綿羊肺腺瘤病毒SU蛋白與Hyal-2蛋白的結(jié)合域研究

張?jiān)旅罚w世華,么宏強(qiáng)，馬學(xué)恩

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018; 2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031)

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綿羊肺腺瘤病毒SU蛋白與Hyal-2蛋白的結(jié)合域研究

張?jiān)旅?,2，趙世華2,么宏強(qiáng)1*，馬學(xué)恩1*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018; 2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031)

摘要：試驗(yàn)證明綿羊的Hyal-2不僅可以與綿羊肺腺瘤病毒的囊膜蛋白Env結(jié)合，也可以單獨(dú)與綿羊肺腺瘤病毒SU蛋白亞基結(jié)合。為了進(jìn)一步研究綿羊Hyal-2與SU蛋白可能結(jié)合的區(qū)域，應(yīng)用在線生物學(xué)軟件預(yù)測(cè)了SU蛋白的膜外區(qū)(對(duì)應(yīng)編碼基因序列238 bp～867 bp)將之前已經(jīng)構(gòu)建的缺失型SU蛋白真核表達(dá)載體pEGFP-C1-(su1-su5)與pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，運(yùn)用激光共聚焦方法結(jié)合免疫共沉淀方法確定SU蛋白和Hyal-2蛋白可能結(jié)合區(qū)域。激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果表明,SU1-SU5與Hyal-2均存在細(xì)胞內(nèi)共定位。免疫共沉淀方法檢測(cè)缺失型蛋白SU1-SU5與綿羊Hyal-2均不存在相互作用。su基因所缺失區(qū)域238 bp～867 bp對(duì)于SU蛋白與受體的結(jié)合都是必不可少的。

關(guān)鍵詞：綿羊肺腺瘤病毒；SU蛋白；Hyal-2蛋白；結(jié)合區(qū)域

綿羊肺腺瘤病(OPA)是由綿羊肺腺瘤病毒(Ovine pulmonary adenomatosis virus,OPAV)引起的自然發(fā)生的一種慢性進(jìn)行性接觸傳染性的支氣管肺泡腺癌[1-2]，其特點(diǎn)是肺泡上皮細(xì)胞增殖和肺液的過(guò)量產(chǎn)生。該病毒的本質(zhì)是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，并且它是已知的唯一在自然條件下可以引起綿羊肺腺瘤的病毒[1]。OPAV的細(xì)胞受體是一個(gè)糖基化磷脂酰肌醇(gycosylphosphatidylinositol，GPI)-錨定蛋白，稱為透明質(zhì)酸酶2(Hyal-2)。對(duì)應(yīng)于人類染色體3p21.3，這是一個(gè)腫瘤抑制區(qū)[3-4]。在綿羊、人、猴、牛、狗、兔細(xì)胞中，OPAV能夠利用Hyal-2作為受體，但在大鼠、小鼠或者倉(cāng)鼠不能使用Hyal-2作為受體[5]。與透明質(zhì)酸酶其他家庭成員相比，Hyal-2具有非常弱的活性，但是作為外源性O(shè)PAV和內(nèi)源性O(shè)PAV的 Env蛋白的一個(gè)有效受體起作用[4,6]。外源性O(shè)PAV的SU結(jié)構(gòu)域在體外可以直接與人類Hyal-2相互作用介導(dǎo)病毒進(jìn)入人類和大鼠的細(xì)胞[7]。為了驗(yàn)證綿羊的Hyal-2與SU相互作用時(shí)SU可能參與的結(jié)合區(qū)域，本試驗(yàn)運(yùn)用激光共聚焦結(jié)合免疫共沉淀法驗(yàn)證了SU與Hyal-2可能結(jié)合的區(qū)域。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1模板及細(xì)胞真核表達(dá)載體pEGFP-C1-(su1-su5)和pDsRed-monomer-N1-hyal-2載體，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)病理實(shí)驗(yàn)室保存；293T細(xì)胞，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)病理實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2主要試劑與儀器 Lipofectamine 2000、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，購(gòu)自Invitrogen公司；胎牛血清，購(gòu)自TBD公司。Pierce Co-Immunoprecipitation (Co-IP) Kit、Anti-RFP(RF5R) mouse antibody，購(gòu)自Thermo公司；Anti-GFP mouse antibody、Goat-anti mouse IgG HRP 抗體，購(gòu)自EARTH OX公司。

電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；PCR儀，Biometra公司產(chǎn)品；迷你離心機(jī)，其林貝爾公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)，Sagecreation公司產(chǎn)品；電泳儀，Bio-Rad公司產(chǎn)品；離心機(jī)，Thermo公司產(chǎn)品；電熱恒溫水浴鍋，北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；多功能酶標(biāo)儀，GE Healthcare公司產(chǎn)品；超純水儀，Elga公司產(chǎn)品；恒溫水平搖床，太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠產(chǎn)品；制冰機(jī)，Graxt公司產(chǎn)品；微量移液器，Eppendorf公司產(chǎn)品；-80℃超低溫箱，Haier公司產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)，Boxun公司產(chǎn)品；微波爐，格蘭仕公司產(chǎn)品；震蕩儀，Thermo公司產(chǎn)品；電熱恒溫培養(yǎng)箱、電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司產(chǎn)品；滅菌鍋，Hirayama制造公司產(chǎn)品；核酸電泳儀，北京市六一儀器廠產(chǎn)品；熒光倒置顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡，Olympus公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1激光共聚焦顯微鏡觀察蛋白的共表達(dá)情況 pEGFP-C1-(su1-su5)真核表達(dá)載體為運(yùn)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)SU蛋白膜外區(qū)后，按照蛋白多肽從N端到C端順序分別缺失150個(gè)堿基(50個(gè)氨基酸)后，再通過(guò)重疊PCR連接缺失后兩個(gè)片段而構(gòu)建的一系列真核表達(dá)載體。pDsRed-monomer-N1-hyal-2真核表達(dá)載體為運(yùn)用重疊PCR方法擴(kuò)增出hyal-2基因后構(gòu)建的表達(dá)hyal-2的真核表達(dá)載體[8]。

轉(zhuǎn)染前24 h將狀態(tài)良好的293T細(xì)胞，用胰酶消化4 min左右，待細(xì)胞在鏡下觀察成為單個(gè)圓形后，迅速吸出胰酶，加入DMEM高糖含血無(wú)雙抗培養(yǎng)基，吹打均勻后，鋪細(xì)胞于激光共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿，第2天觀察細(xì)胞匯合度達(dá)80%以上進(jìn)行共轉(zhuǎn)染試驗(yàn)，于48 h后將細(xì)胞固定及核染，然后觀察細(xì)胞內(nèi)目的蛋白的共表達(dá)及定位情況。共轉(zhuǎn)染的設(shè)計(jì)：

未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為陰性對(duì)照；pDsRed-monomer-N1-hyal-2和pEGFP-C1共轉(zhuǎn)染；pDsRed-monomer-N1和pEGFP-C1-su1共轉(zhuǎn)染；pDsRed-monomer-N1和pEGFP-C1-su2共轉(zhuǎn)染；pDsRed-monomer-N1和pEGFP-C1-su3共轉(zhuǎn)染；pDsRed-monomer-N1和pEGFP-C1-su4共轉(zhuǎn)染；pDsRed-monomer-N1和pEGFP-C1-su5共轉(zhuǎn)染；pEGFP-C1-su1和pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉(zhuǎn)染；pEGFP-C1-su2和 pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉(zhuǎn)染； pEGFP-C1-su3和 pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉(zhuǎn)染；pEGFP-C1-su4和 pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉(zhuǎn)染；pEGFP-C1-su5和 pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉(zhuǎn)染；每個(gè)共轉(zhuǎn)染孔兩個(gè)重復(fù)。于48h后在熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度(結(jié)果略)。

之后應(yīng)用免疫共沉淀試劑盒進(jìn)行免疫共沉淀。

1.2.2免疫共沉淀法檢測(cè)蛋白相互作用將狀態(tài)良好的293T細(xì)胞，用胰酶消化4 min左右，待細(xì)胞在鏡下觀察成為單個(gè)圓形后，迅速吸出胰酶，加入DMEM高糖含血無(wú)雙抗培養(yǎng)基，吹打均勻后，將細(xì)胞鋪于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿(每個(gè)樣品需3個(gè))，次日待細(xì)胞融合度為80%左右，運(yùn)用脂質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

將構(gòu)建好的缺失型真核表達(dá)載體pEGFP-C1-(su1-su5)分別與pDsRed- monomer-N1-hyal-2共轉(zhuǎn)染入24 h前鋪好的細(xì)胞培養(yǎng)皿，每組組合需要3個(gè)10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿。試驗(yàn)分組設(shè)計(jì)原則同上，免疫共沉淀試驗(yàn)步驟詳見Pierce Co-Immunoprecipitation (Co-IP) Kit說(shuō)明書。

2結(jié)果

2.1共轉(zhuǎn)染的激光共聚焦顯微鏡的熒光觀察

由圖1可知，對(duì)照組的共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)的2種蛋白均不存在蛋白的細(xì)胞內(nèi)共定位，即pEGFP-C1-(su1-su5)和pDsRed-monomer-N1共轉(zhuǎn)染的對(duì)照組和pEGFP-C1和pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉(zhuǎn)染的對(duì)照組均不存在細(xì)胞內(nèi)蛋白的共定位。而pEGFP-C1-(su1-su5)和pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉(zhuǎn)染的樣品組存在蛋白的細(xì)胞內(nèi)共定位情況。

2.2免疫共沉淀檢測(cè)結(jié)果

由圖2和圖3可知，用Anti-RFP(RF5R) mouse antibody作為檢測(cè)共轉(zhuǎn)染后免疫共沉淀試驗(yàn)的檢測(cè)抗體檢測(cè)Hyal-2融合蛋白，發(fā)現(xiàn)除了共轉(zhuǎn)染pDsRed-monomer-N1-hyal-2和pEGFP-C1-su1的蛋白裂解液在81 ku出現(xiàn)陽(yáng)性條帶，其他對(duì)照組和樣品組均未出現(xiàn)陽(yáng)性條帶。

3討論

將構(gòu)建好的缺失型真核表達(dá)載體pEGFP-C1-(su1-su5)與Hyal-2真核表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，由于Hyal-2真核表達(dá)載體pDsRed-monomer-N1-hyal-2中融合有紅色熒光蛋白DsRed，而缺陷型SU蛋白真核表達(dá)載體pEGFP-C1中融合有綠色熒光蛋白EGFP，可以在兩種攜帶目的基因的真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)后，在不同的激發(fā)光下觀察熒光的發(fā)生，從而確定兩種真核表達(dá)載體表達(dá)的目的蛋白是否能共表達(dá)在細(xì)胞中，以及通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察共表達(dá)的目的蛋白的共定位情況。試驗(yàn)結(jié)果表明，將pEGFP-C1-(su1-su5)真核表達(dá)載體與pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉(zhuǎn)染后均存在蛋白的細(xì)胞內(nèi)共定位情況。但是從之前的試驗(yàn)結(jié)果中pDsRed-monomer-N1-hyal-2單獨(dú)轉(zhuǎn)染后目的蛋白細(xì)胞內(nèi)定位觀察及pEGFP-C1-(su1-su5)單獨(dú)轉(zhuǎn)染后目的蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位不難發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是Hyal-2蛋白還是SU1-SU5蛋白均定位于細(xì)胞質(zhì)中[8]，因此，相同的亞細(xì)胞定位并不能證明蛋白發(fā)生了相互作用。蛋白是否存在相互作用還需進(jìn)行免疫共沉淀反應(yīng)。最后通過(guò)SDS-PAGE和蛋白質(zhì)免疫印跡方法鑒定蛋白是否存在相互作用。試驗(yàn)結(jié)果表明，su1-su5基因所缺失的堿基序列均對(duì)于SU蛋白與Hyal-2蛋白的結(jié)合是必須的，即su基因的238 bp～867 bp對(duì)于與受體的結(jié)合都是必不可少的，這與Miller A D[9]的報(bào)道略有差異，可能是分段方法的不同引起的。

A1～A4.pDsRed-monomer-N1和pEGFP-C1-su1共轉(zhuǎn)染；B1～B4.pDsRed-monomer-N1和pEGFP-C1-su2共轉(zhuǎn)染；C1～C4.pDsRed-monomer-N1和pEGFP-C1-su3共轉(zhuǎn)染；D1～D4.pDsRed-monomer-N1和pEGFP-C 1-su4共轉(zhuǎn)染；E1～E4.pDsRed-monomer-N1和pEGFP-C1-su5共轉(zhuǎn)染；F1～F4.pDsRed-monomer-N1-hyal-2和pEGFP-C1共轉(zhuǎn)染；G1～G3.未轉(zhuǎn)染細(xì)胞(陰性對(duì)照)；H1～h1.pEGFP-C1-su1和pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉(zhuǎn)染；J1～J4.pEGFP-C1-su2和pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉(zhuǎn)染；K1～K4.pEGFP-C1-su3和pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉(zhuǎn)染；L1～L4.pEGFP-C1-su4和pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉(zhuǎn)染；M1～M4.pEGFP-C1-su5和pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉(zhuǎn)染

A1-A4.Cotransfection of pDsRed-monomer-N1 and pEGFP-C1-su1；B1-B4.Cotransfection of pDsRed-monomer-N1 and pEGFP-C1-su2；C1-C4.Cotransfection of pDsRed-monomer-N1 and pEGFP-C1-su3；D1-D4.Cotransfection of pDsRed-monomer-N1 and pEGFP-C1-su4；E1-E4.Cotransfection of pDsRed-monomer-N1 and pEGFP-C1-su5；F1-F4.Cotransfection of pDsRed-monomer-N1-hyal-2 and pEGFP-C1；G1-G3.Negative control；H1-h1.Cotransfection of pEGFP-C1-su1 and pDsRed-monomer-N1-hyal-2；J1-J4.Cotransfection of pEGFP-C1-su2 and pDsRed-monomer-N1-hyal-2；K1-K4.Cotransfection of pEGFP-C1-su3 and pDsRed-monomer-N1-hyal-2；L1-L4.Cotransfection of pEGFP-C1-su4 and pDsRed-monomer-N1-hyal-2；M1-M4.Cotransfection of pEGFP-C1-su5 and pDsRed-monomer-N1-hyal-2

圖1激光共聚焦顯微鏡的熒光觀察

Fig.1Fluorescent observation with laser confocal microscope

1.共轉(zhuǎn)染pDsRed-monomer-N1-hyal-2和pEGFP-C1-su1的蛋白裂解液；2.偶聯(lián)山羊抗鼠IgG對(duì)照，含有共轉(zhuǎn)染hyal-2-pDsRed-monomer-N1和pEGFP-C1-su1的蛋白裂解液；3.pEGFP-C1和pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉(zhuǎn)染蛋白免疫共沉淀對(duì)照；4.pEGFP-C1-su1和pDsRed-monomer-N1共轉(zhuǎn)染蛋白免疫共沉淀對(duì)照；5. pEGFP-C1-su2和pDsRed-monomer-N1共轉(zhuǎn)染蛋白免疫共沉淀對(duì)照；6.pEGFP-C1-su3和pDsRed-monomer-N1共轉(zhuǎn)染蛋白免疫共沉淀對(duì)照；7.pEGFP-C1-su4和pDsRed-monomer-N1共轉(zhuǎn)染蛋白免疫共沉淀對(duì)照；8.pEGFP-C1-su5和pDsRed-monomer-N1共轉(zhuǎn)染蛋白免疫共沉淀對(duì)照；M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1.Lysis buffer of pDsRed-monomer-N1-hyal-2 and pEGFP-C1-su1 cotransfected in cells；2.Control of goat anti-mouse IgG；3.Co-immunoprecipitation control of pEGFP-C1and pDsRed-monomer-N1 cotransfected in cells；4.Co-immunoprecipitation control of pEGFP-C1-su1 and pDsRed-monomer-N1 cotransfected in cells；5.Co-immunoprecipitation control of pEGFP-C1-su2 and pDsRed-monomer-N1 cotransfected in cells；6.Co-immunoprecipitation control of pEGFP-C1-su3 and pDsRed-monomer-N1 cotransfected in cells；7.Co-immunoprecipitation control of pEGFP-C1-su4 and pDsRed-monomer-N1 cotransfected in cells；8.Co-immunoprecipitation control of pEGFP-C1-su5 and pDsRed-monomer-N1 cotransfected in cells；M.Protein molecular weight Marker

圖2免疫共沉淀檢測(cè)結(jié)果(1)

Fig.2Detection results of co-immunoprecipitation (1)

1.偶聯(lián)山羊抗兔IgG對(duì)照，共轉(zhuǎn)染hyal-2-pDsRed-monomer-N1和pEGFP-C1-su2的蛋白裂解液；2.共轉(zhuǎn)染hyal-2-pDsRed-monomer-N1和pEGFP-C1-su1的蛋白裂解液；3.pEGFP-C1-su1和pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉(zhuǎn)染蛋白免疫共沉淀；4.pEGFP-C1-su2和pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉(zhuǎn)染蛋白免疫共沉淀；5.pEGFP-C1-su3和pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉(zhuǎn)染蛋白免疫共沉淀；6.pEGFP-C1-su4和pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉(zhuǎn)染蛋白免疫共沉淀；7.pEGFP-C1-su5和pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉(zhuǎn)染蛋白免疫共沉淀；M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1.Control of goat anti-miouse IgG；2.Lysis buffer of pDsRed-monomer-N1-hyal-2 and pEGFP-C1-su1 cotransfected in cells；3.Co-immunoprecipitation results of pEGFP-C1-su1and pDsRed-monomer-N1-hyal-2 cotransfected in cells；4.Co-immunoprecipitation results of pEGFP-C1-su2 and pDsRed-monomer-N1-hyal-2 cotransfected in cells；5.Co-immunoprecipitation results of pEGFP-C1-su3 and pDsRed-monomer-N1-hyal-2 cotransfected in cells；6.Co-immunoprecipitation results of pEGFP-C1-su4 and pDsRed-monomer-N1-hyal-2 cotransfected in cells；7.Co-immunoprecipitation results of pEGFP-C1-su5 and pDsRed-monomer-N1-hyal-2 cotransfected in cells；M.Protein molecular weight Marker

圖3免疫共沉淀檢測(cè)結(jié)果(2)

Fig.3Detection results of co-immunoprecipitation (2)

本試驗(yàn)通過(guò)將缺失型pEGFP-C1-(su1-su5)真核表達(dá)載體，與pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉(zhuǎn)染將其轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)了pEGFP-C1-(su1-su5)與pDsRed-monomer-N1-hyal-2在細(xì)胞內(nèi)的共表達(dá)；運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡觀察到了各種組合下蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位情況，結(jié)果表明，SU1-SU5與Hyal-2均存在細(xì)胞內(nèi)共定位。免疫共沉淀法結(jié)果證明，su1-su5基因所缺失的堿基序列238 bp～867 bp對(duì)于SU蛋白與Hyal-2蛋白的結(jié)合是必須的。

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Study on Possible Binding Region Between SU Protein of Ovine Pulmonary Adenomatosis Virus and Hyal-2 Protein

ZHANG Yue-mei1,2, ZHAO Shi-hua2，YAO Hong-qiang1, MA Xue-en1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Huhhot,InnerMongolia,010018,China;2.InstituteofVeterinaryMedicine,InnerMongoliaAcademyofAgriculturalandAnimalHusbandry,Huhhot,InnerMongolia,010031,China)

Abstract:The experimental results have shown that the Hyal-2 can not only be combined with the Env protein of Ovine pulmonary adenomatosis virus(OPAV),but also can be combined with the SU protein of OPAV.To design the experiment for further studying the possible binding regions of Hyal-2 and SU protein,the extracellular domain of SU protein was predicted by using online biology software(238 bp-867 bp). pEGFP-C1- (su1-su5) and pDsRed-monomer-N1-hyal-2 vectors were cotransfected into 293T cells.The possible binding area between SU protein and Hyal-2 protein by using laser confocus and co-immunoprecipitation methods was determined.The results showed that SU1-SU5 and Hyal-2 were co-located in the cells,there was no interaction between the SU1-SU5 and the Hyal-2 of sheep by using the method of co-immunoprecipitation.The deleted region 238 bp-867 bp of the su gene is essential for the binding of SU with the receptor.

Key words:ovine pulmonary adenomatosis virus;SU protein;Hyal-2 protein;binding region

文章編號(hào):1007-5038(2016)04-0049-05

中圖分類號(hào):S852.65;Q789

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

作者簡(jiǎn)介：張?jiān)旅? 1982- ) ，女，內(nèi)蒙古呼和浩特人，助理研究員，博士，主要從事動(dòng)物傳染病相關(guān)研究。*通訊作者

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目( 31101788)

收稿日期：2015-09-14