LncRNA SNHG12 調(diào)控miR-138-5p/HIF-1α 軸改善缺氧/復(fù)氧人血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的研究①

魏宗強(qiáng) 王琳茹 胡文賢 張娟子 黃賢明 李 林 李 強(qiáng)

（青島大學(xué)附屬青島市海慈醫(yī)院血管外科中心，青島 266033）

缺血再灌注損傷是發(fā)生于腦卒中、心肌梗死、休克、器官移植等疾病中的病理現(xiàn)象，可引發(fā)強(qiáng)烈的過氧化及炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞變性、凋亡，造成器官功能衰竭，極大威脅患者生命安全［1-2］。在缺血再灌注病理?yè)p傷過程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞作為前沿細(xì)胞，可因缺氧/復(fù)氧（H/R）過程而造成損傷，促使凋亡發(fā)生，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡對(duì)于緩解組織器官缺血再灌注損傷至關(guān)重要［3-4］。小核仁RNA 宿主基因12（small nucleolar RNA host gene 12，SNHG12）是一種長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，Lnc-RNA），參與介導(dǎo)細(xì)胞H/R 病理過程，沉默SNHG12可促進(jìn)H/R 引發(fā)的炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生及細(xì)胞凋亡，上調(diào)SNHG12表達(dá)，抑制炎癥發(fā)生及進(jìn)展，提高腦缺血再灌注后微血管內(nèi)皮細(xì)胞活力，減輕腦組織損傷，因此，LncRNA SNHG12 可作為改善H/R 人血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的潛在作用靶點(diǎn)［5-6］。miR-138-5p 是調(diào)控細(xì)胞活力、凋亡、遷移和炎癥損傷等生理病理過程的重要因子，下調(diào)其表達(dá)可增強(qiáng)細(xì)胞活力，阻礙炎癥反應(yīng)，進(jìn)而抑制其凋亡［7］。低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是miR-138-5p的下游調(diào)控靶點(diǎn)，兩者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)［8］。HIF-1α 是一種缺氧誘導(dǎo)因子，可以減少活性氧（reactive oxygen species，ROS）釋放，降低細(xì)胞凋亡，保護(hù)細(xì)胞免于氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖造成的損傷［9-10］。有研究發(fā)現(xiàn)，SNHG12 可負(fù)調(diào)控miR-138 的表達(dá)，敲除SNHG12 可通過上調(diào)miR-138 而抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，因而推測(cè)LncRNA SNHG12 可能通過調(diào)控miR-138-5p/HIF-1α 軸改善H/R引發(fā)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷［11］。本研究通過建立H/R 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）模型對(duì)此進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 HUVECs 及其專用培養(yǎng)基購(gòu)于武漢普諾賽生命科技有限公司；LncRNA SNHG12、miR-138-5p、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、U6 及HIF-1α 引物、LncRNA SNHG12 過表達(dá)質(zhì)粒、Lnc-RNA SNHG12 空載質(zhì)粒、miR-138-5p mimics、miR-138-5p mimics 陰性對(duì)照由上海吉瑪基因有限公司提供；達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）（含雙抗）培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶-EDTA（含酚紅）消化液、減少了血清的MEM（Eagle's）培養(yǎng)基（Opti-MEM）、脂質(zhì)體2000、CCK-8 試劑盒、Annexin V-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）凋亡檢測(cè)試劑盒、一步法實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒、總RNA 提取試劑盒、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、高效放射免疫沉淀法（radio-immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液、人IL-6、IL-17、IL-18 ELISA 試劑盒、ROS 檢測(cè)試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；兔源GAPDH 一抗、兔源半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（caspase-9）一抗、兔源Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）一抗、兔源HIF-1α一抗、羊抗兔二抗均購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。

1.1.2 主要儀器 En-Vision 型多功能酶標(biāo)儀購(gòu)于珀金埃爾默企業(yè)管理（上海）有限公司；Countstar Rigel 熒光細(xì)胞分析儀購(gòu)于上海睿鈺生物科技有限公司；UV5Nano紫外可見分光光度計(jì)購(gòu)于梅特勒-托利多國(guó)際有限公司；ABI7500 型PCR 儀購(gòu)于美國(guó)ABI 公司；FACS caliber 流式細(xì)胞儀、PowerPac 蛋白電泳儀購(gòu)于美國(guó)BD 公司；Trans-Blot SD 型轉(zhuǎn)膜儀、ChemiDoc XRS型凝膠成像儀購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞模型建立及分組轉(zhuǎn)染 快速解凍復(fù)蘇HUVECs，以培養(yǎng)HUVECs 的專用培養(yǎng)基重懸后，接種于T-25 培養(yǎng)瓶，進(jìn)行無菌培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右時(shí)以1∶3比例傳代。

細(xì)胞分組：取上述傳代的HUVECs，接種于24孔板，無菌培養(yǎng)24 h，隨機(jī)分為對(duì)照組、H/R 模型組（細(xì)胞H/R 模型）、H/R+LncRNA SNHG12 過表達(dá)組、H/R+miR-138-5p mimics組、H/R+共轉(zhuǎn)染組（用來驗(yàn)證LncRNA SNHG12 改善H/R 人血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是否通過調(diào)控miR-138-5p/HIF-1α 實(shí)現(xiàn)）、H/R+共轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照（LncRNA SNHG12 空載質(zhì)粒+miR-138-5p mimics陰性對(duì)照）組（每組6個(gè)重復(fù)孔）。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染：分別以50 μl Opti-MEM 培養(yǎng)基溶解質(zhì)粒、mimics、mimics 陰性對(duì)照，配制為L(zhǎng)ncRNA SNHG12過表達(dá)質(zhì)粒、LncRNA SNHG12空載質(zhì)粒、miR-138-5p mimics 及miR-138-5p mimics 陰性對(duì)照溶液，再以200 μl Opti-MEM 培養(yǎng)基脂質(zhì)體2000，配制為脂質(zhì)體2000 溶液，將50 μl 脂質(zhì)體2000 溶液分別與上述質(zhì)粒、miR-138-5p mimics 及miR-138-5p mimics陰性對(duì)照溶液混勻，制成轉(zhuǎn)染液，各組濃度參照各自說明書進(jìn)行設(shè)定，將培養(yǎng)液替換為Opti-MEM 培養(yǎng)基，加入轉(zhuǎn)染液后轉(zhuǎn)染6 h，棄去Opti-MEM 培養(yǎng)基后替換為細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h完成轉(zhuǎn)染。

細(xì)胞模型建立及標(biāo)本采集：取上述分組后的各組細(xì)胞，除對(duì)照組、H/R 模型組外的其余各組細(xì)胞按上述細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行分組轉(zhuǎn)染：H/R+LncRNA SNHG12 過表達(dá)組轉(zhuǎn)染LncRNA SNHG12 過表達(dá)質(zhì)粒，H/R+miR-138-5p mimics 組轉(zhuǎn)染miR-138-5p mimics，H/R+共轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染LncRNA SNHG12 過表達(dá)質(zhì)粒和miR-138-5p mimics，H/R+共轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染Lnc-RNA SNHG12 空載質(zhì)粒和miR-138-5p mimics 陰性對(duì)照，轉(zhuǎn)染的同時(shí)對(duì)H/R 模型組和轉(zhuǎn)染組細(xì)胞給予5 h 缺氧后復(fù)氧1 h［12］，來誘導(dǎo)建立H/R細(xì)胞模型，對(duì)照組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，均于造模2 h 后收集各組細(xì)胞，重復(fù)上述操作4 次，得到4 份細(xì)胞標(biāo)本。

1.2.2 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力 通過細(xì)胞計(jì)數(shù)板檢測(cè)HUVECs 濃度后，稀釋為1.0×105個(gè)/ml，接種于96 孔板，無菌培養(yǎng)24 h，隨機(jī)分為上述6 組，另選6個(gè)孔不接種細(xì)胞作為空白對(duì)照組， 除對(duì)照組外，其余各組細(xì)胞給予5 h 缺氧后復(fù)氧1 h，誘導(dǎo)建立H/R模型，同時(shí)參照1.2.1中方法進(jìn)行分組轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，替換為含適量CCK-8試劑的新培養(yǎng)液，2 h 后酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度（A），計(jì)算細(xì)胞活力（%）=（A實(shí)驗(yàn)組-A空白對(duì)照組）/（A對(duì)照組-A空白對(duì)照組）×100%［12］。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將傳代的HUVECs 接種于24 孔板，按照1.2.1 中方法分組處理后，加入適量胰酶消化、100 g離心，得到各組細(xì)胞沉淀，經(jīng)PBS（8.0 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4、0.24 g KH2PO4溶于800 ml蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)pH至7.4，最后加蒸餾水定容至1 L）洗滌后重懸，依次加入適量Annexin V-FITC 與PI混勻，于37.5 ℃下避光孵育15 min，100 g 離心，以PBS 洗滌細(xì)胞沉淀，以500 μl PBS 重懸各組細(xì)胞，上樣至流式細(xì)胞儀中，檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況［12］。

1.2.4 ELISA 檢測(cè)細(xì)胞IL-6、IL-17、IL-18 水平 取1 份1.2.1 中收集的各組細(xì)胞，加入高效RIPA 裂解液，混勻后于冰水浴中裂解2 h，然后1 000 g 離心收集上清，各取0.1 ml 以ELISA 試劑盒分別測(cè)量其中IL-6、IL-17、IL-18 水平：包被96 孔板、加入樣品液孵育、加入酶標(biāo)抗體孵育、加入底物液顯色后終止反應(yīng)，以酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度后，根據(jù)說明書中方法計(jì)算出IL-6、IL-17、IL-18水平。

1.2.5 熒光探針法測(cè)定ROS 水平 取1 份1.2.1中收集的各組細(xì)胞，加入熒光探針DCFH-DA，DCFH-DA 可自由穿過細(xì)胞膜，其本身沒有熒光，進(jìn)入細(xì)胞后，能被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH，從而使探針被裝載到細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)的活性氧可氧化DCFH，使其成為有熒光的DCF，測(cè)定DCF 的熒光值，即可知道細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平，以相對(duì)熒光強(qiáng)度表示（A.U.）。

1.2.6 分光光度計(jì)法檢測(cè)細(xì)胞LDH 水平 取1.2.4 中細(xì)胞裂解樣品液0.1 ml，加入工作液顯色后終止反應(yīng)，以分光光度計(jì)測(cè)定各孔吸光度后，根據(jù)說明書方法計(jì)算LDH水平［9-10］。

1.2.7 qRT-PCR 檢 測(cè) 細(xì) 胞miR-138-5p 及HIF-1α mRNA 表達(dá) 取1份1.2.1中收集的各組細(xì)胞，以試劑盒提取其總RNA 后，采用一步法實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒做qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)，具體步驟及反應(yīng)條件設(shè)置參照各自說明指導(dǎo)進(jìn)行，HIF-1α 使用GAPDH 做內(nèi)參，miR-138-5p 使用U6 做內(nèi)參，所得各組基因Ct 值運(yùn)用2-ΔΔCt算法進(jìn)行分析，最終測(cè)出各組miR-138-5p 及HIF-1α mRNA的相對(duì)表達(dá)，各基因引物序列見表1。

1.2.8 Western blot 檢測(cè)細(xì)胞凋亡蛋白caspase-9、Bax 及HIF-1α 蛋白表達(dá) 取1 份1.2.1 中收集的各組細(xì)胞，加入高效RIPA 裂解液，于4 ℃下裂解、1 000 g 離心，提取總蛋白，使用試劑盒經(jīng)BCA 法測(cè)出濃度后調(diào)至各組相等［10］，將其變性后分別取20 μl上樣，110 V 下電泳75 min 分離蛋白，然后40 mA 下濕轉(zhuǎn)60 min 將其移至硝酸纖維膜上，37.5 ℃下孵育5%脫脂奶粉溶液2 h，封閉膜上蛋白，然后根據(jù)分子量分別剪下caspase-9、Bax、GAPDH 及HIF-1α 蛋白條帶，4 ℃下孵育相應(yīng)一抗10 h，TBST（10 mmol/L Tris-HCl+150 mmol/L NaCl+2%Tween20，pH7.4）洗膜3 次，37.5 ℃下孵育羊抗兔二抗1.5 h，TBST 洗膜3 次，顯色、拍照，以Image J 軟件定量各蛋白條帶灰度值，對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后得出各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞活力情況 與對(duì)照組相比，H/R 模型組細(xì)胞活力降低（P<0.05）；與H/R 模型組、H/R+共轉(zhuǎn)染組相比，H/R+LncRNA SNHG12 過表達(dá)組細(xì)胞活力升高（P<0.05），H/R+miR-138-5p mimics組細(xì)胞活力降低（P<0.05）；與H/R 模型組相比，H/R+共轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組、H/R+共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，表2）。

表2 各組細(xì)胞活力（±s，n=6）Tab.2 Cell viability of each group （±s，n=6）

表2 各組細(xì)胞活力（±s，n=6）Tab.2 Cell viability of each group （±s，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with H/R model group， 2）P<0.05； compared with H/R+co-transfection group， 3）P<0.05.

Cell viability/%100.0±0.00 41.03±9.121）96.01±15.732）3）25.13±4.052）3）41.17±7.481）41.09±8.021）Groups Control H/R model H/R+LncRNA SNHG12 overexpression H/R+miR-138-5p mimics H/R+co-transfection H/R+co-transfection negative control

2.2 各組細(xì)胞凋亡情況 與對(duì)照組相比，H/R 模型組細(xì)胞凋亡率升高（P<0.05）；與H/R 模型組、H/R+共轉(zhuǎn)染組相比，H/R+LncRNA SNHG12 過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率降低（P<0.05），H/R+miR-138-5p mimics組細(xì)胞凋亡率升高（P<0.05）；與H/R 模型組相比，H/R+共轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組、H/R+共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，圖1、表3）。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況Fig.1 Apoptosis was detected by flow cytometry

表3 各組細(xì)胞凋亡率（±s，n=6）Tab.3 Apoptosis rate of each group （±s，n=6）

表3 各組細(xì)胞凋亡率（±s，n=6）Tab.3 Apoptosis rate of each group （±s，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with H/R model group， 2）P<0.05； compared with H/R+co-transfection group， 3）P<0.05.

Apoptosis rate/%10.06±1.01 64.02±9.201）9.96±0.832）3）81.73±4.222）3）63.97±8.411）64.06±8.521）Groups Control H/R model H/R+LncRNA SNHG12 overexpression H/R+miR-138-5p mimics H/R+co-transfection H/R+co-transfection negative control

2.3 各組細(xì)胞ROS、LDH 檢測(cè)水平 與對(duì)照組相比，H/R 模型組細(xì)胞ROS、LDH 水平升高（P<0.05）；與H/R 模型組、H/R+共轉(zhuǎn)染組相比，H/R+LncRNA SNHG12 過表達(dá)組細(xì)胞ROS、LDH 水平降低（P<0.05），H/R+miR-138-5p mimics 組細(xì)胞ROS、LDH 水平升高（P<0.05）；與H/R 模型組相比，H/R+共轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組、H/R+共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞ROS、LDH 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，表4）。

表4 各組細(xì)胞ROS、LDH檢測(cè)水平（±s，n=6）Tab.4 Detection levels of ROS and LDH in cells of each group （±s，n=6）

表4 各組細(xì)胞ROS、LDH檢測(cè)水平（±s，n=6）Tab.4 Detection levels of ROS and LDH in cells of each group （±s，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with H/R model group， 2）P<0.05； compared with H/R+co-transfection group， 3）P<0.05.

Groups Control H/R model H/R+LncRNA SNHG12 overexpression H/R+miR-138-5p mimics H/R+co-transfection H/R+co-transfection negative control ROS/（×103A.U.）4.64±0.59 43.07±8.221）LDH/（U·kg prot）0.54±0.10 1.32±0.271）6.04±0.832）3）0.56±0.112）3）67.31±10.242）3）41.98±9.041）1.97±0.322）3）1.30±0.251）43.74±8.651）1.33±0.281）

2.4 各組細(xì)胞炎癥因子IL-6、IL-17、IL-18水平 與對(duì)照組相比，H/R 模型組細(xì)胞炎癥因子IL-6、IL-17、IL-18 水平升高（P<0.05）；與H/R 模型組、H/R+共轉(zhuǎn)染組相比，H/R+LncRNA SNHG12 過表達(dá)組細(xì)胞炎癥因子IL-6、IL-17、IL-18 水平降低（P<0.05），H/R+miR-138-5p mimics 組 細(xì) 胞 炎 癥 因 子IL-6、IL-17、IL-18 水平升高（P<0.05）；與H/R 模型組相比，H/R+共轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組、H/R+共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞炎癥因子IL-6、IL-17、IL-18 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，表5）。

表5 各組細(xì)胞炎癥因子IL-6、IL-17、IL-18水平（±s，n=6）Tab.5 Levels of cytokines IL-6， IL-17 and IL-18 in each group （±s，n=6）

表5 各組細(xì)胞炎癥因子IL-6、IL-17、IL-18水平（±s，n=6）Tab.5 Levels of cytokines IL-6， IL-17 and IL-18 in each group （±s，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with H/R model group， 2）P<0.05； compared with H/R+co-transfection group， 3）P<0.05.

IL-18/（ng·L-1）12.62±1.10 67.25±7.281）14.01±1.132）3）84.17±9.242）3）64.98±6.121）65.81±7.501）Groups Control H/R model H/R+LncRNA SNHG12 overexpression H/R+miR-138-5p mimics H/R+co-transfection H/R+co-transfection negative control IL-6/（ng·L-1）16.18±2.12 63.72±10.871）18.06±2.982）3）95.83±12.722）3）60.39±8.401）64.96±11.051）IL-17/（ng·L-1）5.65±0.71 37.24±5.821）7.03±1.022）3）58.79±6.922）3）34.97±3.811）37.54±5.531）

2.5 各組細(xì)胞miR-138-5p 及HIF-1α mRNA 水平

與對(duì)照組相比，H/R 模型組細(xì)胞HIF-1α mRNA 水平升高（P<0.05），miR-138-5p 水平降低（P<0.05）。與H/R 模型組、H/R+共轉(zhuǎn)染組相比，H/R+LncRNA SNHG12 過表達(dá)組細(xì)胞HIF-1α mRNA 水平升高（P<0.05），miR-138-5p 水平降低（P<0.05）；H/R+miR-138-5p mimics 組 細(xì) 胞miR-138-5p 水 平 升 高（P<0.05），HIF-1α mRNA 水平降低（P<0.05）。與H/R模型組相比，H/R+共轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組、H/R+共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞miR-138-5p 及HIF-1α mRNA 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，表6）。

表6 各組細(xì)胞miR-138-5p 及HIF-1α mRNA 水平（±s，n=6）Tab.6 miR-138-5p and HIF-1α mRNA level of cells in each group （±s，n=6）

表6 各組細(xì)胞miR-138-5p 及HIF-1α mRNA 水平（±s，n=6）Tab.6 miR-138-5p and HIF-1α mRNA level of cells in each group （±s，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with H/R model group， 2）P<0.05； compared with H/R+co-transfection group， 3）P<0.05.

Groups Control H/R model H/R+LncRNA SNHG12 overexpression H/R+miR-138-5p mimics H/R+co-transfection H/R+co-transfection negative control miR-138-5p/U6 1.01±0.08 0.82±0.071）HIF-1α/GAPDH 0.98±0.09 1.29±0.111）0.37±0.052）3）1.98±0.182）3）0.99±0.122）3）1.31±0.101）1.30±0.131）1.04±0.102）3）0.80±0.091）0.83±0.061）

2.6 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡蛋白caspase-9、Bax 及HIF-1α 蛋白水平 與對(duì)照組相比，H/R 模型組細(xì)胞caspase-9、Bax 及HIF-1α 蛋白水平升高（P<0.05）。與H/R 模型組、H/R+共轉(zhuǎn)染組相比，H/R+LncRNA SNHG12 過表達(dá)組細(xì)胞HIF-1α 蛋白水平升高（P<0.05），caspase-9、Bax 蛋 白 水 平 降 低（P<0.05）；H/R+miR-138-5p mimics 組細(xì)胞HIF-1α 蛋白水平降低（P<0.05），caspase-9、Bax 蛋白水平升高（P<0.05）。與H/R 模型組相比，H/R+共轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組、H/R+共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞caspase-9、Bax 及HIF-1α蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，圖2、表7）。

圖2 蛋白免疫印跡檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡蛋白caspase-9、Bax及HIF-1α的表達(dá)Fig.2 Apoptosis proteins caspase-9， Bax and HIF-1α were detected by Western blot

表7 各組細(xì)胞caspase-9、Bax及HIF-1α蛋白表達(dá)水平（±s，n=6）Tab.7 caspase-9， Bax and HIF-1α protein expression levels of cells in each group （±s，n=6）

表7 各組細(xì)胞caspase-9、Bax及HIF-1α蛋白表達(dá)水平（±s，n=6）Tab.7 caspase-9， Bax and HIF-1α protein expression levels of cells in each group （±s，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with H/R model group， 2）P<0.05； compared with H/R+co-transfection group， 3）P<0.05.

HIF-1α/GAPDH 0.48±0.05 0.63±0.061）1.38±0.172）3）0.49±0.042）3）0.62±0.071）0.64±0.051）Groups Control H/R model H/R+LncRNA SNHG12 overexpression H/R+miR-138-5p mimics H/R+co-transfection H/R+co-transfection negative control caspase-9/GAPDH 0.37±0.04 0.86±0.121）0.39±0.052）3）1.29±0.162）3）0.85±0.121）0.87±0.111）Bax/GAPDH 0.41±0.07 0.95±0.111）0.43±0.082）3）1.34±0.152）3）0.94±0.101）0.96±0.131）

3 討論

缺血再灌注發(fā)生后，血管內(nèi)氧穩(wěn)態(tài)被破壞，導(dǎo)致ROS、自由基大量產(chǎn)生釋放，誘導(dǎo)促炎因子過表達(dá)，造成血管內(nèi)皮細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷與凋亡，是缺血再灌注組織損傷的主要發(fā)病機(jī)制之一，建立血管內(nèi)皮細(xì)胞H/R 模型，對(duì)于體外研究組織缺血再灌注損傷具有重大意義［13-14］。本研究給予體外培養(yǎng)的HUVECs 缺氧5 h，再進(jìn)行復(fù)氧1 h 處理，誘導(dǎo)建立細(xì)胞模型，結(jié)果顯示，相比未做處理的細(xì)胞，其凋亡率、細(xì)胞ROS、LDH、IL-6、IL-17 及IL-18 水平、細(xì)胞caspase-9 及Bax 蛋白水平升高，細(xì)胞活力降低，表明H/R 可誘導(dǎo)ROS、促炎細(xì)胞因子大量產(chǎn)生釋放，引發(fā)過氧化及炎癥反應(yīng)，促使細(xì)胞凋亡，造成嚴(yán)重的細(xì)胞損傷，揭示H/R模型構(gòu)建成功。

LncRNA SNHG12是細(xì)胞存活、凋亡及損傷的重要調(diào)控因子，在腦缺血再灌注損傷后，表達(dá)水平會(huì)有所上調(diào)，發(fā)揮腦組織保護(hù)作用，過表達(dá)LncRNA SNHG12，可抑制自噬，降低缺血再灌注誘導(dǎo)的ROS和丙二醛（malondialdehyde，MDA）釋放，抑制氧化應(yīng)激，顯著提高細(xì)胞活力，減弱其凋亡，改善腦缺血再灌注損傷［15-17］。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)H/R 模型細(xì)胞中LncRNA SNHG12，可增強(qiáng)細(xì)胞活力，降低細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞ROS、LDH、IL-6、IL-17及IL-18水平、細(xì)胞caspase-9 與Bax 蛋白水平，表明LncRNA SNHG12 表達(dá)會(huì)在細(xì)胞H/R 后保護(hù)性升高，促進(jìn)其表達(dá)，可阻止氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展，促使細(xì)胞存活，抑制其凋亡，減輕細(xì)胞損傷，進(jìn)一步增強(qiáng)LncRNA SNHG12的細(xì)胞保護(hù)作用。

HIF-1α 作為一種缺氧誘導(dǎo)因子，在H/R 處理后，表達(dá)會(huì)上調(diào)，可保護(hù)細(xì)胞免于H/R造成的炎癥及氧化應(yīng)激損傷［18］。miR-138-5p 是HIF-1α 的一個(gè)調(diào)控因子，可負(fù)向調(diào)節(jié)其表達(dá)水平，且缺血再灌注可誘導(dǎo)miR-138-5p 表達(dá)上調(diào)，而下調(diào)miR-138-5p 表達(dá)可顯著降低心肌細(xì)胞凋亡率，減輕心肌梗死后心肌組織損傷，改善心功能［8，19］。另有研究表明，LncRNA SNHG12 可正調(diào)控HIF-1α 表達(dá)，改善氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞表型變化，因而推測(cè)調(diào)控miR-138-5p/HIF-1α 軸可能是LncRNA SNHG12 改善H/R 引發(fā)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的分子機(jī)制［20］。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)H/R 模型細(xì)胞中miR-138-5p，可降低其細(xì)胞活力、細(xì)胞HIF-1α mRNA 及蛋白水平，升高細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞ROS、LDH、IL-6、IL-17 及IL-18 水平、細(xì)胞caspase-9 與Bax蛋白水平，表明miR-138-5p/HIF-1α 軸參與介導(dǎo)H/R引發(fā)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷過程，促進(jìn)miR-138-5p 表達(dá)，可下調(diào)HIF-1α表達(dá)，加重細(xì)胞損傷及凋亡，且在H/R 模型細(xì)胞中過表達(dá)LncRNA SNHG12，可降低其miR-138-5p 水平，升高HIF-1α mRNA 及蛋白水平，但Lnc-RNA SNHG12改善H/R 人血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是否通過調(diào)控miR-138-5p/HIF-1α實(shí)現(xiàn)的，目前尚未有明確報(bào)道，本研究為了對(duì)此進(jìn)行研究驗(yàn)證，于H/R模型細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染了LncRNA SNHG12 過表達(dá)質(zhì)粒和miR-138-5p mimics，結(jié)果顯示，以miR-138-5p mimics 可減弱LncRNA SNHG12 阻止H/R 引發(fā)的嚴(yán)重與氧化應(yīng)激，增強(qiáng)細(xì)胞活力的作用，逆轉(zhuǎn)其抗凋亡功效，表明LncRNA SNHG12 阻止H/R 引發(fā)的炎癥與氧化應(yīng)激，促使細(xì)胞活力增強(qiáng)和逆轉(zhuǎn)其抗凋亡功效，最終改善H/R 人血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是通過下調(diào)miR-138-5p，上調(diào)HIF-1α表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

總 之，LncRNA SNHG12 可 下 調(diào)miR-138-5p 表達(dá)，促進(jìn)HIF-1α 表達(dá)，抑制ROS 和炎癥細(xì)胞因子釋放，阻止氧化應(yīng)激及炎癥發(fā)生發(fā)展，增強(qiáng)細(xì)胞活力，減弱凋亡過程，改善細(xì)胞損傷，調(diào)控miR-138-5p/HIF-1α 軸是其分子機(jī)制之一，本研究為臨床各種組織器官缺血再灌注損傷的防治提供了新的治療靶點(diǎn)，促進(jìn)了心血管疾病治療策略的發(fā)展。