洛陽不同養(yǎng)殖方式豬源大腸埃希菌耐藥性分析

孫理云，劉志軍，周博文

(河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，河南洛陽 471003)

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洛陽不同養(yǎng)殖方式豬源大腸埃希菌耐藥性分析

孫理云，劉志軍，周博文

(河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，河南洛陽 471003)

摘要：為了解洛陽市散養(yǎng)和集約化養(yǎng)殖方式豬源大腸埃希菌耐藥譜， 采用Kirby-Bauer紙片瓊脂擴(kuò)散法測定35株集約化養(yǎng)殖場豬源大腸埃希菌(其中17株肥育豬源、10株生長豬源、8株保育豬源)和6株散養(yǎng)肥育豬源大腸埃希菌對氨芐西林、阿莫西林/棒酸、頭孢噻肟、萘啶酸、恩諾沙星、氧氟沙星、復(fù)方新諾明、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、慶大霉素和大觀霉素共11種抗菌藥物的耐藥性。結(jié)果表明，散養(yǎng)肥育豬源大腸埃希菌僅對氨芐西林、四環(huán)素和強(qiáng)力霉素耐藥，集約化養(yǎng)殖場豬源大腸埃希菌對11種檢測藥物的耐藥率明顯高于散養(yǎng)豬源的大腸埃希菌；測定41株細(xì)菌具有19種耐藥模式，其中散養(yǎng)肥育豬源大腸埃希菌有5種模式，集約化養(yǎng)殖場豬源大腸埃希菌有17種模式， 13種為多重耐藥模式；88.6%(31/35)集約化養(yǎng)殖場豬源菌交叉耐藥，33.3%(2/6)散養(yǎng)豬源菌僅交叉耐四環(huán)素和強(qiáng)力霉素。

關(guān)鍵詞：豬；大腸埃希菌；多重耐藥性

集約化養(yǎng)殖導(dǎo)致食品動物抗菌藥物的廣泛使用,造成動物源細(xì)菌耐藥性不斷上升，也出現(xiàn)了很普遍的多重耐藥菌甚至泛耐藥菌。動物源細(xì)菌耐藥性不僅會導(dǎo)致治療失敗，直接影響動物的健康和福利[1]，也已成為公共衛(wèi)生的一種重要威脅，為全球普遍關(guān)注的公共衛(wèi)生問題，因而近年來人們加強(qiáng)了對動物源細(xì)菌的抗菌藥物抗性的監(jiān)測[1]。

監(jiān)測的細(xì)菌通常包括人獸共患病病原菌、獸醫(yī)病菌和指示菌[2]。監(jiān)測革蘭陽性菌耐藥性的指示菌常選腸球菌，革蘭陰性菌耐藥性的指示菌為大腸埃希菌。選這些細(xì)菌為指示菌是由于其作為人和動物的主要共生菌無處不在，應(yīng)對抗生素選擇性壓力可獲得耐藥性，它們能將耐藥性轉(zhuǎn)移給致病菌及共生菌間轉(zhuǎn)移耐藥性[3]。

治療豬細(xì)菌性疾病常用的抗菌藥物包括β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、氯霉素類、氟喹諾酮類和葉酸拮抗劑等，因而細(xì)菌耐藥性的監(jiān)測常為對這些種類藥物耐藥性監(jiān)測，以期了解和掌握動物源細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生及擴(kuò)散程度，利于獸醫(yī)臨床合理選擇和使用抗菌藥物。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)菌株2015年4月分離自河南省洛陽市某豬場健康豬糞樣,其中生產(chǎn)母豬大腸埃希菌菌株10株，分別為S1、S2、S3 、S5、S6、S7、S8、S9、S10和S11，育肥豬大腸埃希菌菌株17株，為Y1、Y2、Y3、Y5、Y6、Y8、Y9、Y10、Y11、Y12、Y13、Y14、Y15、Y16、Y17、Y18 和Y20，保育豬大腸埃希菌菌株8株，為B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7和B8。另有從2個散養(yǎng)戶養(yǎng)殖的健康育肥豬分離的大腸埃希菌菌株6株，分別為C1、C2、C3、C4、C5和C6。藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌為大腸埃希菌ATCC25922。

1.1.2主要培養(yǎng)基和試劑營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、MH培養(yǎng)基，杭州天和微生物試劑有限公司的產(chǎn)品；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，北京雙螺旋微生物培養(yǎng)基制品有限公司產(chǎn)品。

抗菌藥物藥敏紙片5類11種，分別為β-內(nèi)酰胺類的氨芐西林(Amp，10 μg/片，批號：150407)、阿莫西林/棒酸 (Amc，20 μg/10 μg /片，批號：150324)和頭孢噻肟(Ctx，30 μg/片，批號：150116)，氟喹諾酮類的萘啶酸(Na，30 μg/片，批號：150127)、恩諾沙星(Enr，15 μg/片，批號：150205)和氧氟沙星(Ofl，5 μg/片，批號：150123)，葉酸合成抑制劑類的復(fù)方新諾明(Sut，23.75 μg/ 1.25 μg/片，批號：150210)，四環(huán)素類的四環(huán)素(Tet，30 μg/片，批號：150206)和強(qiáng)力霉素(Dox，30 μg/片，批號：150324)，氨基糖苷類的慶大霉素(Gen，10 μg/片，批號：150104)和大觀霉素(Spt，100 μg/片，批號：150303)，杭州濱和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1藥敏試驗(yàn)采用臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)推薦的Kirby-Bauer紙片瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行[4]。從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取3個～5個形態(tài)特征一致的菌落，用接種環(huán)將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到含5 mL適宜的肉湯培養(yǎng)基中。將肉湯培養(yǎng)物置37℃孵育12 h。將菌液均勻涂布于MH瓊脂平板。涂布細(xì)菌后15 min之內(nèi)在瓊脂表面置放藥敏紙片。紙片貼好后15 min內(nèi)將平板倒置于37℃培養(yǎng)，16 h～18 h測定抑菌圈直徑，細(xì)菌耐藥性參照CLSI(2012)標(biāo)準(zhǔn)判定。

1.2.2數(shù)據(jù)處理分析將對檢測某藥具抗性或中介的菌株歸為耐藥菌株；不同來源菌的耐藥率為耐藥菌株數(shù)與檢測菌株數(shù)之比。

大腸埃希菌抗菌藥物耐藥率，按照公式：A/Bxl00%來計算，A表示某種豬源大腸埃希菌耐藥菌的數(shù)量；B表示某種豬源大腸埃希菌所有菌株的數(shù)量。

計算不同來源菌的多重耐藥指數(shù):MARI=a/bc，其中a為代表某來源細(xì)菌的總抗菌藥物耐藥值，b代表檢測的抗菌藥物種類數(shù)目,c代表某來源細(xì)菌菌株數(shù),0

2結(jié)果

2.1多重耐藥指數(shù)

由表1可見，散養(yǎng)豬源菌的MARI最小，為0.12。集約化養(yǎng)殖場豬源菌的MARI為0.57，其中母豬源菌最高，為0.64，保育豬源菌次之，為0.55，育肥豬源菌再次之，為0.53。

表1　不同生長期豬源大腸埃希菌的多抗菌藥物耐藥指數(shù)

2.2耐藥率分析

不同生長期的豬源大腸埃希菌對11種所測抗菌藥物的耐藥水平如表2所示。

表2　不同生長期豬源大腸埃希菌的耐藥水平

散養(yǎng)育肥豬源菌僅對Tet有很高水平的耐藥性，對Amp和Dox 3種抗菌藥物有高水平的耐藥性，對其余8種抗菌藥物無耐藥性，均敏感。

集約化養(yǎng)殖場豬源菌中，無論是保育豬源菌，育肥豬源菌還是母豬源菌，對Amp、Tet和Dox都具有極高的耐藥性，耐藥率80%～100%；此外，保育豬源菌和母豬源菌對Sut也有極高的耐藥性，育肥豬源菌對其有很高的耐藥性。對其余7種藥物，保育豬源菌，育肥豬源菌和母豬源菌的耐藥性不盡相同。保育豬源菌對Spt的耐藥水平極高，對Ctx、NA和Gen耐藥水平很高，耐藥率范圍37.5%～50%；對其余3種抗菌藥物耐藥率為0。育肥豬源菌對Ctx 、和NA耐藥性很高，對Enr、Ofl、Gen和Spt耐藥高性，耐藥率范圍23.5%～41.2%；對Amc無耐藥性，均敏感。母豬源菌對Ctx、NA、Gen和Spt有很高的耐藥性，耐藥水平60%～70%；對Enr、Ofl耐藥水平高，均為30%的耐藥率；對Amc也無耐藥性，均敏感。

2.3交叉耐藥分析

不同生長期的豬源大腸埃希菌對β-內(nèi)酰胺類的氨芐西林、阿莫西林/棒酸和頭孢噻肟，氟喹諾酮類的萘啶酸、恩諾沙星和氧氟沙星，四環(huán)素類的四環(huán)素和強(qiáng)力霉素，氨基糖苷類的慶大霉素和大觀霉素交叉耐藥結(jié)果見表3。

表3　不同生長期豬源大腸埃希菌的交叉耐藥情況

集約化養(yǎng)殖場豬源菌中，100%保育豬源菌交叉耐藥菌，交叉耐1類藥菌株最多，有B1、B2、B6、B7和B8五株；交叉耐3類藥菌株為B3、B4和B5。在8株保育豬源菌中，交叉耐Tet和Dox最為嚴(yán)重，100%菌株交叉耐Tet和Dox；交叉耐Amp和Ctx和交叉耐Gen和Spt菌株比率一樣，均為37.5%菌株，均為B3、B4和B5菌株。

17株育肥豬源菌82.4%交叉耐藥，其中交叉耐1類藥菌株最多,5株分別為Y6、Y9、Y10、Y15和Y16，交叉耐2類藥菌株有Y3、Y5、 Y17和Y20；交叉耐3類藥菌株有Y1和Y8；交叉耐四類藥菌株最少，為Y11、Y12 、Y13和Y20。育肥豬源菌中，52.9%交叉耐耐Tet和Dox，菌株數(shù)最多；交叉耐喹諾酮類的菌株次之，其中23.5%菌交叉耐NA、Enr和Ofl，5.9%菌交叉耐NA和Enr； 17.6%菌株交叉耐Amp和Ctx， 11.8%交叉耐Gen和Spt，相應(yīng)菌株見表3。

90%母豬源菌交叉耐藥，其中交叉耐1類藥菌株S5、S6，交叉耐2類藥菌株有S7、S8和S10共3株，交叉耐3類的有S1、S3和S7，交叉耐4類的有S2、S11。

10株母豬源菌中，80%交叉耐Tet和Dox，50%交叉耐Gen和Spt， 70%菌株交叉耐Amp和Ctx，30%菌株交叉耐NA、Enr和Ofl。

33.3%散養(yǎng)育肥豬源菌交叉耐Tet和Dox。

2.4耐藥譜及多重耐藥性分析

41株細(xì)菌共有19種不同的耐藥模式，從耐藥譜多樣性來看，母豬分離菌最大，10株菌有7種耐藥譜；17株育肥豬源菌有耐藥譜12種；保育豬分離菌耐藥譜多樣性最小，8株菌有4種耐藥譜(表3)。

10種耐藥模式有2株及以上的菌株，同一集約養(yǎng)殖場不同生長階段的豬源大腸埃希菌有菌株具有同樣的模式，散養(yǎng)豬源大腸埃希菌和集約化養(yǎng)殖場的豬源大腸埃希菌菌株有些也具相同的模式(表4)。

按照Magiorakos A P等[6]的多重耐藥腸桿菌科細(xì)菌定義，耐3類及以上的腸桿菌為多重耐藥菌，測定的41株細(xì)菌，散養(yǎng)豬源菌的耐藥模式均非多重耐藥模式，多重耐藥菌均屬集約化養(yǎng)殖場豬源細(xì)菌，有13種耐藥模式，其中共有Amp-Tet-Sut模式，占集約化養(yǎng)殖場豬源菌82.9%(29/35)。共耐頭孢噻肟-恩諾沙星菌株有9株，母豬源菌3株、育肥豬源菌6株。

多重耐藥模式中以耐5類藥的占絕對優(yōu)勢，有8種模式,其中耐6種藥的模式有1種，耐7種藥的模式有3種，耐8種藥的模式有2種，耐9種藥的模式有1種，耐11種藥的模式有1種。

耐4類藥的菌株有4種模式，其中耐4種藥的模式有1種，耐5種藥的模式有1種，耐7種藥的模式有2種。

耐3類藥的菌株有1種模式。

集約化豬場分離菌優(yōu)勢耐藥模式為Amp-Ctx-Tet-Dox-Sut-Gen-Spt-NA-Enr-Ofl、Amp-Ctx-Tet-Dox-Sut-Gen-Spt-NA和Amp-Sut-Tet-Dox，菌株數(shù)均占檢測的集約化豬場分離菌數(shù)的14.3%(5/35)。

表4　不同生長期豬源大腸埃希菌的耐藥模式

3討論

本試驗(yàn)所測菌株均分離自一豬一樣，一樣一株菌，避免菌株來自同一克隆，因而基本代表了調(diào)查豬場豬源大腸埃希菌基本狀況。

MARI是分析某部位指定菌群如大腸埃希菌耐藥性的極佳工具。菌株暴露于常用抗菌藥物，MARI>0.2,而少用或從不用抗菌藥物，MARI<0.2[7]?；贛ARI計算結(jié)果，散養(yǎng)育肥豬源菌的MARI<0.2，說明這些豬很少用或從沒用過抗菌藥物，這與我們詢問飼養(yǎng)者的結(jié)果一致。集約化豬源菌的MARI為0.57，與Su H C等調(diào)查華南家畜糞腸桿菌的MARI值0.56結(jié)果相近[8]。

我們調(diào)查的散養(yǎng)小豬場，僅養(yǎng)殖育肥豬，實(shí)行“全進(jìn)全出”；喂養(yǎng)的飼料均為養(yǎng)殖戶自行加工，未添加任何藥物添加劑，加之所養(yǎng)豬不曾發(fā)病，未采用抗菌藥物治療，因而其大腸埃希菌不曾受到任何抗菌藥物壓力的選擇。分離的大腸埃希菌對臨床常用的5大類11種抗菌藥物的耐藥性只對使用歷史較久的抗菌藥物Amp、Tet和Dox有一定的耐藥性，而對其余8種藥物均100%敏感，這樣的結(jié)果也就不奇怪了。本試驗(yàn)中散養(yǎng)小豬場大腸埃希菌對Amp、Ctx、Gen的耐藥率與丹麥2009年、2013年屠宰場豬分離大腸埃希菌耐藥率結(jié)果相等或接近[9]，該國自1999年豬飼料中已禁用抗菌藥物作為促生長劑。

本次試驗(yàn)結(jié)果表明，該集約化養(yǎng)殖豬場大腸埃希菌的耐藥性已相當(dāng)嚴(yán)重，對檢測的11種抗菌藥物多數(shù)具有較高甚至極高的耐藥性。每株細(xì)菌至少耐一種抗菌藥物，82.9%的菌株為多重耐藥菌?？偣矙z測了5類藥物，而5重耐藥菌株的比例達(dá)51.4%。

豬源大腸埃希菌對Amp、Tet、Dox和Sut的耐藥性極高，且較其他抗菌藥物都高；與國內(nèi)近些年絕大多數(shù)的調(diào)查類似，如河南、上海和山東豬源大腸埃希菌規(guī)模化豬場大腸埃希菌對Amp、Tet和Sut具極高的耐藥性[10-13]，河南豬源大腸埃希菌對Dox耐藥率也極高[10-11]；歐盟、加拿大等國豬源大腸埃希菌耐藥性檢測表明，其對Amp、Tet、磺胺類的耐藥性雖非極高，但也較其他抗菌藥物都高。其原因與這些抗菌藥物常用有關(guān)。

國內(nèi)外對豬源大腸埃希菌耐藥性的調(diào)查報告較多，多為致仔豬黃痢、白痢或水腫的大腸埃希菌以及屠宰豬大腸埃希菌的耐藥性。對不同生長階段豬源菌耐藥性的調(diào)查不多見。目前國內(nèi)僅見有人對山東、上海和新疆不同生長階段豬源大腸埃希菌對不同抗菌藥物的耐藥性進(jìn)行調(diào)查[12，14-15]。其結(jié)果與我們不盡一致，這應(yīng)與使用的抗菌藥物不同有關(guān)。

本調(diào)查的集約化豬源菌耐藥多樣性大，35株細(xì)菌有17種耐藥譜。從有限的結(jié)果可發(fā)現(xiàn)母豬源菌和育肥豬源菌耐藥多樣性大于保育豬源菌，其原因如何，有待進(jìn)一步研究。

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Analysis of Antimicrobial Resistance ofEscherichiacoliIsolates from Different Farming Pigs in Luoyang

SUN Li-yun,LIU Zhi-jun,ZHOU Bo-wen

(CollegeofAnimalScience&Technology,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang,Henan,471003,China)

Abstract:To investigate antimicrobial resistance profiles of Escherichia coli isolated from scattered pigs and intensive farming pigs,a total of 41 feacal samples were collected from pig farms in Luoyang.35 and 6 isolates,which were rspectively isolated from intensive farming pigs and scattered pigs,were identified as Escherichia coli.Antimicrobial susceptibility tests by the disk diffusion method were conducted for ampici-llin,amoxicillin-clavulanic acid,cefotaxime,nalidixic acid,enrofloxacin,ofloxacin,compound sulfamethoxazole,tetracycline,doxycycline,gentamicin and spectinomycin.The results revealed that the resistance of isolates from intensive pigs is higher than that from scattered pigs;41 isolates showed 19 drug resistance patterns.The isolates from scattered pigs have 5 no-multidrug resistant patterns,the isolates from intensive pigs have 4 no-multidrug resistant patterns and 13 multidrug resistant patterns;33.3% isolates from sca-ttered pigs are only cross-resistant to tetracyclines,54.3%(19/35)isolates from intensive pigs are cross-resistant to β-lactams,71.4%(25/35) to tetracyclines,28.6%(10/35) to aminoglycosides and 22.9%(8/35) to quinolones.

Key words:pig; Escherichia coli ; antimicrobial resistance

文章編號:1007-5038(2016)04-0120-05

中圖分類號:S859.796

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:B

作者簡介：孫理云(1969-)， 男，河南封丘人，博士，副教授，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。

收稿日期：2015-09-21