的肺炎患者肺部表現(xiàn)為彌漫性損傷，如甲型H1N1和H3N2流感病毒傳染性強(qiáng)，且其發(fā)病迅速、治療難度大、病死率高［2］。目前甲型流感病毒引起的肺損傷治療方法包括抗炎、抗感染、祛痰、機(jī)械通氣等，但效果均不理想［3］，發(fā)現(xiàn)新的治療方法迫在眉睫。褪黑素（melatonin，MT）是松果體中發(fā)現(xiàn)的激素，可作為免疫緩沖物質(zhì)發(fā)揮作用，可以減輕炎癥、減少氧化應(yīng)激，從而防止脂多糖誘導(dǎo)的抑郁樣行為［4］；在新型冠狀病毒感染疾病（corona virus disease 2019，COVID-19）中能夠抑制病毒入侵引起的肺部炎癥損傷，可減輕患者癥狀，實(shí)現(xiàn)對疾病的緩解，但在甲型流感病毒中尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)研究［5］。MT 能夠調(diào)控長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）母體表達(dá)基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）/微小RNA-223（microRNA-223，miR-223）/核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）軸實(shí)現(xiàn)對內(nèi)皮功能障礙相關(guān)炎癥疾病的治療作用，在肺損傷中可能發(fā)揮類似功效［6］。世界衛(wèi)生組織專家表示，在中國，H7N9 流感病毒為最致命的流感病毒之一?；诖耍狙芯恳訦7N9 流感病毒為研究對象，探討MT 對H7N9流感病毒感染小鼠肺損傷的影響，并初步探討其機(jī)制，為MT 對H7N9 流感病毒感染患者肺損傷的治療提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 50 只雄性C57BL/6 小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0011，體質(zhì)量（20.5±0.5）g，6～8周齡，普通動物飼料飼養(yǎng)、自由飲水，12 h 光照晝夜循環(huán)。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院倫理委員會審核并通過(倫理審批號：20201135)，實(shí)驗(yàn)動物符合3R原則。

1.1.2 病毒 H7N9 低致病性病毒株購自武漢金開瑞生物工程有限公司，病毒接種10 日齡雞胚，37 ℃溫箱中孵育48 h，收取雞胚尿囊液，離心后病毒上清制備成5×107半數(shù)雞胚感染量（egg 50% infective dose，EID50）/ml病毒懸液備用。

1.1.3 試劑與儀器 MT購自美國Sigma-Aldrich公司；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）試劑盒購自北京Solarbio 公司；引物由上海生工生物科技有限公司合成；小鼠IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α、IFN-β ELISA 試劑盒、一抗NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis associated speck-like protein containing CARD，ASC）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1（cysteinyl aspartate specific proteinase1，caspase-1）、procaspase-1、內(nèi)參β-actin、二抗羊抗兔均購自英國Abcam 公司；pcDNA3.1-NLRP3-WT 質(zhì)粒、pcDNA3.1-NLRP3-MUT 質(zhì)粒、pcDNA3.1-MEG3-WT 質(zhì)粒、pcDNA3.1-MEG3-MUT 質(zhì)粒、miR-223 模擬物（miR-223 mimics）、miR-223 模擬物陰性對照（mimics NC）均由上海生工生物有限公司構(gòu)建；HEK293 細(xì)胞購自美國ATCC；Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑和雙熒光素酶試劑盒均購自Invitrogen。Leica DCM8 顯微鏡購自德國Leica 公司；QuantStudio 3 實(shí)時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）儀購自美國ABI 公司；ChemiDoc XRS+蛋白凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Bad公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及造模給藥 小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、MT（低、中、高）劑量組，每組10只。除對照組外，其余各組小鼠參考文獻(xiàn)［7］，使用5×105EID50劑量H7N9 病毒懸浮液滴鼻，對照組等體積磷酸緩沖液滴鼻。造模當(dāng)天MT（低、中、高）劑量組腹腔注射（15、30、60）mg/kg MT，對照組、模型組腹腔注射等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)7 d。末次給藥24 h處死小鼠，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 肺指數(shù)檢測 立即處死小鼠，解剖肺組織，生理鹽水沖洗，吸干表面水分，計算肺指數(shù)。肺指數(shù)=小鼠肺質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.2.3 HE 染色觀察肺組織形態(tài) 每組小鼠左肺固定在10%甲醛中，預(yù)冷的磷酸緩沖液漂洗，梯度乙醇溶液脫水，二甲苯透明、石蠟浸蠟，凝固切片，厚度5 μm。切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇處理，蘇木精染色、伊紅復(fù)染，梯度乙醇脫水、二甲苯透明，封片后顯微鏡下觀察肺組織形態(tài)。

1.2.4 ELISA 檢 測 肺 組 織 中IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α、IFN-β 水平 取每組小鼠右肺部分肺組織，加入含蛋白酶抑制劑的磷酸緩沖液對肺組織進(jìn)行勻漿，3 000 r/min 4 ℃離心15 min，上清為肺組織勻漿，嚴(yán)格按照小鼠試劑盒操作說明檢測肺組織中IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α、IFN-β水平。

1.2.5 RT-qPCR 檢測肺組織中MEG3、miR-223 水平 取每組小鼠右肺部分肺組織，剪碎，Trizol 法提取總RNA，cDNA 第一條鏈合成試劑盒合成cDNA，RT-qPCR 儀 檢 測 肺 組 織 中MEG3、miR-223 水 平。MEG3 正 向 引 物：5'-GTGAAGGTCGGAGTGAACG-3'，反向引物：5'-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3'；β-actin 正向引物：5'-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3'，反向引物：5'-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3'，miR-223 正 向 引 物：5'-TGGCTGTCAGTTTGTCAAAT-3'，反向引物：5'-CTGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6 正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。上樣體系：2×Mix 10 μl、cDNA（200 ng/μl）1 μl、正向引物/反向引物（10 μmol/L）各0.5 μl、ddH2O 8 μl。反應(yīng)條件：95 ℃ 120 s；94℃ 5 s、60℃ 30 s、40個循環(huán)。2-??CT法計算MEG3、miR-223相對表達(dá)量。

1.2.6 蛋白免疫印跡檢測肺組織中NLRP3、ASC、caspase-1、pro-caspase-1 蛋白水平 取每組小鼠右肺部分肺組織，剪碎，加入含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液冰上研磨，12 000 r/min 4 ℃離心20 min，上清為總蛋白。20 ng 蛋白凝膠電泳、PVDF 轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST 沖洗，分別添加對應(yīng)一抗NLRP3、ASC、caspase-1、pro-caspase-1、β-actin，4 ℃孵育過夜；TBST 沖洗，添加二抗，室溫孵育2 h。DAB 顯色液避光顯色，蛋白凝膠成像系統(tǒng)拍照和定量分析。

1.2.7 生物信息學(xué)預(yù)測和雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證MEG3 與miR-223，miR-223 與NLRP3 的調(diào)控關(guān)系采用生物信息學(xué)在線軟件查詢MEG3 與miR-223 的結(jié)合位點(diǎn)、miR-223 與NLRP3 的結(jié)合位點(diǎn)。使用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑，將含有pcDNA3.1-NLRP3-WT 質(zhì) 粒、pcDNA3.1-NLRP3-MUT 質(zhì) 粒、pc-DNA3.1-MEG3-WT 質(zhì)粒、pcDNA3.1-MEG3-MUT 質(zhì)粒的熒光素酶載體分別與miR-223 mimics、mimics NC 共轉(zhuǎn)染至HEK293 細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h 后，收集細(xì)胞裂解液，根據(jù)雙熒光素酶試劑盒說明書，檢測熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad Prism8.0 軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量數(shù)據(jù)均采用±s表示，單因素方差分析多組間比較，SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)一步兩兩比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MT 對小鼠肺指數(shù)的影響 與對照組相比，模型組、MT（低、中）劑量組肺指數(shù)升高（P<0.05）；與模型組相比，MT（低、中、高）劑量組肺指數(shù)降低（P<0.05）；與MT低劑量組相比，MT（中、高）劑量組肺指數(shù)降低（P<0.05）。見表1。

表1 各組小鼠肺指數(shù)比較（±s，n=10，mg/g）Tab.1 Comparison of lung index of mice in each group（±s，n=10，mg/g）

表1 各組小鼠肺指數(shù)比較（±s，n=10，mg/g）Tab.1 Comparison of lung index of mice in each group（±s，n=10，mg/g）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with model group， 2）P<0.05； compared with MT-L dose group， 3）P<0.05.

Lung index 73.68±8.25 138.93±9.831）115.86±8.731）2）96.41±7.961）2）3）87.35±9.382）3）82.945 0.000 Groups Control Model MT-L dose MT-M dose MT-H dose FP

2.2 MT 對小鼠肺組織的影響 對照組小鼠肺組織肺泡、支氣管形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，腔內(nèi)無滲出現(xiàn)象；模型組小鼠肺組織肺泡壁充血明顯、腔內(nèi)出現(xiàn)明顯的炎癥滲出及炎癥細(xì)胞浸潤；MT（低、中、高）劑量組隨著MT 劑量的升高，小鼠肺組織肺泡壁充血現(xiàn)象、腔內(nèi)炎癥滲出及炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象均得到改善。見圖1。

圖1 各組肺組織形態(tài)（×200）Fig.1 Lung tissue morphology of each group（×200）

2.3 MT 對 肺 組 織 中IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α、IFN-β 水平的影響 與對照組相比，模型組、MT（低、中）劑量組肺組織中IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α、IFN-β水平，MT高劑量組肺組織中IL-1β、IL-18、IL-6、IFN-β 水平升高（P<0.05）；與模型組相比，MT（低、中、高）劑量組肺組織中IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α 水平降低（P<0.05），IFN-β 水平升高（P<0.05）；與MT低劑量組相比，MT 高劑量組肺組織中IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α 水平，MT 中 劑 量 組 肺 組 織 中IL-1β、IL-18、IL-6 水平降低（P<0.05），MT（中、高）劑量組肺組織中IFN-β 水平升高（P<0.05）；與MT 中劑量組相比，MT 高劑量組肺組織中IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α 水平降低（P<0.05），IFN-β 水平升高（P<0.05）。見表2。

表2 各組肺組織中IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α、IFN-β水平比較（±s，n=10，pg/mg·prot）Tab.2 Comparison of IL-1β， IL-18， IL-6， TNF-α and IFN-β levels in lung tissues of each group （±s，n=10，pg/mg·prot）

表2 各組肺組織中IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α、IFN-β水平比較（±s，n=10，pg/mg·prot）Tab.2 Comparison of IL-1β， IL-18， IL-6， TNF-α and IFN-β levels in lung tissues of each group （±s，n=10，pg/mg·prot）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with model group， 2）P<0.05； compared with MT-L dose group， 3）P<0.05； compared with MT-M dose group， 4）P<0.05.

Groups Control Model MT-L dose MT-M dose MT-H dose IL-1β IL-18 IL-6 TNF-α IFN-β 21.37±3.46 37.38±4.771）54.73±6.451）2）62.45±6.821）2）3）71.65±8.481）2）3）4）104.228 0.000 FP 36.48±4.58 176.57±13.471）132.44±11.921）2）86.73±8.261）2）3）62.82±5.761）2）3）4）350.510 0.000 18.76±3.58 101.83±7.921）86.39±7.981）2）73.47±6.861）2）3）37.83±4.141）2）3）4）292.067 0.000 3.74±0.35 17.92±2.491）13.39±1.421）2）10.63±1.721）2）3）6.76±0.861）2）3）4）127.845 0.000 130.48±15.86 257.82±27.391）174.88±18.921）2）167.85±15.861）2）143.79±15.482）3）4）66.633 0.000

2.4 MT 對肺組織中MEG3、miR-223 水平的影響與對照組相比，模型組、MT（低、中、高）劑量組肺組織中MEG3 水平升高（P<0.05），miR-223 水平降低（P<0.05）；與模型組相比，MT（低、中、高）劑量組肺組織中MEG3 水平降低（P<0.05），miR-223 水平升高（P<0.05）；與MT 低劑量組相比，MT（中、高）劑量組肺組織中MEG3 水平降低（P<0.05），miR-223 水平升高（P<0.05）；與MT 中劑量組相比，MT 高劑量組肺組織中MEG3 水平降低（P<0.05），miR-223 水平升高（P<0.05）。見表3。

表3 各組小鼠肺組織中MEG3、miR-223 水平比較（±s，n=10）Tab.3 Comparison of MEG3 and miR-223 levels in lung tissues of mice in each group （±s， n=10）

表3 各組小鼠肺組織中MEG3、miR-223 水平比較（±s，n=10）Tab.3 Comparison of MEG3 and miR-223 levels in lung tissues of mice in each group （±s， n=10）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with model group， 2）P<0.05； compared with MT-L dose group， 3）P<0.05；compared with MT-M dose group， 4）P<0.05.

Groups Control Model MT-L dose MT-M dose MT-H dose MEG3 miR-223 0.99±0.09 0.41±0.051）0.57±0.061）2）0.71±0.081）2）3）0.86±0.091）2）3）4）91.673 0.000 FP 1.01±0.09 2.29±0.171）1.88±0.121）2）1.43±0.151）2）3）1.24±0.111）2）3）4）153.576 0.000

2.5 MT 對肺組織中NLRP3、ASC、caspase-1、procaspase-1 蛋白水平的影響 與對照組相比，模型組、MT（低、中）劑量組肺組織中NLRP3、ASC、caspase-1/pro-caspase-1 蛋白水平，MT 高劑量組肺組織中ASC、caspase-1/pro-caspase-1 蛋白水平升高（P<0.05）；與模型組相比，MT（低、中、高）劑量組肺組織中NLRP3、ASC、caspase-1/pro-caspase-1 蛋白水平降低（P<0.05）；與MT 低劑量組相比，MT（中、高）劑量組肺組織中NLRP3、ASC、caspase-1/pro-caspase-1 蛋白水平降低（P<0.05）；與MT 中劑量組相比，MT 高劑量組肺組織中NLRP3、ASC、caspase-1/pro-caspase-1蛋白水平降低（P<0.05）。見圖2。

圖2 各組小鼠肺組織中NLRP3、ASC、caspase-1、pro-caspase-1蛋白水平比較Fig.2 Comparison of protein levels of NLRP3， ASC， caspase-1， and pro-caspase-1 in lung tissue of each group of mice

2.6 MEG3 與miR-223，miR-223 與NLRP3 的靶向關(guān)系 MEG3與miR-223之間存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，共轉(zhuǎn)染miR-223 mimics 和pcDNA3.1-MEG3-WT 質(zhì)粒時，細(xì)胞熒光素酶活性明顯受到抑制（P<0.05），而共轉(zhuǎn)染miR-223 mimics 和pcDNA3.1-MEG3-MUT時，細(xì)胞熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖3 和表4。miR-223 與NLRP3 之間存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，共轉(zhuǎn)染miR-223 mimics 和pc-DNA3.1-NLRP3-WT 質(zhì)粒時，細(xì)胞熒光素酶活性明顯受到抑制（P<0.05），而共轉(zhuǎn)染miR-223 mimics 和pcDNA3.1-NLRP3-MUT 時，細(xì)胞熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖4和表5。

圖3 MEG3與miR-223之間的結(jié)合位點(diǎn)Fig.3 Binding site between MEG3 and miR-223

圖4 NLRP3與miR-223之間的結(jié)合位點(diǎn)Fig.4 Binding site between NLRP3 and miR-223

表4 各組細(xì)胞熒光素酶活性（±s， n=6）Tab.4 Cell luciferase activity in each group （±s， n=6）

表4 各組細(xì)胞熒光素酶活性（±s， n=6）Tab.4 Cell luciferase activity in each group （±s， n=6）

Note：Compared with mimics NC+pcDNA3.1-MEG3-WT group，1）P<0.05.

Relative luciferase activity 1.00±0.00 1.02±0.11 0.99±0.10 0.45±0.061）Groups mimics NC+pcDNA3.1-MEG3-WT miR-223 mimics+pcDNA3.1-MEG3-MUT mimics NC+pcDNA3.1-MEG3-MUT miR-223 mimics+pcDNA3.1-MEG3-WT

表5 各組細(xì)胞熒光素酶活性（±s， n=6）Tab.5 Cell luciferase activity in each group （±s， n=6）

表5 各組細(xì)胞熒光素酶活性（±s， n=6）Tab.5 Cell luciferase activity in each group （±s， n=6）

Note：Compared with mimics NC+pcDNA3.1-NLRP3-WT group，1）P<0.05.

Relative luciferase activity 1.00±0.00 1.04±0.11 1.06±0.12 0.58±0.071）Groups mimics NC+pcDNA3.1-NLRP3-WT miR-223 mimics+pcDNA3.1-NLRP3-MUT mimics NC+pcDNA3.1-NLRP3-MUT miR-223 mimics+pcDNA3.1-NLRP3-WT

3 討論

本研究以H7N9 禽流感病毒為研究對象，H7N9禽流感病毒可引起急性呼吸道傳染病，經(jīng)呼吸道傳播、引起肺損傷，臨床病死率較高，尤其是老年患者，常伴有嚴(yán)重的低氧血癥、休克和多器官衰竭［8］。本研究中模型組出現(xiàn)肺組織肺泡壁充血、腔內(nèi)出現(xiàn)明顯的炎癥滲出及炎癥細(xì)胞浸潤，導(dǎo)致肺指數(shù)升高，肺損傷嚴(yán)重。有效的治療對于疾病意義重大，近年來，隨著藥物治療的發(fā)展，抗炎通路及分子機(jī)制研究的日益成熟，從抗炎方面延緩或治療該病引起科學(xué)家和臨床醫(yī)師的關(guān)注。MT 作為內(nèi)源性吲哚胺類物質(zhì)，由松果體分泌，具有多種臨床用途，在不同病理?xiàng)l件下調(diào)控天然免疫細(xì)胞及生成抗炎細(xì)胞因子發(fā)揮抗炎作用［9］。在本研究中不同劑量MT 處理均可減輕流感病毒感染小鼠模型肺組織病理損傷，緩解肺指數(shù)升高現(xiàn)象，提示MT 能夠使肺組織中炎癥滲出及炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象得到明顯緩解；另有研究發(fā)現(xiàn)，MT 作為抗病毒藥物，對流感引起的肺炎具有治療潛力，能顯著降低TNF-α、IL-6 和IFN-γ 的表達(dá)，增加IL-10 和TGF-β 的產(chǎn)生，且與單純使用利巴韋林相比，MT 和利巴韋林聯(lián)合治療可顯著提高病毒感染小鼠的存活率［10］，與本研究結(jié)果具有一致性，但具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

H7N9 型流感病毒感染可促進(jìn)趨化因子IL-18，促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α 等和抗病毒因子IFN-β的產(chǎn)生［11］。禽流感的非結(jié)構(gòu)蛋白1能誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞分泌IL-6 和IFN-β，進(jìn)而影響宿主固有免疫反應(yīng)，參與疾病進(jìn)程［12］；中性粒細(xì)胞在固有免疫中介導(dǎo)抗病毒和免疫損傷的重要免疫細(xì)胞，能夠抑制免疫因子IL-1β、IL-18、TNF-α 的釋放進(jìn)而發(fā)揮作用，其中IL-6 為病毒感染后，免疫階段大量釋放的促炎細(xì)胞因子［13-14］。在本研究中H7N9 禽流感感染后小鼠肺組織中IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α、IFN-β 均處于高表達(dá)狀態(tài)，提示H7N9 禽流感感染后機(jī)體中趨化因子、促炎因子、抗病毒因子均處于高表達(dá)狀態(tài)，機(jī)體紊亂，最終導(dǎo)致炎癥加重、機(jī)體組織損傷。添加MT 后趨化因子、促炎因子水平均降低，抗病毒因子IFN-β水平繼續(xù)升高，從而抑制病毒感染、減輕炎癥，減輕機(jī)體損傷。

lncRNA 與乙型病毒性肝炎關(guān)系密切，可直接抑制病毒基因復(fù)制的關(guān)鍵蛋白表達(dá)，準(zhǔn)確殺傷肝炎病毒［15］。在病毒感染的乙型肝炎中MEG3與肝纖維化程度關(guān)系密切，對診斷乙型肝炎具有較高價值，可成為病毒性乙型肝炎的診斷生物標(biāo)志物［16］；MEG3在呼吸道合胞病毒感染鼻咽樣本和BEAS-2B 細(xì)胞中均低表達(dá)，且能抑制炎癥因子TNF-α 和趨化因子IL-18 的表達(dá)，對呼吸道合胞病毒感染具有保護(hù)作用［17］。在本研究中MEG3 在模型組中高表達(dá)，高表達(dá)MEG3 在H7N9 禽流感病毒感染的肺損傷中可能發(fā)揮作用。lncRNA 可調(diào)控miRNA 的表達(dá)，從而影響其功能。miR-223 作為MEG3 下游miRNA 之一，通過與MEG3作用影響人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-223和MEG3存在靶向調(diào)控關(guān)系。隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)miR-223 的作用主要為抑制炎癥反應(yīng)，可防止感染及并發(fā)癥發(fā)生，在病毒感染的天然免疫中發(fā)揮作用［19］。促進(jìn)miR-223 表達(dá)使NLRP3 炎癥體失活，從而減輕甲型流感病毒誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞炎癥損傷［20］。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，miR-223與NLRP3存在靶向調(diào)控關(guān)系，且miR-223 可調(diào)控NLRP3 表達(dá)。NLRP3 炎癥小體對多種信號通路發(fā)揮作用，包括環(huán)境刺激、內(nèi)源性信號、病原體、機(jī)體內(nèi)線粒體損傷等，可促進(jìn)IL-1β、IL-18 的活化并誘導(dǎo)分泌，導(dǎo)致炎癥相關(guān)性損傷［21］，其中ASC、caspase-1 均為NLRP3 炎癥小體的組成。本研究模型組miR-223 處于低表達(dá)，可能低表達(dá)的miR-223 對炎癥的抑制作用不足，NLRP3 炎癥小體蛋白處于高表達(dá)，H7N9 禽流感病毒感染的肺損傷炎癥明顯。添加MT 后，隨著劑量的升高，miR-223水平升高，NLRP3、ASC、caspase-1/pro-caspase-1 蛋白水平降低；提示MT能夠促進(jìn)miR-223的表達(dá)并抑制NLRP3 炎癥小體，從而減輕H7N9 禽流感病毒感染的肺損傷。

綜上所述，MT 能夠緩解H7N9 禽流感病毒感染小鼠引起的肺損傷，可能與MEG3/miR-223/NLRP3軸關(guān)系密切。本研究探討MT 在流感病毒感染引起的肺損傷，為該類疾病實(shí)驗(yàn)動物研究提供一定參考。但MT 與MEG3 之間的具體關(guān)系尚需進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。